一套标准化代谢组学方案，用于通过液相色谱质谱分析精英拳击手运动引起的代谢变化

摘要

该方案描述了基于液相色谱结合四极飞行时间串联质谱（LC-QTOF-MS/MS）及多元数据分析的标准化血清代谢组学工作流程，用于分析精英雄性拳击手急性及短期恢复相关代谢变化。

摘要

精英拳击会引发快速代谢变化，而这些变化往往无法被传统生理测量完全捕捉。基于液相色谱-四极飞行时间串联质谱（LC-QTOF-MS/MS）的标准化无靶向血清代谢组学工作流程应用于七名精英男拳击手在对练前、对练后及对练后24小时采集的样本。工作流程包括标准化样本采集、合并质量控制监测、代谢物分析、多变量统计分析和通路解释。急性对刺与糖酵解和糖新生相关的代谢物变化相关，而24小时的时间点则与硫代谢相关。

磷脂酰肌醇PI（16：0/18：2（9Z，12Z））对刺后立即状态表现出强烈的辨别能力，硫代硫酸盐与24小时恢复状态相关。这些发现支持使用该工作流程，对这批七名精英男性拳击手进行运动相关代谢变化的可重复性剖析。该方案旨在针对急性运动和短期恢复的受控小队列研究，强调可重复的样本处理、合并的质量控制监测以及可解释的下游分析。

引言

精英拳击以三回合、每回合2分钟的高强度对练为特征，依靠无氧和有氧代谢的结合，触发能量基质、氧化应激介质和组织修复相关代谢物的快速变化。传统评估（血乳酸和心率）只能捕捉孤立的生理终点，未能解决涵盖“对练前基线→急性压力→24小时恢复”的系统性、相互关联的代谢变化。

非靶向代谢组学通过液相色谱-四极飞行时间串联质谱法，通过全面分析生物样本中的小分子代谢物来解决这一局限。它通常检测数千个代谢峰，并通过与精心策划的数据库^1、2、3进行注释，注释数百到数千个代谢物。这种方法能够揭示传统方法忽略的细微代谢动态，但现有以拳击为中心的代谢组学研究缺乏标准化：它们常常省略受控对练方案、严格的质量控制（QC）步骤或长期恢复时间点，导致结果难以复现，且在训练或恢复策略中的转化有限 ^4,5。

基于液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱的标准化代谢组工作流程，针对精英拳击手进行了优化，旨在捕捉急性运动反应和延迟恢复。该方案包含三个关键时间点（对练前[T0]、对打后立即[T1]、对打后24小时[T2]），以区分短暂性应激与持续适应^6,7,8。关键技术特征包括：（1）受控对练（最大心率80–85%）以确保运动强度^7,9;（2）高分辨率LC-QTOF用于低丰度血清代谢物的灵敏检测^2,3,10;（3）多元和单变量分析，包括主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和两两统计检验，以识别运动响应代谢产物^6,8,11;以及（4）单一混合血清QC样本（等量混合研究样本），多次注射以评估仪器对信号漂移的^稳定性。

该方案可适用于其他高强度、短时间运动（如短跑和摔跤），但此类可转移性需在特定运动队列中验证。本研究为识别精英男拳击手压力和恢复的代谢标志提供了初步框架。该工作流程最适合使用血清基非靶向代谢组学，对小型、特征明确的运动队列进行急性运动和短期恢复的受控研究。它可能不适合直接推广到其他运动、女性运动员、更大异质群体或缺乏额外验证的长期适应研究。

该研究旨在描述精英拳击对练引起的血清代谢变化，并区分急性对抗后反应与24小时恢复相关变化。假设急性对打主要影响能量代谢，而24小时恢复则与氧化还原平衡和组织修复相关的代谢物相关。整体工作流程如 图1所示。

方案

所有程序均依首都体育大学人类研究机构伦理委员会批准（批准号2025A005）完成。

注意：所有人体血液样本应视为潜在传染性。戴手套、实验服和护目镜。按照机构生物安全程序执行静脉血液采集、血清处理和废物处理。样品处理后对工作表面进行净化。

注意：甲醇、乙腈和甲酸都是有害化学品。在认证的化学熏风罩中处理溶剂的制备、提取和重组步骤。避免皮肤接触和吸入。收集溶剂废弃物，使用认证容器。

1. 研究参与者招募与准备

1. 招募七名年龄在20至28岁的精英男拳击手，参加60至75公斤级别的比赛。
2. 确认每位参与者至少有5年的专业培训经验，且无代谢疾病史。
3. 排除过去6个月内肌肉骨骼损伤的参与者。
4. 指示参与者在测试前3天遵循包含55%碳水化合物、25%蛋白质和20%脂肪的标准化饮食。
5. 指示参与者在检测前48小时内避免在最大心率60%或以上进行剧烈运动。
6. 指示参与者在采血前禁食12小时。禁食期间允许饮水。
7. 在对练前一周通过分级运动测试确定最大心率。
8. 每3分钟将跑步机速度提高1公里/小时，直到精疲力竭。用测量到的最大心率来定义对练的靶心强度。

2. 对练协议与血清样本采集

1. 准备一个标准的6×6米拳击擂台、16盎司手套和胸带心率监测仪。
2. 进行标准化的10分钟热身，包括5分钟8公里/小时慢跑、3分钟动态拉伸和2分钟影子拳击。
3. 执行对练协议如下。
   1. 进行三轮对练，每轮2分钟。
   2. 按体重级别和技术水平对战对手。
   3. 每轮间留出1分钟的休息间隔。
   4. 在整个疗程中每30秒监测一次心率。
   5. 调整对练强度，以保持心率在MHR的80%–85%。
   6. 如果心率超过心率的90%，暂停对练。只有在心率恢复到目标范围后，才能恢复实战实战。
4. 在以下三个时间点采集血清样本。
   1. 在T0预热30分钟后，使用一根8毫升血清分离管（SST）从肘前静脉采集5毫升静脉血。
   2. 在T1最后一轮检查后5分钟内，使用新的SST采集5毫升静脉血。
   3. 使用新的SST在T0值时段采集5毫升静脉血以检测T2。确保参与者遵守与T0相同的禁食和活动限制。
5. 血液样本处理过程如下。
   1. 收集后1小时内，每个SST以11000 克 离心，4°C离心15分钟×
   2. 将2–3毫升上层血清转移到1.5毫升的低温溶液中。
   3. 将冷冻瓶立即存放在-80°C。
   4. 每个样品的冻融循环不超过两次。
6. 准备一个混合的质检样本。
   1. 在合并质控制备前，将所有21个研究血清样本（来自七名参与者的T0、T1和T2）冰上解冻。
   2. 将每个研究样本中的等量分量转移到一个1.5毫升的管子中。
   3. 从每个样品转移20微升，获得最终420微升的混合量子液容量。
   4. 漩涡循环10秒的质量控制样本。
   5. 在LC-QTOF-MS分析过程中，利用合并的QC样品进行重复注射，以监测仪器稳定性和信号漂移。

3. 从血清样本中提取代谢物

1. 从-80°C下取出冷冻血清样本（T0、T1、T2和QC）。 将样品冰封30分钟，然后将每个样品浸泡10秒。
2. 将100微升血清移液管移入1.5毫升低蛋白结合微离心管。加入500微升冰冷萃取溶剂，含甲醇：乙腈（1：1，v/v）。漩涡持续30秒。
   1. 拔出时不要添加内部标准。在最终工作流程中，不要应用基于内部标准的提取修正或下游归一化。
3. 在4°C的冰水浴中对管进行超声波处理，持续10分钟，功率为300瓦，频率为40kHz。在-20°C下培养管1小时以沉淀蛋白质。
4. 在13200克×离心管，4°C下离心 20分钟。 将约450微升上清液转移到新的微离心管，并将沉淀作为有害生物废弃物丢弃。
5. 在真空浓缩器中，37°C、-0.09 MPa干燥上清液45分钟，直到完全干燥。
6. 将干燥提取物用100微升乙腈水（1：1，v/v）重组。漩涡持续30秒。
   注：使用乙腈：水（1：1，v/v）是因为它兼容本工作流程中使用的反相色谱柱，且在初步测试中不会产生可见沉淀。
7. 在13200 克 下离心，复原溶液在4°C下×15分钟。 将约90微升上清液转移到装有200微升插入件的LC-MS玻璃瓶中，并密封瓶体。

4. 液相色谱-质谱检测

1. 在液相色谱系统中安装一个适合血清代谢组学的反相色谱柱（见材料表）。将柱式烤箱设置为40°C。
2. 在超纯水中制备流动相A，形式为0.1%（v/v）的甲酸。将流动相B制成0.1%（v/v）甲酸，含乙腈。
3. 将两个流动相都过滤在0.22微米的膜上。
4. 将流量设置为400微升/分钟，注入体积为5微升。
5. 施加以下梯度：0.0–0.5分钟，95%A和5%B;0.5–5.5分钟，线性梯度为50% A和50% B;5.5–9.0分钟，线性梯度为5% A和95% B;9.0–10.5分钟，5%A和95%B;10.5–12.0分钟，恢复到95%A和5%B并重新平衡
6. 将液相色谱系统与配备电喷雾电离源的高分辨率质谱仪耦合。
7. 分别在正离子和负离子模式下获取数据。
8. 在正离子模式下，将毛细管电压设为2500伏，锥体电压设为30伏。
9. 在负离子模式下，毛细管电压设为-2000伏，锥体电压设为25伏。
10. 将溶溶气温度设为500°C，溶溶气流量为800升/小时，锥体气体流量为50升/小时。
11. 采集50–1200米/z的数据，扫描时间为0.2秒。
12. 通过在0 V下使用低碰撞能量和10–40 V时高碰撞能量，获取串联质谱数据。
13. 按以下顺序运行样品：一次空白注入重组溶剂;连续三次注射合并的QC样本;所有研究样本每五个样本后，均需进行一次空白注射和一次QC注射;最后一次QC注射;以及最后一次空白注入
14. 通过合并质控相关分析和主成分分析（PCA）聚类，评估两种离子模式的数据质量和分析稳定性。
15. 将大于0.8的合并QC相关系数解释为分析序列中可接受的分析稳定性。

5. 数据预处理与统计分析

1. 将原始液相色谱-质谱文件导入数据处理软件，用于保留时间比对、去卷积、峰值比对和特征提取（见材料表）。
   1. 选择第一个池化QC注入作为比对参考。
   2. 通过选择软件的默认工作流程执行保留时间对齐、反卷积和峰值对齐。使用保留时间容忍度±0.1分钟，质量容忍度±5 ppm。
   3. 进行峰值采摘，保留超过1000个计数的特征，这些特征在至少一个组80%的样本中存在。
   4. 在任一离子模式下，都不要进行额外的预处理归一化。
   5. 导出包含m/z、保留时间和峰值面积值的处理过特征表。
   6. Log2-变换所有保留峰值强度。
   7. 将缺失值以每个特征最小正值的五分之一来补值。
   8. 在进行多元分析前，将每个特征均值居中并除以其标准差。
   9. 使用变换和缩放矩阵进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、聚类和相关分析。丰度图使用原始处理特征强度。
2. 通过将特征与公开代谢组数据库进行注释，包括人类代谢组数据库（HMDB）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）以及适用的LIPID MAPS。
   1. 根据前驱离子质量误差、同位素分布和串联质谱片段匹配来评分每个注释。每个标准最多给20分。
   2. 应用前体离子质量误差窗口100 ppm和片段离子质量误差窗口50 ppm。不要套用固定的保留时间窗口。
   3. 保留总分至少40分（满分60分）的注释。排除评分较低的注释。
3. 明确定义比较组如下：A = T0（对练前），B = T1（对练后立即），C = T2（对练后24小时）。
4. 使用统计计算软件及相关分析软件（见 材料表）进行下游统计分析。
   1. 在单位方差缩放后运行主成分分析（PCA）并可视化分数图。
   2. 构建偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，涵盖A对B、B对C、A对C。
   3. 当样本数至少为7时，使用7倍交叉验证。如果样本数小于 7，则设置折叠数等于样本数。
   4. 进行200次置换检验以评估模型效度。
   5. 通过应用以下阈值筛查差异代谢物：折叠变化（FC）≥2或FC≤0.5，预测重要性变异（VIP）≥1，t检验 P. <0.05。
   6. 生成火山图及相关统计图表，进行两对比较。
   7. 通过使用log2变换和单位方差尺度矩阵生成热图。
   8. 生成显著阈值为P ≤ 0.05的相关热图，并显示最多20种代谢物。
   9. 在k均值聚类前确定最优的聚类数量。在单位方差尺度调整后进行k均值聚类。
   10. 从原始处理特征强度生成丰度条形图。
   11. 生成维恩图以总结两两比较之间的重叠。
   12. 对选定代谢物进行受试者工作特征（ROC）分析。通过曲线下面积（AUC）评估诊断表现。
5. 通过在适当的生物信息学软件包中使用途径富集函数（见材料表）将差分代谢物映射到KEGG途径。
   1. 用 P 解释路径。<0.05。最终分析记录中未报告多重测试校正。

结果

LC-QTOF-MS/MS数据的质量控制（QC）验证

为评估信号稳定性和可重复性，分析了混合QC样品的两种离子模式重复注射。在两种离子模式下，池化QC注射的Spearman相关系数均超过0.8，表明仪器在分析序列中的稳定性。所有研究样本和QC注射的PCA显示QC注射集中紧密，无明显异常值，支持可接受的分析稳定性（见图2）。未观察到QC色散扩大或主要空白转移;无论哪种发现，都表明分析性能不理想，可能需要重新注入或批次排除。这些观测结果共同证实了分析流程在两种离子模式下都表现良好。

跨时间点的全球代谢差异

PCA显示T1与其他两个时间点明显分离，而T0和T2部分重叠（见图2）。结果表明急性对打引发的代谢转变最为明显，且24小...

讨论

该标准化工作流程在小型受控队列中，描述了精英拳击对练和短期恢复相关的代谢物变化。合并量子检测注入、基于质量控制的相关分析、主成分分析（PCA）聚类和多变量分析共同支持了可接受的分析稳定性。该方案的成功主要依赖于四个因素：将对练强度保持在最大心率的80%–85%以内，采集后1小时内处理血液样本，限制每个样本不超过两次冻融循环，以及通过重复的混合质控注射监测分析序列。在本数据集中，方法表现可接受得益于合并QC相关系数>0.8、PCA评分图中严格的QC聚类以及无显著空白转移。如果合并后的QC样本显示PCA分散度扩大，合并后的QC相关性低于0.8，或出现空白携带，应复查分析序列，并重新注入或排除受影响的样本或批次。相较于早期表述，本版本与实际的预处理工作流程和基于质量控制的合并质量评估保持一致，且未进行额外的预处理规范化。

跨时间点观察到的代谢变化与能量代谢、氧化还原平衡及恢复相关过程的变化一致。急性对抗与乳酸和硫代硫酸盐增加及PI降低相关（16：0/18：2（9Z，12Z）），而T1向T2的转变主要表现为硫代谢相关变化。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂	乙腈	默克	LC-MS级别，CAS 75-05-8
试剂	甲醇	默克	LC-MS级别，CAS 67-56-1
试剂	甲酸	TCI	LC-MS级别，CAS 64-18-6
消耗品	真空管猫血清血栓激活剂	格赖纳生物一号	8毫升血清血栓激活管
消耗品	纳尔基因低温小瓶	赛莫飞世尔科学	1.5毫升，外螺纹
消耗品	蛋白质LoBind管	埃彭多夫	猫。编号0030108442,1.5毫升
玻璃器皿	带插入件的螺旋盖玻璃瓶	安捷伦	2 mL 小瓶，含 200 和 μ;L型玻璃内衬;插入Cat。编号5183-2090
消耗品	Millex-GP滤波器	默克	猫。不。SLGP033RS，0.22 & mu;M膜
乐器	定制拳击擂台 6x6米	泰拳运动	6 & 次;6米训练场
消耗品	Pro Style 2 拳击手套	永恒	16盎司
乐器	极地H10	极地	胸带心率传感器
乐器	类星体	H/P/宇宙	电动跑步机
乐器	离心机 5425 R	埃彭多夫	冷藏微离心机
乐器	布兰索尼克 CPX2800	埃默森 / 布兰森	40 kHz 数字超声波浴
乐器	Savant SpeedVac SPD1030	赛莫飞世尔科学	集成真空浓缩器
乐器	VWR 迷你涡旋搅拌器	Avantor / VWR	猫。编号10153-688
乐器	TSX ULT 冷冻柜	赛莫飞世尔科学	模型TSX50086A
乐器	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	水域	UHPLC系统
乐器	Xevo G2-XS QTof	水域	QTOF质谱仪
乐器	ACQUITY UPLC HSS T3 柱	水域	P/N 176001132,1.8 和 mu;m， 2.1 & times;100毫米
软件	马萨萨斯猞猁	水域	版本4.2
软件	预产 QI	水域	版本 2.3
软件	R	R统计计算基金会	版本 3.6.1
软件	PRCOMP	底数R	基R函数
软件	罗普尔斯	生物导体	R 封包
软件	热点图	克兰	R 封包
软件	科普洛特	克兰	R 封包
软件	Kmeans	底数R	基R函数
软件	NbClust	克兰	R 封包
软件	文恩	克兰	R 封包
软件	MetaboAnalystR	CRAN / 夏实验室	版本 1.0
软件	pROC	克兰	版本 1.15.0
软件	clusterProfiler	生物导体	生物导体封装
数据库	人类代谢组数据库（HMDB）	HMDB	在线数据库
数据库	京都基因与基因组百科全书（KEGG）	凯格	在线数据库
数据库	脂质图谱	脂质图谱	在线数据库