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方法文章

采用端侧吻合技术进行颈部异位小鼠心脏移植以研究移植免疫学

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DOI：

10.3791/70704

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2026年7月3日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education; NHC Key Laboratory of Organ Transplantation; Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Division of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, 4Department of Clinical Medicine, Bengbu Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种简化的、端对侧缝合吻合技术，用于小鼠颈部心脏移植，为研究移植免疫学提供了一个稳定且可重复的模型。

摘要

小鼠异位心脏移植是移植研究中一个关键的临床前模型。小鼠颈部异位心脏移植具有显著优势，包括可直接视觉观察和触诊评估移植物存活情况、减少手术创伤以及术后恢复更快。因此，该模型已成为研究移植免疫学日益重要的平台，尤其适用于因基因修饰或药物诱导导致生理状况较差的动物，以及需要进行二次或联合器官移植的实验，此时颈部区域往往成为唯一可行的移植部位。传统的颈部移植技术，无论是采用端对端缝合还是套管法，均需永久结扎受体的颈总动脉和颈外静脉，这可能损害脑部灌注，并引入异物材料或造成血流动力学紊乱。为克服这些局限性，本文详细介绍了一种改进的颈部心脏移植技术，采用端对侧血管吻合方式。该方法保留了受体的颈总动脉和颈外静脉，维持正常的脑灌注，避免了因血管永久结扎所致的并发症。本方案详细阐述了从供体心脏获取、受体血管吻合到术后护理的各个步骤。代表性结果表明手术成功率高（96.7%），且该模型在研究同种异体移植物排斥反应方面具有良好的有效性。该技术为移植免疫学研究者提供了一个生理相关性强且技术上易于实施的实验模型。

引言

在过去半个世纪中，移植免疫学一直是免疫学家和移植专家的核心研究领域。如今，实体器官移植已得到广泛应用，是终末期器官疾病最有效的治疗方法。然而，移植物排斥反应尚未得到根本解决，仍然是移植领域的主要障碍之一，也是导致移植物丢失的主要原因1。因此，如何在减少或避免全身性免疫抑制的同时克服或减轻排斥反应，仍是该领域的重要挑战和关键研究目标。

带血管的动物器官移植模型，尤其是小鼠模型，在推动移植免疫学发展方面发挥了关键作用，并为临床转化提供了重要的科学基础2。例如，目前临床上使用的许多免疫抑制剂——如环孢素、他克莫司和雷帕霉素——最初均是在小鼠移植模型中成功验证的3,4。

小鼠异位心脏移植（HT）模型是最广泛使用的临床前模型之一，因其具有丰富的可获得遗传品系和研究试剂，且手术操作相对简便，术后监测容易，因而备受青睐。因此，该模型成为研究急性排斥反应机制、诱导免疫耐受以及在体内评估新型免疫抑制剂的关键平台in vivo5,6。

1973年，Corry等人7首次建立了小鼠异位心脏移植（HT）模型。在该模型中，供体心脏被置于受体的腹腔内，移植物的主动脉和肺动脉（PA）分别以端对侧方式吻合至受体的腹主动脉和下腔静脉（IVC）。该方法数十年来一直是腹部心脏移植的标准技术。由于在耐受性研究中需要容纳第三方同种移植物，研究人员探索了心脏移植的第二个部位，从而发展出小鼠颈部心脏移植模型。该模型具有多种优势，例如可直接视觉评估移植物存活情况、手术创伤更小以及术后感染风险更低5,8,9。1991年，Chen等人8首次描述了一种小鼠颈部异位心脏移植模型，该模型将供体主动脉和肺动脉分别以端对端手工缝合的方式吻合至受体的颈总动脉（CCA）和颈外静脉（EJV）。然而，由于供体主动脉与受体颈总动脉之间存在显著的管径不匹配，导致血管吻合极为困难，因此该模型并未得到广泛采用。

同样在1991年，Matsuura 等人9在颈部心脏移植（HT）模型中引入了一种无需缝合的套管技术用于血管吻合。该方法通过省去技术要求较高的手工血管缝合步骤，简化了手术流程，更易于掌握。此后，针对套管技术的多种技术改进相继被报道10,11。目前，套管法在颈部心脏移植中被广泛应用，尤其适用于缺乏显微血管缝合经验的研究人员。然而，套管技术引入了人工材料，可能引发局部炎症反应，干扰免疫学评估，同时在小口径血管中也存在技术挑战5,6。最近，Liao 等人12提出了一种无套管的袖状技术用于颈部心脏移植，该方法通过袖状连接直接吻合供体与受体血管。由于避免了人工材料的使用，并可适应小血管，该技术为二次心脏移植提供了一个生理性和可重复性良好的实验平台。

然而，端对端缝合技术和无缝合套袖技术均需要永久结扎受体单侧颈总动脉（CCA）和颈外静脉（EJV）。这会损害中枢神经系统单侧的脑血供，可能导致方向障碍和偏瘫等神经学并发症13,14,15。此外，这些端对端吻合方法还可能引起血流动力学改变，例如高速动脉射流，并增加血栓形成和狭窄的风险，不利于移植物的长期存活。而且，套袖技术本身由于存在套袖结构，也具有较高的血栓形成风险。

为解决这些局限性，我们采用了一种改进的端侧手动缝合技术，将供体的升主动脉和肺动脉分别与受体的颈总动脉和颈外静脉进行吻合。该方法保留了受体主要颈血管的完整性和连续性，从而维持正常的脑部灌注，并符合动物实验的“3R原则”（替代、减少与优化）。采用该技术，我们实现了约96.7%的手术成功率（30例中29例成功，仅1例因出血死亡）。术后未观察到任何受体小鼠出现与脑缺血相关的并发症。该方法与标准腹部移植模型高度相似，尤其适用于具备血管缝合经验的外科医生建立颈段异位心脏移植模型。

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方案

动物护理遵循国际指南，所有实验操作均在中国华中科技大学同济医学院同济医院器官移植研究所进行。本研究已获得同济医院动物伦理委员会的伦理批准（批准编号：TJH-202310010）。本研究所使用的关键仪器列于材料表中。

1. 术前准备

  1. 使用紫外灯对手术室进行30分钟的灭菌处理。用70%乙醇消毒手术台，并将所有手术器械在121 °C条件下高压蒸汽灭菌20分钟。
  2. 使用成年雄性C57BL/6和BALB/c小鼠（体重20–25 g，8–10周龄）。进行同系移植时，供体和受体均使用C57BL/6小鼠；进行异基因移植时，供体使用BALB/c小鼠，受体使用C57BL/6小鼠。
  3. 术前1小时，通过皮下注射给予受体小鼠布托啡诺（0.05 mg/kg）以实施术前镇痛。
    注意：供体小鼠不进行术前镇痛，因其在心脏摘取后立即实施安乐死。
  4. 配制含有氯胺酮（20 mg/mL）和赛拉嗪（2 mg/mL）的麻醉溶液。按5 μL/g体重剂量经腹腔注射进行麻醉，相当于氯胺酮100 mg/kg和赛拉嗪10 mg/kg。麻醉诱导后，在双眼涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。通过观察呼吸缓慢且规律、翻正反射消失以及足底反射缺失来确认麻醉深度。 
  5. 剃除小鼠胸腹部毛发。将小鼠仰卧位固定于加热垫上以维持体温。用聚维酮碘和70%乙醇交替消毒手术区域，共进行三个循环。用6-0丝线向上牵拉上切牙以伸展颈部，从而获得最佳术野暴露。
  6. 佩戴无菌外科手套。在无菌手术单上剪出一个略大于切口部位的椭圆形开口，然后将其覆盖于受体小鼠身上。

2. 供体心脏的获取

  1. 做正中腹部切口，随后做横向（十字形）切口，以充分暴露腹腔。
  2. 使用无菌棉签蘸取生理盐水，轻柔地将小肠向左牵拉，以暴露腹主动脉和下腔静脉（IVC）。
  3. 向IVC内注射0.3 mL肝素化生理盐水（300 IU/mL），等待1分钟以实现全身肝素化。横断腹主动脉和IVC，使供体动物放血。
  4. 用剪刀沿膈肌和前胸壁做U形切口，穿过肋骨笼，以暴露胸腔。
  5. 通过胸内IVC向心脏注射2 mL冷生理盐水（4 °C），以冲洗残留血液。
    注意：此步骤的主要目的是诱导低温并迅速使心脏停搏；次要目的是彻底冲洗心脏内的血液，尤其是冠状动脉中的血液。
  6. 用一块浸有冷生理盐水（4 °C）的无菌纱布覆盖心脏。轻柔向下牵拉该纱布可获得主动脉和肺动脉（PA）的最佳暴露视野。此外，浸有冷生理盐水的纱布可在后续解剖过程中维持移植物的低温状态。
  7. 识别并分离胸内IVC。使用6-0丝线结扎，并用显微剪刀在结扎远端将其横断。
  8. 识别并切除胸腺，以暴露主动脉弓和肺动脉（PA）。识别并分离上腔静脉。使用6-0丝线结扎，并在其结扎远端横断。
  9. 识别并分离升主动脉。在无名动脉近端横断主动脉，以最大化保留血管长度。
  10. 识别并分离肺动脉（PA）。在其分叉处近端稍远处横断。使用6-0丝线结扎心脏后方的所有血管（肺静脉）。使用显微剪刀小心切除心脏。
  11. 轻柔移动心脏，将其浸入置于冰上的冷生理盐水（4 °C）中保存，直至移植。

3. 受体操作

  1. 受体血管的分离
    1. 在颈部右侧做一长约1 cm的纵行切口，从右锁骨中点上缘延伸至下颌骨下缘。
    2. 切除右侧下颌下腺。横断右侧胸锁乳突肌，以形成足够空间用于供体心脏的植入。
    3. 识别并分离右侧颈外静脉（EJV）和右侧颈总动脉（CCA）。通过电凝其分支游离EJV。随后将CCA从周围组织中分离。解剖CCA时应避免损伤伴行的迷走神经。
  2. 动脉吻合
    1. 使用两个微血管夹同时阻断EJV和CCA，一个夹子夹闭两根血管的头端，另一个夹闭尾端。先夹闭头端，再夹闭尾端。
      注意：微血管夹建议从鼠体右侧向左侧引入，夹子手柄置于右侧。此方向有利于后续血管吻合操作，并有助于减少对气管的压迫。
    2. 将小鼠顺时针旋转90°。在CCA上做一纵行切口，切口长度应与供体升主动脉直径相匹配。用肝素化生理盐水冲洗管腔，彻底清除残留血栓。
    3. 使用11-0缝线制作吻合窗。将针穿过血管壁，穿刺点距离约为供体血管直径，轻轻提起血管壁，然后用显微剪刀剪除一小段血管壁。
    4. 将供体心脏置于颈部皮下腔隙中。在近端和远端各放置两针11-0带针缝线，将供体升主动脉固定于受体CCA上。将供体心脏置于受体右侧，并用湿无菌纱布覆盖。
    5. 利用远端缝线，从远端向近端连续缝合后壁，共6–8针。
    6. 完成后壁缝合后，将小鼠旋转180°。将供体心脏翻向受体左侧，并用湿无菌纱布覆盖。从前向后以6–8针连续缝合前壁，方向为近端至远端。在打最后一个结之前，用生理盐水冲洗管腔以排除气泡。
  3. 静脉吻合
    1. 在EJV上做一纵行切口，切口直径应与供体肺动脉（PA）相匹配。用肝素化生理盐水冲洗管腔，彻底清除残留血栓。
    2. 在近端和远端各放置两针11-0带针缝线，将供体PA固定于受体EJV上。
    3. 利用近端缝线，从近端向远端连续缝合后壁，共5–7针。
    4. 继续使用同一根缝线，从外侧向内侧、由远端向近端缝合前壁，共5–7针。在近端顶端打结。在打最后一个结之前，用生理盐水冲洗管腔以排除气泡。
  4. 再灌注
    1. 先松开远端夹子，再松开近端夹子，以启动再灌注。再灌注后，心脏移植物应立即变为红色。正常节律和收缩通常在1–2分钟内恢复。
    2. 确认止血后，小心将心脏移植物置于皮下腔隙内，确保血管无扭转。用5-0缝线缝合皮肤切口。
  5. 术后护理
    1. 将小鼠放入清洁笼中，并置于设定为34 °C的婴儿培养箱内以促进恢复。每1–2小时观察一次，直至小鼠自主苏醒，然后将其送回饲养笼。
      注意：复温是必要的，可预防低温引起的呼吸抑制，并促进麻醉后恢复。
    2. 术后48小时内，每12小时皮下注射一次布托啡诺（buprenorphine，0.05 mg/kg）以提供镇痛。
    3. 每日观察心脏移植物的搏动情况，并记录移植物存活状态。

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结果

采用该改良模型共完成了30例手术，手术成功率为96.7%（29/30）。仅1例因术中出血导致死亡。其余29例被纳入手术时间及移植物效果的分析。所有受体术后均未出现与脑缺血相关的并发症。供体心脏获取时间为6.4 ± 0.7分钟，受体手术时间为28.7 ± 1.2分钟。具体而言，血管准备、动脉吻合和静脉吻合时间分别为6.1 ± 1.4分钟、8.4 ± 1.2分钟和6.1 ± 1.0分钟（图1）。

在29例成功的移植中，16例为同系移植（C57BL/6至C57BL/6），13例为同种异体移植（BALB/c至C57BL/6）。在生存分析中，通过观察心脏移植物的搏动情况，对10例同系移植受体和10例同种异体移植受体进行每日监测。如图2所示，同系移植物能够存活超过100天，且收缩节律和强度正常。相比之下，同种异体移植物通常在移植后6–8天内被排斥。其余9例受体（6例同系移植和3例同种异体移植）被安排在术后不同时间点进行计划中的组织学评估。如

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讨论

采用端侧吻合技术的颈部异体移植模型具有多项优势。与端端缝合或套管法相比，该方法完全保留了颈总动脉（CCA）和耳后静脉（EJV）的连续性，从而维持正常的脑血流动力学，有效避免与脑缺血相关的并发症。端侧吻合还可避免因供体与受体血管直径不匹配所引起的技术困难。与腹部异体移植相比，该方法对小鼠造成的创伤更小，术后恢复更快。因此，该模型特别适用于因基因修饰或药物诱导导致生理状况较差的实验动物。此外，对于需要进行二次异体移植或联合器官移植的实验，颈部成为唯一可行的移植部位。

尽管在技术上与腹部心脏移植相似，但颈部端侧吻合面临特定的挑战。在腹部移植中，手术视野宽阔，腹主动脉与下腔静脉位置邻近；而在颈部心脏移植中，手术空间受限，且颈外静脉（EJV）与颈总动脉（CCA）不仅相距较远，还位于不同的平面上，其中CCA的位置更深。为克服这些困难，双钳阻断法可使两条血管更接近，并调整至同一平面。这一关键调整解决了供体血管长度不足及吻合过程中张力过大的问题，也使我们的方法不同于Dun等人16所报道的技术。与他们采用的外翻–内翻联合技术不同，我们使用了完全外翻的动...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81700571）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器Becton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309628
11-0 带针缝线Jinhuan Medical Products Co., Ltd.H1101用于血管吻合
3 mL注射器Becton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309657
带针的5-0缝合线Jinhuan Medical Products Co., Ltd.CR537用于皮肤缝合
6-0 丝线缝合线Jinhuan Medical Products Co., Ltd.2650182
止血电凝器宁波舜业医疗科技有限公司BDD-YE-DT-1
布托啡诺天津药物研究院 pharmaceutical Co., LtdH12020275止痛药
棉签富清健康 &和综合医疗20230R
弯头显微镊RWD life Science Co.F11031-11手术工具
弯头显微剪刀66 Vision Tech Co., Ltd.54108B手术工具
纱布块Yubei Medical Materials Co., LTD21080274
肝素钠注射液华北制药股份有限公司2101131-2
微型持针器World Precision Instruments Co., Ltd.555408NT手术器械
微型血管夹Roboz外科器械公司RS-5481T
微型血管夹施加器Roboz外科器械公司RS-5480
持针器RWD life Science Co.F31025-13腹部关闭
生理盐水浙江天瑞制药有限公司716092103
直头显微镊RWD life Science Co.F11029-11手术工具
手术显微镜LeicaM650
手术平台定制磁性
组织镊RWD life Science Co.F12002-12手术工具
组织剪瑞沃德生命科学有限公司S12003-09手术工具

参考文献

  1. Slepicka, P. F., Yazdanifar, M., Bertaina, A. Harnessing mechanisms of immune tolerance to improve outcomes in solid organ transplantation: a review. Front Immunol. , (2021).
  2. Cravedi, P., et al. Advancing mouse models for transplantation research. Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg. , (2024).
  3. McDaid, J., et al. The utility of animal models in developing immunosuppressive agents. Eur J Pharmacol. , (2015).
  4. Guo, Y., et al. Efficacy of single-agent immunosuppressive regimens in a murine model of vascularized composite allotransplantation. Transpl Int Off J Eur Soc Organ Transplant. , (2020).
  5. Alegre, M. L., et al. Best practices of heart transplantation in mice. Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg. , (2025).
  6. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. , (2013).
  7. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. , (1973).
  8. Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. , (1991).
  9. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. , (1991).
  10. Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular gland-preserving technique for heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. , (2018).
  11. Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Custom-made clamp facilitating stabilization of cuffs in murine heterotopic cervical heart transplantation. Transplantation. , (2019).
  12. Liao, M., Liu, K., Riella, L. V., Borges, T. J. Cuff-free suture-based cervical model for secondary heterotopic heart transplantation to evaluate donor-specific immune tolerance in mice. J Vis Exp JoVE. , (2026).
  13. Comi, A. M., et al. Impact of age and strain on ischemic brain injury and seizures after carotid ligation in immature mice. Int J Dev Neurosci. , (2009).
  14. Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. J Vis Exp Jove. , (2015).
  15. Struys, T., et al. In vivo evidence for long-term vascular remodeling resulting from chronic cerebral hypoperfusion in mice. J Cereb Blood Flow Metab Off J Int Soc Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
  16. Dun, H., et al. Cervical heterotopic heart transplantation in mice using a novel suture technique. JHLT Open. , (2025).
  17. Li, W., et al. Mouse heterotopic cervical cardiac transplantation utilizing vascular cuffs. J Vis Exp. , (2022).
  18. Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast Reconstr Surg. , (2014).
  19. Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2005).
  20. Gu, X., et al. Improved cuff technique for cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2007).
  21. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
  22. Li, Y., et al. A highly reproducible cervical cuff technique for rat-to-mouse heterotopic heart xenotransplantation. Xenotransplantation. , (2017).
  23. Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant Off J Middle East Soc Organ Transplant. , (2011).

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