基于培养的无可见生长评估及新鲜 Aloe vera 凝胶提取物的抗氧化谱分析

摘要

本方案描述了新鲜Aloe vera内层凝胶提取物的无菌制备、电位法pH测定、通过基于ABTS的自动化比色法评估总抗氧化能力、在特定培养条件下采用培养法进行无可检测生长的评估，以及对70:30（v/v）Aloe vera/N-乙酰-L-半胱氨酸测试混合物进行初步抗菌筛选，采用纸片扩散法和定性两倍试管稀释法。

摘要

Aloe vera （Aloe barbadensis Miller）广泛用于外用和辅助医学产品中。然而，目前仍缺乏标准化的实验室工作流程，以同时评估其总抗氧化能力（TAC）、pH 变化行为、在特定条件下基于培养的无可检测生长状态，以及初步的抗菌筛选。本研究无菌制备了新鲜的 Aloe vera 内层凝胶提取物，并配制成 5%、10%、15% 和 20%（w/v）的溶液。采用电位法测定 pH 值，通过基于 ABTS 自由基阳离子的自动化比色法测定总抗氧化能力（TAC）。基于培养的无可检测生长评估通过将提取物接种至血琼脂、伊红美蓝琼脂和沙保葡萄糖琼脂培养基上进行，随后在需氧条件下培养，并于 24 小时、48 小时和 72 小时进行肉眼观察。采用纸片扩散法和定性两倍试管稀释法，对 70:30（v/v）的 Aloe vera 与 N-乙酰-L-半胱氨酸测试混合物针对标准参考菌株进行了抗菌筛选。各组间 TAC 差异具有显著性（Kruskal-Wallis 检验，p = 0.014），其中 20% 配方的 TAC 值最高。在 72 小时观察期内，测试的培养条件下未见明显的细菌或真菌生长。Aloe vera 与 N-乙酰-L-半胱氨酸测试混合物产生的抑菌圈直径范围为 11 mm 至 17 mm，其中对 Pseudomonas aeruginosa 的抑菌圈最大。该工作流程为制备和初步表征基于新鲜 Aloe vera 的制剂提供了一种实用的实验室方法，适用于早期辅助医学研究。

引言

Aloe vera 因其在传统医学中的长期应用以及在药物、生物医学、化妆品和食品研究中的日益重要性而持续受到广泛关注^1,2,3。这种药用植物含有多种具有生物活性的成分，包括多糖、酚类化合物、蒽醌、维生素、矿物质、酶以及其他低分子量代谢物，这些成分可能与其治疗和功能特性有关^1,2,3。在这些成分中，乙酰化甘露聚糖（acemannan）因其在组织修复、免疫调节和再生医学应用中的生物材料潜力和已报道的作用而受到特别关注^4,5。同时，酚类及其他具有抗氧化活性的化合物也被认为与 Aloe vera 制剂的自由基清除、保护作用及生物学支持效应相关^2,3。

近年来，将Aloe vera融入先进配方系统和生物活性材料的研究日益受到关注。Aloe vera基水凝胶、生物材料墨水、纳米复合材料以及三维打印支架因其高保水能力、良好的生物相容性及多种生物学功能，已被广泛研究用于伤口愈合和组织支持应用^{4,6,8,9,10,11}。实验研究表明，在特定的体外、体内及配方依赖条件下，含Aloe vera的材料可通过维持湿润环境、改善制剂的理化性质，并提供抗氧化或抗菌支持，从而辅助伤口管理^{4,7,8,9,10,11}。此外，Aloe vera在食品保鲜和制剂中的应用也得到探索，其中基于凝胶的包覆层及相关体系与提高的氧化稳定性、更优的感官品质以及增强的微生物性能相关联^12,13。这些进展表明，Aloe vera正越来越被视为不仅是一种传统草本产品，更是一种具有广泛配方应用潜力的多功能天然材料^2,3,12,13。

Aloe vera 的生物学意义还延伸至抗菌及微生物学相关应用领域。近期研究报道了 Aloe vera 或含 Aloe vera 制剂对多种临床重要微生物的抑制作用，包括 Propionibacterium acnes、Enterococcus faecalis、Candida 属物种以及从伤口感染中分离出的临床菌株^14,15,16,17。早期体外实验也证实，Aloe vera 内层凝胶对 Helicobacter pylori 标准菌株及临床分离株具有抑菌活性¹⁸。此外，已有研究报道含 Aloe vera 的复合体系表现出协同的抗菌、抗氧化及促进伤口愈合能力，进一步支持了这种植物来源材料的多功能特性¹⁹。然而，Aloe vera 的生物学活性受多种方法学因素影响，包括所用植物部位、提取方法、浓度、处理条件、凝胶新鲜程度，以及待测制剂仅含内层凝胶还是包含与乳胶相关的组分^2,20。这些因素尤为重要，因为内层凝胶与外层叶片部分在化学成分和毒理学特征上均存在差异²⁰。

尽管相关文献日益增多，重要的方法学空白仍然存在。在许多已发表的研究中，抗氧化行为、理化性质、微生物学评估以及抗菌性能通常被单独评估，而非在单一整合的工作流程中进行。然而，对于以配方研发为核心的研究而言，这些参数密切相关。一种制剂可能表现出良好的抗氧化活性，但在考虑用于进一步实验开发之前，仍需进行严谨的微生物学评估和理化表征。因此，将氧化还原相关评估、pH值测定、在特定条件下基于培养的无可检测生长测试以及初步抗菌筛选相结合的实验室工作流程，可能为新鲜Aloe vera制剂的早期表征提供更实用且信息丰富的基础。

因此，本研究旨在评估不同浓度的新鲜凝胶内Aloe vera提取物制剂的pH特性、总抗氧化能力、在特定实验室条件下基于培养的无可检测生长状态，以及通过纸片扩散法和定性两倍试管稀释法进行的初步抗菌筛选。通过将这些评估整合到单一实验流程中，本研究旨在为以Aloe vera为基础的制剂在辅助医学研究中的初步表征提供一种实用的基准方法。

方案

1. 准备 芦荟（Aloe vera） 提取与稀释系列

1. 在室温下采集生长良好的芦荟植株的成熟叶片，并用流动水彻底冲洗，以去除任何残留物。
2. 在生物安全二级（BSL-2）操作柜中，使用无菌手套以70%乙醇对叶片表面进行消毒。涂抹70%乙醇后，让叶片表面在空气中完全干燥至少2分钟，再进行无菌切开。
3. 使用无菌解剖刀切除叶片的顶端和边缘，使黄色乳胶渗出物完全排出约30分钟，然后沿纵向剖开叶片。小心分离并仅收集透明的内部凝胶，避免接触外层表皮和残留的乳胶层。
4. 小心将芦荟内部凝胶转移至无菌容器中，并在约2,500 rpm（或等效的中高速涡旋设置）下间歇性涡旋振荡约5–10分钟进行均质化处理；除非特定仪器需要温度控制，否则操作过程应在室温下进行；
5. 在无菌条件下，使用无菌蒸馏水配制新鲜的Aloe vera. 内部凝胶提取物，浓度分别为5%、10%、15%和20%（w/v）；例如，将5 g凝胶加无菌蒸馏水定容至100 mL，得到5%（w/v）溶液，其余浓度依此类推进行配制。

2. pH 测定

1. 每次测量前，使用具有 NIST 可追溯性的标准 pH 4.01、7.00 和 10.01 缓冲溶液对 pH 计进行三点校准。
2. 在室温（20–25 °C）下测量每个浓度的 pH 值；每个浓度至少记录三次技术重复。

3. 总抗氧化能力（TAC）测定

1. 使用步骤1中制备的 Aloe vera. 提取物配方（5%、10%、15% 和 20%）进行总抗氧化能力（TAC）测定。
2. 分析前将所有试剂和样品恢复至室温（20–25 °C），以确保分析结果的一致性。
3. 按照制造商的标准操作程序，在开始测定前对自动生化分析仪（Rel Assay，土耳其）进行校准。
4. 根据Erel方法，将总抗氧化能力（TAC）试剂装载至分析仪的试剂仓中。
5. 使用经校准的微量移液器，将 Aloe vera. 提取物样品加入相应的样品杯或反应孔中。（样品体积：5 µL）
6. 按照制造商规定的试剂用量和孵育条件，使用分析仪预设的ABTS自由基阳离子法程序启动TAC测定。
7. 让反应自动进行，样品中存在的抗氧化剂将使有色的ABTS自由基阳离子还原，导致吸光度下降。
8. 根据TAC方法规定的波长，通过分光光度法测定吸光度的变化。（波长：660 nm）
9. 利用分析仪软件，将样品吸光度变化与Trolox当量标准曲线进行比较，计算总抗氧化能力值。
10. 以每单位体积提取物中相当于 mmol Trolox / L 的形式表示TAC结果。
11. 所有测定均需重复进行两次，以确保分析的可靠性。

基于培养法的 Aloe vera 内层凝胶无可见生长评估

1. 使用校准过的接种环（10 µL）将每种提取物各 10 µL 接种到血琼脂、伊红美蓝琼脂和沙氏葡萄糖琼脂平板上（菌落计数法）。
2. 对于基于培养的无可检测生长评估，使用校准的微量移液器无菌吸取标准化的 50 µL 等分试样，滴加至血琼脂、伊红美蓝琼脂和沙氏葡萄糖琼脂平板上，并用无菌一次性接种环（10 µL）轻轻涂布均匀（基于培养的直接滴加法重复性评估）。
3. 将血琼脂和伊红美蓝琼脂平板在 37 °C 下有氧培养，沙氏葡萄糖琼脂平板在 25–28 °C 下有氧培养，于接种后 24、48 和 72 小时肉眼观察是否有菌落生长。每种培养基同时平行放置一个未接种的平板作为阴性对照。

5. 芦荟测试混合物的抗菌活性评估

1. 在无菌条件下，通过将70%无菌芦荟内凝胶提取物与30% N-乙酰-L-半胱氨酸溶液（10% w/v，溶于无菌水）混合，制备均一的测试溶液。
   注意：该混合物可降低从叶片刮取的凝胶的高黏度，获得更流动的性状。将此复合配方视为初步筛选混合物，因此抗菌结果应解释为两种组分共同作用的活性。
2. 充分涡旋振荡均质化混合物，直至获得均匀溶液。
3. 将先前冷冻保存于-80 °C的标准菌种Enterococcus faecalis ATCC 29212、Staphylococcus aureus ATCC 29213、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853和Escherichia coli. ATCC 25922，在标准血琼脂培养基（用于革兰氏阳性菌）和标准伊红美蓝琼脂培养基（用于革兰氏阴性菌）上进行传代培养，并于37 °C孵育18–24小时。
4. 孵育结束后，根据抗菌药物敏感性试验的标准接种物制备建议³⁸，用无菌生理盐水将生长的菌落配制成0.5麦氏浊度的细菌悬液。
5. 使用无菌拭子将每种标准化的细菌悬液均匀接种于Mueller-Hinton琼脂平板上。
6. 使用校准过的微量移液器，向每个无菌的6 mm抗菌纸片上施加15 µL无菌芦荟/NAC测试混合液。所有重复实验中的纸片均采用相同的加样体积、吸收时间（至少2分钟）和空气干燥时间（约5分钟），以确保操作一致性。该体积是基于植物提取物纸片扩散筛选实验中6 mm纸片的实际负载量选定的，并在所有实验中保持恒定。
7. 使用无菌镊子将浸有提取物的纸片放置于接种后的琼脂平板表面。
8. 将平板置于37 °C有氧条件下孵育18–24小时。
9. 孵育后，使用直尺手动测量每个抑菌圈的直径（包含纸片直径），精确至最接近的毫米。本实验作为单次描述性测量进行，记录的抑菌圈直径以实际观察值报告。根据标准纸片扩散法读数建议³⁸，通过目视检查平板完成测量。
10. 在Mueller-Hinton肉汤中对70:30（v/v）芦荟/NAC测试混合液进行两倍系列稀释（1/2、1/4、1/8和1/16）。
11. 向每支试管中加入500 µL用无菌生理盐水制备的相应0.5麦氏浓度标准化细菌悬液。每种参考菌株分别制备独立的稀释系列，并在下述指定条件下孵育接种后的试管。
12. 将接种后的试管在37 °C孵育18–24小时。
13. 通过与肉汤对照比较浊度，目视评估微生物生长情况；本实验应作定性解释，而非正式的最小抑菌浓度（MIC）测定。
14. 平行使用环丙沙星纸片（5 µg）作为阳性对照，与芦荟/NAC浸渍纸片一同测试。对Enterococcus faecalis ATCC 29212、Staphylococcus aureus ATCC 29213、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853和Escherichia coli ATCC 25922均使用相同的阳性对照纸片，以确认在纸片扩散条件下菌株的敏感性。
    注意： 所有微生物操作均应在BSL-2条件下进行，并在孵育后立即记录所有抑菌圈直径和浊度观察结果，用于后续描述性分析。本方案结合了无菌制备A. vera.提取物与互补的生化及微生物检测方法，以支持用于外用和辅助医学的植物基制剂的开发。该工作流程设计适用于常规实验室：pH和氧化还原筛查（TAC）可与无菌培养以及两种常用的抗菌检测方法（纸片扩散法和试管稀释法）同步进行。

结果

不同浓度 Aloe Vera 提取物的 pH 值

pH 值随浓度变化呈现非单调模式。5%、10%、15% 和 20% 配方的平均 pH 值分别为 6.47、6.60、6.26 和 6.28。总体组间差异具有统计学意义（p = 0.024）。5% 和 10% 配方的 pH 值相对较高，而 15% 和 20% 配方的 pH 值则集中在较低水平（p < 0.05）（表 1 和 表 2）。

总抗氧化能力（TAC）

四种 A. vera 提取物浓度之间的总抗氧化能力（TAC）存在显著差异。Kruskal-Wallis 分析显示各组间 TAC 值具有统计学意义的差异（p = 0.014）。TAC 的平均值呈浓度依赖性升高，其中 5% 提取物组的值最低，20% 提取物组的值最高。事后 Dunn 检验表明，20%...

讨论

本研究提供了一种整合的实验室工作流程，通过结合pH值测定、总抗氧化能力（TAC）分析、基于培养的无可检测生长评估以及描述性抗菌筛选，对新鲜内层凝胶Aloe vera提取物制剂进行初步表征。随着新鲜内层凝胶Aloe vera浓度的增加，TAC值相应升高；在规定的实验室条件下进行短期培养监测时，未观察到可见的细菌或真菌生长。这些结果应被解读为在测试条件下存在可测量的抗氧化活性以及基于培养的无可检测生长的证据，而非证明其已达到验证的无菌状态、长期微生物稳定性或临床适用性。

抗氧化剂的研究结果与先前报道的描述一致 芦荟（Aloe vera） 凝胶作为抗氧化活性成分的天然来源，包括酚类化合物、多糖及其他氧化还原活性组分^21,23,27. Hęś 等人强调了抗氧化作用的相关性 芦荟（Aloe vera） 在食品和生物医学领域

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(-)80 °C 超低温冰箱	Thermofisher/USA	样品储存	TSX40086A
涡旋振荡器	Thermofisher/USA	样品制备	88882010
血琼脂	RTA/土耳其	培养接种	2001
伊红美蓝琼脂	RTA/土耳其	培养接种	2010
SDA 琼脂	RTA/土耳其	培养接种	2036
Müller Hinton 琼脂	RTA/土耳其	培养接种	2022
Müller Hinton 肉汤	RTA/土耳其	培养稀释	1018
移液器	Thermofisher/USA	样品制备	4642090N
Hanna pH 计	Hitachi/日本	样品分析	HI2211-02
Rel Assay 酶标仪	Rel Assay(土耳其)	样品总抗氧化能力分析	M201 (Smart Model)
总抗氧化能力试剂盒	Rel Assay(土耳其)	试剂盒	RL0017