五味Sophora flavescens肠溶胶囊缓解实验性结肠炎及铁死亡相关改变

摘要

在溃疡性结肠炎小鼠模型中，五味 苦参 肠溶胶囊减轻了结肠损伤，改善了氧化应激、炎症性细胞因子失衡、JAK2/STAT3 信号通路及铁死亡相关标志物的变化。

摘要

溃疡性结肠炎由于有效的靶向治疗选择有限，仍然难以管理，而氧化应激、炎症信号通路和调控性细胞死亡通路可能参与了黏膜损伤的发生。本研究评估了五味子 苦参 肠溶包衣孢子（FSEC）可缓解实验性结肠炎，并探讨其对氧化应激、炎症及铁死亡标志物的相关影响。采用2.5%葡聚糖硫酸钠周期性暴露联合肿瘤坏死因子α刺激建立小鼠溃疡性结肠炎模型。将小鼠分为低、中、高剂量FSEC治疗组，并以TLR4拮抗剂CRX-526作为阳性对照干预组。通过苏木精-伊红染色评估结肠组织病理学变化。检测血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽、髓过氧化物酶及铁含量²⁺水平通过生化检测进行测定。结肠组织中的细胞因子通过酶联免疫吸附试验进行定量，JAK2和STAT3的表达通过免疫组织化学法评估，GPX4、FTH1和ACSL4的表达通过蛋白质印迹法分析。FSEC处理减轻了结肠黏膜损伤和炎性细胞浸润，提高了抗氧化指标，并降低了髓过氧化物酶水平。FSEC还降低了TNF-α和IL-1α水平，部分恢复了IL-13水平，并与较弱的JAK2和STAT3免疫染色相关。同时，FSEC改善了铁死亡相关标志物的变化，包括降低的Fe²⁺ 和 ACSL4 水平降低，同时 GPX4 和 FTH1 表达升高。这些结果表明，FSEC 能够缓解小鼠实验性溃疡性结肠炎，至少部分通过改善氧化应激状态、调节炎症信号通路以及恢复铁死亡相关标志物的表达谱来实现。

引言

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性疾病，主要累及结肠和直肠黏膜，其特征是反复发作的黏膜炎症、溃疡形成以及屏障功能受损^1,2,3。尽管遗传易感性、环境因素、上皮屏障功能障碍和免疫调节异常均被认为参与了UC的发病机制，但导致黏膜持续损伤的具体机制尚未完全阐明。目前的药物治疗手段包括氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂，可在许多患者中减轻疾病活动度；然而，这些药物的临床应用可能受到停药后复发、不良反应、高昂费用以及治疗反应不完全等因素的限制³。

铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化和铁代谢紊乱，在肠道炎症及溃疡性结肠炎相关的上皮损伤中发挥的作用日益受到关注^4,5,6,7,8。与此同时，由于传统中药方剂具有多靶点治疗潜力，作为溃疡性结肠炎治疗的辅助手段正受到越来越多的关注⁹。

五味 苦参 肠溶胶囊（FSEC）在中医临床实践中用于治疗轻度至中度活动期溃疡性结肠炎（UC）。既往研究表明，FSEC可能通过多成分、多靶点机制改善UC症状。¹⁰然而，FSEC 对实验性 UC 中氧化应激、炎症信号传导、JAK2/STAT3 活性及铁死亡相关变化的作用仍缺乏充分表征。

氧化应激和炎症信号通路在溃疡性结肠炎（UC）的肠道黏膜损伤中起着重要作用。活性氧的过度产生可破坏上皮完整性，促进炎症细胞浸润，并损害抗氧化防御系统。由细胞因子介导的信号通路（如JAK2/STAT3信号通路）可加剧炎症反应并导致组织损伤^{11,12,13,14,15}。此外，氧化应激与铁死亡通过抗氧化防御系统、铁代谢及脂质过氧化的改变密切相关^{16,17,18,19,20}。因此，同时评估氧化应激指标、炎症细胞因子、JAK2/STAT3信号通路以及铁死亡相关标志物，可能有助于更全面地理解实验性UC中黏膜损伤的机制及治疗反应。

在本研究中，采用环状葡聚糖硫酸钠联合肿瘤坏死因子α攻击的小鼠模型，以评估低、中、高剂量FSEC的作用。该实验设计的关键方法学优势在于，将组织病理学评估与血清氧化应激指标、结肠组织细胞因子、JAK2/STAT3免疫组化以及铁死亡相关蛋白的Western印迹分析整合于同一实验框架内。该方法用于确定FSEC是否可缓解实验性溃疡性结肠炎，并表征氧化应激、炎症信号通路及铁死亡相关标志物谱的相应变化。整体实验设计与分析流程详见图1。

图1：小鼠模型及下游分析的实验流程图。通过在实验方案的最后1周采用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）循环处理并联合肿瘤坏死因子α（TNF-α）攻击，建立慢性实验性溃疡性结肠炎模型。小鼠被分为正常对照组、模型组、低剂量FSEC组、中剂量FSEC组、高剂量FSEC组以及CRX-526阳性对照组。FSEC以108、216或432 mg/kg体重的剂量通过灌胃给药。CRX-526作为阳性对照干预措施。在最后一次处理后，采集样本用于组织病理学评估、与氧化应激相关的生化检测、ELISA细胞因子分析、免疫组织化学以及Western印迹分析。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有动物实验均经南昌医学院动物福利与伦理委员会审查和批准（批准号：NY2SC 20250407）。所有实验均按照实验室动物护理与使用的机构指南进行。化学品、试剂和设备列于材料表中。

1. 动物与处理

本研究使用雄性C57BL/6J小鼠（野生型，8周龄）。动物饲养于标准实验室条件下，环境温度和湿度均受控，并可自由摄取食物和饮水。在适应性饲养后，通过在饮水中给予3个周期的2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导慢性结肠炎。每个周期持续1周，两个周期之间间隔2周的恢复期，期间给予正常饮水。在实验方案的最后1周，模型组和治疗组小鼠通过灌胃给予肿瘤坏死因子α（TNF-α；10 µg/100 g体重，每日两次），以进一步加重结肠损伤。正常对照组小鼠仅给予溶剂，不接触DSS或TNF-α。

五味 苦参 肠溶胶囊（FSEC）作为一种已获批准的市售中成药被使用。该制剂包含 苦参、地榆、青黛、白及 （Thunb.） Rchb.f. 和 Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC同一批次生产的胶囊内容物称重后悬浮于无菌蒸馏水中，给药前新鲜配制给药混悬液。每次灌胃前将混悬液充分混匀，以确保分散均匀。产品来源、批准文号、药品规格及质量控制信息详见材料表。产品质量依据批准的药品规格及生产商提供的信息进行描述，包括胶囊规格、外观、肠溶释放与崩解要求、微生物限度要求以及质量控制标准。

FSEC处理组小鼠在建模的最后一周内，每天两次通过灌胃给予低剂量FSEC（108 mg/kg体重）、中剂量FSEC（216 mg/kg体重）或高剂量FSEC（432 mg/kg体重）。剂量水平的选择依据为已批准的临床剂量、体表面积换算以及初步的剂量范围评估。对照组小鼠则通过灌胃给予等体积的无菌蒸馏水。

阳性对照组在建模的最后一周通过尾静脉注射给予 TLR4 拮抗剂 CRX-526，剂量为 1 mg/kg。CRX-526 用作参考的抗炎干预措施。本研究共包括六组（每组 n = 6）：正常对照组、模型组、低剂量 FSEC 组、中剂量 FSEC 组、高剂量 FSEC 组以及 CRX-526 阳性对照组。末次给药处理后 24 小时处死小鼠。处死操作在异氟烷麻醉下通过颈椎脱位法进行，符合实验室动物护理与使用的机构指南。

2. 苏木精-伊红染色法进行组织学评估

结肠组织取自肛门与回盲部区域中肉眼观察病变最明显的部位。每只小鼠取该区域的一个代表性结肠片段，用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片，并进行苏木精-伊红染色。进行组织学评估时，每只动物至少制备三个切片，每个切片检查五个不重叠的高倍视野。通过从切片一端系统性随机扫描至另一端来选择视野，避开撕裂、折叠或染色不良的区域。在光学显微镜下评估组织病理学改变，包括黏膜溃疡、腺体破坏、充血及炎性细胞浸润。

3. 氧化应激相关生化指标的测定

采集0.5 mL血液样本至含抗凝剂的试管中，于4 °C条件下以约1160 × g离心10分钟。收集上清液，按照制造商说明书及材料表中所列相应试剂盒，用于检测血清铁、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）和髓过氧化物酶（MPO）水平。

4. JAK2 和 STAT3 的免疫组织化学分析

将石蜡包埋的结肠组织切片（5 µm）置于二甲苯中脱蜡，经梯度乙醇溶液水化，再用磷酸盐缓冲液冲洗。采用微波加热法在柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中进行抗原修复。冷却至室温后，用3% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性，孵育10分钟。切片在室温下用5%正常山羊血清封闭30分钟，随后分别以1:50和1:80的稀释比例加入抗JAK2和抗STAT3的一抗，在4 °C孵育过夜。经磷酸盐缓冲液洗涤后，根据试剂盒说明书加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育。使用3,3′-二氨基联苯胺显色检测免疫反应信号，苏木精复染细胞核。切片脱水、封片后在光学显微镜下观察。

5. 采用酶联免疫吸附测定法进行细胞因子定量

将结肠组织切成2–3 mm³大小的组织块，在冰上用磷酸盐缓冲液进行匀浆处理，并于4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。收集上清液，使用相应的ELISA试剂盒按照生产商说明书检测TNF-α、IL-1α和IL-13的浓度。采用酶标仪测定吸光度值，并根据每项检测所绘制的标准曲线计算细胞因子浓度。

6. 铁死亡相关蛋白的蛋白质印迹分析

从结肠组织中提取总蛋白，并使用二辛可宁酸法测定蛋白浓度。将各样本等量蛋白通过SDS-PAGE分离后转移至膜上。用5%脱脂牛奶或等效封闭缓冲液在室温下封闭2小时后，将膜与一抗在4 °C孵育过夜，一抗包括GPX4、FTH1、ACSL4以及上样对照蛋白β-actin，抗体信息见材料表。次日，将膜洗涤后与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育2小时。使用化学发光底物显色，并通过化学发光成像系统采集图像。采用密度分析软件对蛋白条带强度进行定量。GPX4、FTH1和ACSL4的表达水平以β-actin为内参进行归一化，并计算相对蛋白表达量用于统计分析。

7. 统计分析

数据以均值 ± 标准差（SD）表示。在满足正态性和方差齐性假设的前提下，多组间比较采用单因素方差分析，随后进行 Bonferroni 事后检验。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

FSEC可减轻溃疡性结肠炎小鼠的组织病理学损伤，并改善与氧化应激相关指标
如图2所示，正常对照组小鼠结肠黏膜结构完整，腺体排列整齐，炎性细胞浸润极少。相比之下，模型组小鼠出现严重的黏膜损伤，表现为上皮破坏、黏膜溃疡、腺体结构破坏、充血以及明显的炎性细胞浸润。与模型组相比，接受高、中、低剂量FSEC治疗的小鼠组织病理学损伤减轻，表现为黏膜破坏和炎性细胞浸润程度降低。其中，高剂量和中剂量FSEC组以及CRX-526阳性对照组的组织学改善最为显著。

图2

讨论

本研究探讨了五味子对五种风味 苦参 在实验性溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型中，研究了肠溶包衣孢子（FSEC）的作用，并评估了其对氧化应激相关指标、炎症细胞因子、JAK2/STAT3信号通路及铁死亡相关标志物的影响。主要发现包括：FSEC治疗可减轻结肠组织病理学损伤，改善抗氧化相关生化指标，降低TNF-α和IL-1α水平，部分恢复IL-13水平，与较弱的JAK2和STAT3免疫染色相关，并改善铁死亡相关标志物的表达谱。综上所述，这些结果表明FSEC在实验性UC中具有保护作用，其机制与氧化应激、炎症信号通路及铁死亡相关通路的协调变化有关。

氧化应激与溃疡性结肠炎（UC）中肠黏膜损伤的发生和发展密切相关¹⁵。铁依赖性氧化损伤也参与了肠道炎症过程，铁的可利用性改变可能促进黏膜氧化应激及组织损伤^21,22,23。过量的活性氧可损伤上皮细胞，破坏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物试剂盒	ZSGB-BIO	ZLI-9018	用于基于辣根过氧化物酶（HRP）的免疫组织化学染色的显色底物。
ACSL4 抗体（F-4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	用于 Western 印迹的小鼠单克隆一抗；使用稀释比为 1:500；RRID: AB_10842002。
抗原修复液，柠檬酸缓冲液，pH 6.0	碧云天生物技术	P0081	用于石蜡切片免疫组织化学的热诱导表位修复缓冲液。
BCA 蛋白定量试剂盒	碧云天生物技术	P0012	Western 印迹前的蛋白浓度测定。
C57BL/6J 小鼠	福建安必瑞生物科技有限公司	N/A	雄性 SPF 级小鼠，8 周龄；动物来源与提交的伦理审批材料一致。
过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A007-1-1	用于血清 CAT 活性测定的比色法试剂盒。
ChemiDoc XRS+ 成像系统	Bio-Rad Laboratories	1708265	用于 Western 印迹检测的化学发光成像系统。
CRX-526	TargetMol	T27090	TLR4 拮抗剂，作为阳性对照干预药物使用；CAS 号：245515-64-4。
葡聚糖硫酸钠盐（DSS），结肠炎级	MP Biomedicals	160110	DSS，结肠炎级，分子量 36,000–50,000 Da；在饮水中使用浓度为 2.5%。
ECL 化学发光底物	Bio-Rad Laboratories	1705061	用于基于 HRP 的 Western 印迹信号检测的 Clarity Western ECL 底物。
ELISA 试剂盒，小鼠 IL-13	Abcam	ab219634	用于小鼠 IL-13 定量的比色夹心 ELISA 试剂盒；在 450 nm 处读数。
ELISA 试剂盒，小鼠 IL-1α	Abcam	ab199076	用于小鼠 IL-1α 定量的比色夹心 ELISA 试剂盒；在 450 nm 处读数。
ELISA 试剂盒，小鼠 TNF-α	Abcam	ab208348	用于小鼠 TNF-α 定量的比色夹心 ELISA 试剂盒；在 450 nm 处读数。
乙醇，纯级	国药集团化学试剂有限公司	10009218	用于组织处理、脱水及试剂配制。
亚铁离子（Fe2+）检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A039-2-1	用于血清或组织样本中 Fe2+ 测定的比色法试剂盒。
五味苦参肠溶胶囊	北京中惠药业有限公司	NMPA 批准文号：Z20150002	中成药；每粒 0.4 g；处方成分包括苦参 Aiton、地榆 L.、青黛、白及 (Thunb.) Rchb.f. 和甘草 Fisch. ex DC.；药品标准编号 YBZ00152015
谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A006-2-1	用于血清 GSH 测定的还原型谷胱甘肽检测试剂盒。
GPX4 抗体（E-12）	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	用于 Western 印迹的小鼠单克隆一抗；使用稀释比为 1:500；RRID：供应商数据表中未列出。
苏木精-伊红染色试剂盒	Solarbio	G1120	用于石蜡包埋结肠组织切片的 H&E 染色。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	用于 Western 印迹的二抗；使用稀释比为 1:50,000；RRID: AB_631736。
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	用于 Western 印迹条带定量分析的图像分析与密度测定软件。
免疫组织化学检测试剂盒	ZSGB-BIO	PV-9000	用于石蜡切片免疫组织化学的聚合物型 HRP 检测试剂盒。
JAK2 抗体（D2E12）	Cell Signaling Technology	3230	用于石蜡切片 JAK2 免疫组织化学的小兔单克隆一抗；RRID: AB_2128522。
酶标仪	BioTek Instruments	Synergy H1	用于 ELISA 在 450 nm 处吸光度测定的微孔板读板仪。
髓过氧化物酶（MPO）活性检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A044-1-1	用于血清 MPO 活性测定的比色法试剂盒。
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma-Aldrich	HT501128	石蜡包埋前结肠组织的固定液。
正常山羊血清	Solarbio	SL038	免疫组织化学封闭试剂。
石蜡	Leica Biosystems	39601006	结肠组织处理的包埋介质。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Solarbio	P1020	用于组织匀浆、洗涤及免疫染色操作的缓冲液。
PVDF 膜	MilliporeSigma	IPVH00010	用于 Western 印迹的蛋白转印膜。
重组小鼠 TNF-α 蛋白	R&D Systems	410-MT	用于最后一周炎症刺激的重组小鼠 TNF-α 蛋白。
SDS-PAGE 及转膜系统	Bio-Rad Laboratories	1658004	Mini-PROTEAN Tetra 系统，用于 SDS-PAGE 和 Western 印迹转膜流程。
SPSS Statistics 软件	IBM	版本 24.0	用于单因素方差分析及 Bonferroni 事后检验的统计分析软件。
STAT3 抗体（124H6）	Cell Signaling Technology	9139	用于 STAT3 免疫组织化学的小鼠单克隆一抗；RRID: AB_331757。
超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A001-3-2	采用 WST-1 方法测定血清 SOD 活性的试剂盒。
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司	10023418	用于石蜡切片脱蜡的试剂。
β-actin 抗体（C4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	用于 Western 印迹的上样对照小鼠单克隆抗体；使用稀释比为 1:1,000；RRID: AB_626632。