由新鲜胰腺组织生成骨髓间充质干细胞来源的类胰岛类器官结构

摘要

本文介绍一种利用猪胰腺组织裂解物将骨髓间充质干细胞（BMSCs）诱导分化为胰岛类器官样结构的实验方案。该方法在22天后可形成类器官样结构，是一种简单且成本较低的技术，所生成的结构在形态上与胰岛相似，适用于体外研究和药物筛选。

摘要

糖尿病（DM）是一种在全球范围内普遍存在的慢性疾病，其特征是体内葡萄糖代谢失衡。在1型糖尿病（T1DM）中，自身免疫反应完全破坏胰腺β细胞，导致胰岛素绝对缺乏，患者需要终身接受外源性胰岛素治疗。本研究旨在建立一种可靠且经济的培养平台，利用骨髓间充质干细胞（BMSCs）生成类似胰岛类器官的结构。该平台不仅有助于缓解移植治疗中供体胰岛短缺的问题，还可作为糖尿病相关研究的体外模型。

通过优化猪胰腺组织裂解液的制备过程（在4 °C条件下以12,000 rpm离心30分钟，随后经0.22 µm滤膜过滤以实现灭菌），成功诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为胰岛类器官样结构。形态学验证表明，仅诱导后的BMSCs形成了致密、饱满且高度透明的类胰岛样聚集体，而未诱导的BMSCs则表现出明显的空泡化且透明度降低。

动态监测显示，细胞 聚集体（直径50–100 µm）在培养第16天形成，并于第22天发育为类囊状结构（直径200–300 µm）。该方法操作简便、成本低廉，且无需复杂设备。所获得的类器官在形态上与胰岛相似，可为体外研究及相关药物筛选提供工具。

引言

作为三维（3D）体外模型系统，胰岛类器官样结构因其能够高度模拟天然胰岛的多细胞组成和空间结构，已成为糖尿病研究和再生医学中的关键工具¹。此类模型不仅为研究胰岛发育生物学和糖尿病的病理机制提供了独特平台^2,3，还有助于细胞替代疗法和药物筛选系统的开发⁴。随着全球糖尿病患病率持续上升——尤其是1型糖尿病中因β细胞不可逆损伤导致的绝对胰岛素缺乏——传统的胰岛素替代疗法虽可控制症状，却无法治愈疾病。与此同时，胰岛移植面临供体严重短缺的问题，因此开发可规模化生产的替代性胰岛来源已成为当务之急^1,5。通过利用多能干细胞或成体干细胞的定向分化潜能，胰岛类器官样技术有望克服这一局限^6,7,8。

近年来，基于人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）的胰岛类器官样培养体系取得了显著进展⁹。多项研究证实，通过优化诱导方案和培养条件，干细胞可分化为具有葡萄糖响应性胰岛素分泌功能的类胰岛细胞¹⁰。化学重编程技术的突破使得无需基因操作即可获得hiPSCs，提高了其转化应用潜力¹¹。在培养体系方面，三维培养结合特定的细胞外基质和生长因子组合可促进胰岛前体细胞自组织形成由α、β和δ细胞构成的类器官结构¹²。然而，现有技术仍面临诸多挑战，包括分化效率不稳定、功能成熟度不足，以及缺乏血管网络和免疫微环境——这些是限制其更广泛应用的关键制约因素¹³。

尽管胰岛类器官样结构的研究已取得进展，但该领域仍存在若干亟待解决的关键科学问题¹⁴。首先，由于缺乏标准化的类器官定义和构建流程，不同实验室之间的研究结果难以直接比较¹⁵。其次，现有的培养体系尚无法完全模拟天然胰岛复杂的细胞组成和精确的空间排列结构¹⁶。第三，类器官在长期培养过程中的功能稳定性以及移植后的存活情况等核心问题仍未得到充分表征¹⁷。此外，大多数现有方案仍依赖于动物来源的基质材料，这类材料成分不明确且批次间差异较大，严重阻碍了临床应用中的质量控制¹⁸。这些知识和技术上的空白显著限制了胰岛类器官样结构从基础研究向临床实践的转化。

本方案旨在建立一种稳定、经济且可重复的方法，利用骨髓间充质干细胞（BMSCs）生成类似胰岛类器官的结构。该方法适用于实验室实验研究及临床前药物筛选。目前BMSC诱导分化为胰岛细胞的策略存在多种局限性，包括成本过高、操作标准不统一以及应用范围有限等问题。大多数现有诱导体系依赖昂贵的重组细胞因子、专用培养基质和高精度培养设备，严重限制了其广泛应用。为克服这些缺点，本方案采用猪胰腺组织裂解液作为核心诱导因子。这种经过优化和简化的培养策略仅需常规实验室设备和条件，即可高效地将BMSCs诱导分化为类似胰岛的结构。

与依赖人类胚胎干细胞（hESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）或高成本生长因子混合物的传统方法相比，本策略具有多项显著的实用优势。该方法无需昂贵的试剂和复杂的培养体系，降低了实验成本，并且能够实现稳定的结果，批次间变异极小^10,11,12,13。与异种来源基质依赖的系统不同，本方案采用简化的组织裂解物，提高了实验的可控性和在不同实验室之间的可重复性^15,16,17,18。此外，骨髓间充质干细胞（BMSCs）易于获取，在培养中稳定性高，且不存在与多能干细胞相关的伦理限制，因此该方法特别适用于常规实验室应用。

目前，胰腺类器官建模领域的研究方法呈现两极分化：用于临床转化的先进类器官平台成本高昂且技术复杂，而简化的替代模型则无法支持深入的功能分析。本研究提出的方案通过提供一种标准化的中等技术水平策略，填补了这一研究空白。该方法保留了胰岛的核心生理特性，并完全兼容常规 基础实验室条件，可为专注于胰岛发育机制、糖尿病疾病建模及药物候选物初步评估的研究人员提供实用工具，尤其适用于具备常规细胞培养设施但缺乏专业干细胞培养平台的研究团队。尽管该方法无法生成完全血管化或具备免疫功能的类器官以满足特定高级研究需求，但在胰岛生物学研究中的初步实验筛选、机制探索及学术培训方面具有良好的适用性。

本研究致力于构建一种经济且标准化的胰岛类器官样结构培养体系，旨在为糖尿病相关研究提供可靠的三维研究模型。通过系统分析不同诱导方案和培养环境对类器官形成效率及形态特征的影响，本研究试图突破该领域发展中的主要技术瓶颈。核心研究目标涵盖三个方面：建立适用于无复杂仪器的普通基础实验室的通用培养方案，制定用于评估类器官质量的定量评价标准，以及优化培养策略以维持类器官在长期孵育过程中的形态和功能稳定性 。本研究结果可为体外实验探索提供坚实的技术支持，同时为胰岛发育机制研究及降糖药物筛选构建实用且可靠的模型。

方案

所有实验操作均遵循广西医科大学伦理委员会批准的实验动物福利指南（批准号：SYXK 2014-0003），并符合国际医学科学组织理事会（CIOMS）制定的《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》中规定的动物护理和使用的伦理规范。

所有涉及组织处理和试剂制备的操作均须在II级生物安全柜中进行，以防止污染。完成新鲜组织处理及胰岛类器官样结构诱导剂的制备至少需要8小时。实验过程中所有样品和试剂均需置于冰上保存。

1. 实验准备

1. 通过颈椎脱位法处死7日龄的Sprague Dawley（SD） suckling大鼠。以20 mg/kg剂量经静脉注射戊巴比妥钠对家猪实施麻醉，并通过足底退缩反射消失及呼吸频率稳定来确认麻醉效果充分。
2. 在II级生物安全柜中无菌条件下处理猪胰腺组织。采集后24小时内处理新鲜猪胰腺组织。将采集的组织样本保存在4 °C的完全DMEM培养基中（如表1所示），直至进行后续处理。
3. 预先将冷藏离心机设定为4 °C，并选择低速离心模式，以避免损伤细胞制备物。将1000 µL移液器吸头、200 µL移液器吸头和50 mL离心管存放于−20 °C冰箱中，待实验使用。准备足量的0.22 µm无菌滤器和20 mL一次性无菌注射器。通过高温高压灭菌（121 °C，20分钟）对眼科剪刀、弯镊、玻璃培养皿和安瓿瓶进行灭菌处理。
4. 在实验使用前，对完全制备好的胰腺组织裂解液进行分装。为获得最佳实验重复性，使用移液器将100 μL匀浆液分装至各个1.5 mL微量离心管中，分别储存以供后续使用。

2. 处理新鲜胰腺组织以制备胰岛类器官样结构诱导剂

1. 采集新鲜的猪胰腺组织样本，并立即置于干冰上以维持组织的生物活性。获取的组织首先通过移液反复用无菌生理盐水冲洗。完成初步清洗后，使用 3 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）进行进一步彻底洗涤，以完全去除残留的血渍和组织污染物。
2. 移除并丢弃无菌培养皿中的残余液体，然后向培养皿中加入 2 mL DMEM 培养基。将预处理后的胰腺组织用无菌眼科剪剪切成大小均一的 1 mm³ 组织块 （图 1A、B）。将所有剪碎的组织块收集至一个 50 mL 离心管中，随后轻柔地上下吹打 10 次，以实现均匀混合。
3. 使用无菌玻璃匀浆器进行组织匀浆 （图 1C）。在研磨过程中，胰腺组织碎片与 DMEM 培养基按 1:1 的体积比均匀混合。将完全匀浆后的组织悬液转移至 50 mL 离心管中，并在 4 °C 条件下以 21,600 × g 高速冷冻离心 30 分钟。
4. 离心后，用无菌移液器缓慢吸取澄清的上清液。收集的上清液随后通过 0.22 μm 无菌滤膜过滤，以去除微小的组织碎片和未溶解的杂质 （图 1D）。最终将纯化的液体分装至 1.5 mL 微量离心管中，每管固定体积为 100 μL，密封保存用于后续实验（图 1E）。
5. 将分装好的胰岛类器官样结构诱导剂储存于 −20 °C。
   注意：在适当储存条件下，该诱导剂可保持稳定长达 1 年。通过肉眼观察和功能诱导实验评估所制备裂解液的诱导活性。活性裂解液表现为澄清、淡粉色且无明显沉淀；若出现可见沉淀或无法诱导典型的胰岛类器官形成，则表明其活性已丧失。

3. 诱导培养基的制备

1. 在进行细胞培养操作前，新鲜配制诱导培养基。按照下表所列比例，将自制的胰岛类器官诱导剂与含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基（FBS-H-DMEM）严格混合。 表1.
2. 放置 在37 °C、5% CO₂饱和的细胞培养箱中持续培养胰腺类器官样本。

4. 类器官的形态学观察与生长监测

1. 在细胞接种后的第1天、第3天、第7天、第10天和第15天等预定时间点，于整个培养期间进行显微观察。
2. 每次检测时均采用光学显微镜追踪胰腺类器官结构的形态变化、生长状况及细胞活力，以记录这些结构的动态生长特征。

5. 类器官的传代与冻存

1. 以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度将第 3 代 BMSCs 接种于 6 孔培养板中，在完全培养基中培养过夜，使细胞贴壁，然后进行诱导。
2. 向培养体系中加入 1 mL 含 0.02% EDTA 的胰蛋白酶溶液，轻轻吹打培养皿表面 5–8 次，使胰腺类器官从皿壁脱落。
3. 加入 2 mL 含 10% H-DMEM-F12 培养基以终止胰蛋白酶消化。将混合液在 4 °C 条件下，以 1,500 × g 离心 5 分钟（使用冷冻离心机）。离心后吸除并弃去上清液。
4. 向细胞沉淀中加入初始体积两倍的新鲜 10% FBS-H-DMEM 培养基，以实现 1:2 的传代比例。
5. 按以下步骤对类器官培养物进行冷冻保存：将获得的细胞沉淀重悬于 1 mL 无血清冷冻保存液中。短期保存（最长 1 年）可置于 −80 °C 保存，长期储存则应置于液氮中。
   注意：可通过调整新鲜培养基的体积来实现不同的传代比例。例如，若进行 1:1 传代，则使用与初始体积相同的培养基；若进行 1:3 传代，则加入初始体积 3 倍的培养基。

结果

记录胰岛类器官样培养物在培养期间的生长动态至关重要，尤其是在培养的最初几周内，这有助于预测该培养系统在后续实验中的表现。 图2展示了一个为期22天的培养示例，其中从7日龄 suckling 大鼠的骨髓中高效分离出骨髓间充质干细胞（BMSCs），并成功用于生成胰岛类器官样结构。BMSCs的身份通过三系分化能力及表面标志物表达（CD29⁺、CD90⁺、CD34⁻、CD45⁻）得以确认（补充图S1）。新形成的类器官表型多样，从分散的球形类器官到类似球体或聚集体的结构均有出现，此类表型差异取决于胰岛类器官样结构的发育阶段。尽管胰岛类器官样结构在生长过程中形态变化迅速且多样，但基于大量诱导与培养观察，可将其生长与发育模式归纳为几个阶段：从分散细胞快速扩增形成细胞簇（图2A），到细胞排列更加紧密并呈现包被趋势（图2B）...

讨论

糖尿病是一种全球性的代谢紊乱疾病，主要分为1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T1DM）。T1DM是一种自身免疫性疾病，其特征是胰腺β细胞受到选择性破坏，导致绝对性胰岛素缺乏¹⁹。患者需要终身接受外源性胰岛素治疗，但仍面临严重低血糖和微血管并发症的风险²⁰。目前，唯一能够恢复内源性胰岛素分泌的治疗方法是胰岛移植⁶，但供体短缺和免疫排斥反应限制了其临床应用²¹。因此，开发替代性胰岛来源和新型治疗策略已成为糖尿病研究的重要方向。近年来，干细胞技术和类器官培养的快速发展为糖尿病治疗带来了新的希望¹⁴；特别是能够模拟天然胰岛结构的三维胰岛类器官样结构，为解决供体短缺和免疫相容性问题提供了潜在途径¹。

本研究建立了一种标准化的胰岛类器官样培养方案，利用骨髓间充质干细胞（BMSCs）和猪胰腺组织裂解液诱导生成胰...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 无菌滤器	Merck Millipore	SLGP033RB	胰腺组织裂解液的无菌过滤，以去除杂质和碎片
0.25% 胰蛋白酶（含 0.02% EDTA）	Wisent	325-043-CL	用于胰岛类器官传代操作的温和解离
1.5 mL 微量离心管	Corning Axygen	AXY-20-1500	胰腺组织裂解液的分装与储存（每管 100 μL）
10 μL 移液器吸头	Eppendorf	22491653	抗体及小体积酶溶液的液体转移
1000 μL 移液器吸头	Eppendorf	22491651	试剂和细胞悬液的液体转移
-20°C 冰箱	Haier	HYC-326	试剂（如 FBS、胰蛋白酶）和移液器吸头的储存
200 μL 移液器吸头	Eppendorf	22491652	小体积试剂的精确液体转移（如裂解液分装）
10 μL 移液器吸头	Haier	DW-86L626	胰腺组织裂解液和冷冻保存类器官的长期储存
50 mL 离心管	Corning	430829	胰腺组织裂解液和细胞悬液的高速低温离心
6 孔培养板	Corning	3516	胰岛类器官和骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养
II 级生物安全柜	Haier	HR40-IIA2	猪胰腺组织的无菌处理及类器官培养操作
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	3111	在 37°C、5% CO2 环境下培养胰岛类器官
弯镊	上海华启医疗器械有限公司	HQ-1302	组织处理过程中操作胰腺组织，经高温灭菌
DMEM 培养基（高糖）	Wisent	318-025-CL	用于胰岛类器官诱导培养
DMEM 培养基（低糖）	Wisent	319-015-CL	BMSC 培养和组织处理的基础培养基
胎牛血清（FBS）	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10099141C	以 10% 体积比加入 DMEM 中，用于细胞培养及消化终止
H-DMEM-F12 培养基	Wisent	315-080-CL	用于类器官传代过程中终止胰蛋白酶消化
高温高压灭菌器	Haier	GR80DA	器械灭菌（121°C，20 分钟）及玻璃器皿灭菌
光学显微镜	Olympus	CX43	在不同放大倍数（×4、×10、×20）下观察和成像胰岛类器官
眼科剪	上海华启医疗器械有限公司	HQ-1201	将猪胰腺组织剪切成 1 mm³ 的碎片，经高温高压灭菌
青霉素-链霉素溶液	Thermo Fisher Scientific	15140122	以 1% 体积比使用，防止培养基中细菌污染
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010023	用于猪胰腺组织洗涤及细胞冲洗的缓冲液
冷冻离心机	Eppendorf	5810R	在 4°C 下高速离心，用于胰腺裂解液制备和细胞沉淀收集
无血清冷冻保存液	苏州新赛美生物科技有限公司	#C40050	用于胰岛类器官的冷冻保存，在 -80°C 储存前重悬细胞沉淀