一种将 Euglena gracilis 适应木薯基质以实现异养栽培的方法

摘要

本方案描述了逐步将Euglena gracilis适应木薯基底物的方法，以及随后在异养栽培条件下多种木薯产品中生长、生存能力和生物量产量的评估。

摘要

木薯加工产生的富含营养的副产物因成分变化、氰化化合物和活跃微生物群落等因素而未被充分利用。本方案提出了一种多阶段适应策略，用于建立适合木薯衍生底物异养栽培的 Euglena gracilis 谱系。该方法首先将Euglena培养物同时暴露于高压和非高压灭菌木薯培养基，以及10–30 g/L的加里浓度梯度，以评估对微生物复杂性和底物负荷的耐受性。随后，培养物会接受30–50 g/L的更高浓度梯度，以评估在更致密底物下的性能。所得谱系与未适应的野生型菌株在五种木薯产品中进行比较;用garri、干浆、颗粒、果皮和动物饲料来评估田间相关材料的生长稳定性。该方案包括利用比色试纸测量pH变化、氰化物水平，以及基于总氮定量对干燥生物量进行蛋白质分析的制备。这些方法共同提供了一个可重复的框架，用于将Euglena gracilis适应木薯衍生基质，并评估不同木薯产品的菌株性能。该方法使得开发强健的藻类谱系成为可能，用于以木薯为中心的生物加工和废弃物加价应用。

引言

木薯（Manihot esculenta）是西非地区主要的食品和工业作物，产生加工副产品如加里（garri）、干果肉、果皮^和颗粒饲料^。

木薯衍生的底物主要由可发酵碳水化合物和残留营养素组成，同时含有少量蛋白质和纤维，尽管成分会因加工条件和原料而异 ^2,3。由于其成分异质、含有氰苷以及传统加工和发酵过程中产生的多样微生物群落，这些菌群仍然未被^{充分利用。}这些特性对直接微生物培养构成挑战，限制了木薯副产物融入标准化生物加工工作流程的能力。尽管木薯衍生副产物丰富，但目前缺乏可重复且生物可持续的微生物系统培养方法，这些基质复杂且微生物活性高。能够在这种条件下可靠运行的种植系统，能够富化或解毒这样一个受欢迎的食材来源，将支持更可持续的木薯加工流程和循环资源利用。

Euglena gracilis 是Euglenozoa⁵ 中的一种单细胞鞭毛动物，以其灵活的绒毛状、动态形态和可逆囊肿能力著^称，这些能力能应对养分可用性、渗透压和化学成分的剧烈波动。其代谢适应性还使它能够合成储存多糖对米龙⁶ ，并通过有机酸代谢调节细胞pH值。这些代谢特征，尤其是副米隆的积累，可能增强能量储存和抗压能力，支持在木薯衍生基质特有的多变营养和化学条件下的生存和适应。这些性状使 E. gracilis 能够在化学变化的淡水条件下存活，使其成为异质、未精炼底质上栽培的有前景候^选植物7。

当暴露于化学复杂或微生物活性底物时，未适应的E. gracilis培养物常表现出应激反应，如囊肿增加和运动能力减弱，而适应型群体可能保持更稳定的形态和代谢活动⁸。与相关微生物群落的相互作用可能进一步影响长期暴露于复杂底物时的生理表现。这些特征凸显了在木薯^衍生物上种植E. gracilis时基于适应方法的重要性。

为应对这些挑战，该方法采用分阶段适应策略，逐步使 E. gracilis 适应木薯衍生基质。该方法通过对日益复杂的底物和微生物活性进行受控暴露，从而选择能够在异质培养条件下维持存活和生长的种群。这种设计使 E. gracilis 能够与相关的微生物群互动，并可能从中获益，并适应培养基浓度的增加。

适应后，该方案主导对多种木薯衍生产品的适应性与未适应E . gracilis 谱系进行比较评估。该比较框架允许评估生长一致性、形态稳定性和生理反应，适应过程逐步帮助 细粒E. 适应木薯副产物的养分变异、化学胁迫源和微生物活性进行适应。

该方法结合了^栽培期间 pH和氰化物水平的标准化监测，以及通过总氮定量¹¹制备收获生物质以进行下游蛋白质分析，从而实现了不同底物和菌株营养潜力的比较。这些测量支持评估木薯种植和适应过程中的代谢稳定性、底物相互作用及生物量特性，证明适应性E . gracilis 谱系能够在多种木薯副产物中强健且稳定地生长。

该方法最适合实验室或应用研究环境，需要基本微生物基础设施和本地可获得的木薯衍生底物。实际考虑因素包括需要一致处理异质培养基，利用显微镜监测培养健康状况，以及谨慎控制混合以避免培养过程中的剪切应力。

方案

该方案使用非致病原生生物和木薯衍生植物底物。按照机构生物安全和化学安全要求执行所有针对氰化植物材料的程序。

1. 木薯基培养基的制备与发酵

注意：木薯来源的材料可能含有氰苷，并在特定条件下释放氰化氢。在化学熏风柜中完成所有称重、加水、混合和取样步骤。请穿实验服、丁腈手套和安全眼镜。处理木薯基质后对工作表面进行净化，并按照机构指南将固体和液体废物作为有害化学废物处置。

1. 准备加里悬挂
   注：野生型 Euglena gracilis 是在持续黑暗条件下、28°C、轨道振动、120 x g下培养的。异养营养培养基的成分被制成一个定义的配方，包括1.5%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.1% KH2PO4、0.1% MgSO4、0.2% （NH4）2SO4、0.01% CaCL2.2H2O，以及0.4 mL/L的维生素高汤溶液（维生素B1：2.50g/L;维生素B12：12.5毫克/升;维生素B6：0.5毫克/升;维生素B7：0.025 mg/L）和2.0 mL/L微量金属液（Na2EDTA.2H2O：25.00 g/L;FeCl3.6H2O：21.00克/升;锌硝基4.7H2O：11.0克/升;MnCl2.4H2O：4.0 克/升;CuSO4.5H2O：0.39克/升;H3BO3：0.285克/升;Na2MoO4.2H2O：0.9克/升）。
   1. 在每个无菌500毫升通气盖瓶上标注底物类型（garri）、目标浓度（10、20、30、40或50 g ^L-1）、重复鉴定及计划灭菌条件（高压灭菌或非高压灭菌）。
   2. 将一艘称重船放在分析天平上，按下TARE/Zero键将显示设置为0.000克。
   3. 称重加里以匹配最终工作体积（例如，300毫升时，10克^L-1重3.0克，20克^L-1重6.0克，30克^L-1重9.0克，40克^L-1重12.0克，50克^L-1重15.0克）。
      注意：所选浓度范围（10–50 g ^L-1）设计涵盖从基线生长到高底物负荷的条件，便于评估适应性，适应日益复杂的物理化环境。
   4. 无菌地将称重的garri放入每个装有300毫升去离子或蒸馏水的无菌500毫升瓶中，重新盖上通风盖。
   5. 将每种悬浮液混合3分钟，直到混合物均质，采用以下方法之一。
      注意： E. gracilis 对机械剪切非常敏感;因此，选择了混合条件以最大限度减少激动引起的应激，同时保持细胞与底物之间的充分接触。
      1. 手动搅拌时，拧紧通风盖，用手以圆周运动旋转烧瓶3分钟，直到固体均匀分布。
      2. 磁性搅拌时，无菌地在瓶子中添加无菌搅拌棒，将搅拌瓶放在搅拌板上，并将搅拌速度设为200 x g ，形成浅漩涡且不会溅起水花。
   6. 让悬浮液在室温（25°C）下保持无扰地补水10分钟。
   7. 发酵前，先拧紧通风盖，并手动旋转烧瓶5圈，以重新释放沉积物，轻柔均匀化混合物。
      注：本研究中使用的garri是一种商业化的木薯衍生产品。根据制造商提供的营养信息，它主要由碳水化合物组成，蛋白质含量极低，脂肪含量几乎可以忽略不计。这种成分反映了食品和工业环境中典型的加工木薯基底。
2. 准备额外的木薯制品培养基
   1. 为每个无菌500毫升通风盖瓶标注底物类型（干燥果肉、颗粒、果皮或动物饲料）、浓度（30克^L-1）、复制鉴定及灭菌条件（高压灭菌或非高压灭菌）。
   2. 将一艘称重船放在分析天平上，按下TARE/Zero键将显示设置为0.000克。
   3. 根据工作体积称重基底物，达到30克^L-1 （例如，300毫升，重量为9.0克）。
   4. 将称重的基材无菌倒入每个装有300毫升去离子或蒸馏水的无菌瓶中，重新盖上通风盖。
   5. 用以下方法之一水化和混合每种悬挂液。
      1. 手动搅拌时，拧紧排气盖，在补水期间每3分钟轻轻旋转10次。
      2. 磁性搅拌时，需在无菌搅拌棒下无菌搅拌，以200 x g 搅拌，直到材料明显湿润且均匀分布。
   6. 目视检查每个悬浮液，确认固体水分充足且没有大块干燥结块。
      注意：除非下游分析测量需要，否则不要过滤木薯培养基。
3. 有氧发酵木薯基介质
   1. 确认每个烧瓶都装有无菌的透气通风盖，以允许气体交换同时减少环境污染。
   2. 将烧瓶竖立放置，置于室温（25°C）指定区域，远离直射阳光和高流量气流。
   3. 培养期至少72小时，无需搅拌。
   4. 记录每个烧瓶的发酵开始日期和时间及状态。
4. 准备高压灭菌培养基
   1. 发酵后，确保每个500毫升瓶中含有≤300毫升液体（≤总体积的三分之二），以防止灭菌过程中沸腾。
   2. 将通气盖松开至适合高压灭菌的“手指紧”位置，并在烧瓶上贴上高压灭菌指示带。
   3. 将烧瓶装入高压灭菌器，放入高压灭菌器安全托盘，选择P13液体循环。
   4. 确保灭菌参数保持在121°C，液体灭菌30分钟，然后开始循环。
   5. 循环结束后，让高压灭菌室压力恢复到大气压后再打开舱门。请戴上耐热手套取出烧瓶，冷却至室温。
   6. 在接种前，将冷却的烧瓶在室温下保存一夜。
      注意：高温液体和蒸汽可能导致烫伤。慢慢打开高压灭菌器，只有在压力平衡、液体冷却后才取出烧瓶。
5. 准备非高压灭菌培养基
   1. 直接使用发酵木薯培养基，无需高压灭菌，以保护本地微生物群落。
   2. 在72小时发酵后立即接种非高压灭菌培养基，以减少意外的环境污染。
   3. 通过使用相同容器类型（无菌500毫升通风瓶）、相同工作量（300毫升）和相同的发酵时长（≥72小时）来保持复制品间的一致性处理。

2. E . gracilis 起始培养物的建立

1. E . gracilis 库存培养的维护
   1. 将 E. gracilis 接种到新鲜的异养养分培养基中，并在28°C的完全黑暗下培养，并在120 x g 下持续轨道摇晃，直到培养物达到对数中段生长。
   2. 使用复合光学显微镜（明场）100×–400×总放大倍率（10×眼镜，物镜10×–40×）检查培养物，以确认活跃运动、典型的细胞形态延长及低囊肿水平。
      注：存活能力基于具有明确细胞边界且碎片最少的完整性细胞。主动运动被定义为细胞在视野内可观察到的方向性运动。形态稳定性基于特征细胞形状的主导性和低塌缩或高度不规则型态的低频率进行评估。
   3. 在适应实验中使用前，排除表现出过多细胞残渣、异常形态或囊肿升高的培养物。
2. 准备适应性接种物
   1. 通过收紧通气盖并手动旋转瓶子15秒，温和均匀地均匀化起始培养物，以确保细胞分布均匀且不产生剪切应力。
   2. 使用诺伊鲍尔血球计测定细胞密度。
      1. 用手轻轻搅拌15秒，将培养液搅拌均匀。
      2. 将1.0毫升培养液移入无菌的1.5毫升微离心管中。
      3. 用70%乙醇清洗血细胞仪和盖套，然后自然风干。
      4. 将10微升培养液移液器移液到血细胞计的两个网格上，并将盖片覆盖在湿样本上。
      5. 利用明场显微镜（10×物镜），聚焦于网格，并计数一组定义正方形中的单元格（例如大网格的四个角格）。
      6. 应用标准边界规则（计数单元格接触上下边界;排除接触上下边界的单元格）。
      7. 在第二个腔室重复计数（和/或重新装填），并计算平均细胞数/毫升。
      8. 计算细胞密度，使用以下公式：细胞/毫升=（平均细胞数×10⁴×稀释因子）/1
         注意：为改善细胞可视化，需用去离子水稀释样品（例如取100微升样品，并稀释于600微升去离子水中，重复细胞密度评估）
   3. 调整接种量，使所有实验介质最终接种量达到5%（v/v）。
      注：选定接种比的选择旨在确保足够的初始细胞密度和培养物的维持。
   4. 为每种处理条件准备独立接种剂，以保持实验组间初始细胞密度的一致性。

3. 在高压灭菌和非高压灭菌木薯培养基中的初步适应

1. 接种适应培养基
   注：接种量的选择是为了平衡足够的初始细胞密度与对适应效应的敏感性，早期适应时使用较低的体积，常规传代时使用较小的体积以维持稳定培养。
   1. 将已处理好的 E. gracilis 接种剂加入以10 ^gL-1、20 ^gL-1和30 ^gL-1最终浓度制备的高压和非高压灭菌木薯培养基中。
   2. 在所有处理条件下使用相等的接种量以标准化初始细胞密度。
   3. 混合培养液时，拧紧通风盖，轻轻旋转瓶子以圆周运动15秒，以分散细胞。
   4. 在25°C的完全黑暗下孵育培养物，以启动异养生长。
2. 维持培养条件
   1. 对于非高压灭菌培养基，尽量减少搅拌，以保护原生微生物群落结构和底物层层。
   2. 每天混合所有培养物一次，轻柔手动旋转15秒，以保持E . gracilis 细胞与悬浮木薯物质的接触。
      注意：避免剧烈摇晃或持续搅拌，以防止剪切应力和微生物-基物相互作用的意外破坏。
3. 监测早期适应情况
   1. 每48小时，使用无菌移液器尖端对每个培养物采集1毫升样本。
      1. 收紧通风盖，并在采样前轻轻旋转培养瓶15秒，以确保细胞和悬浮物均匀分布。
      2. 将一小份培养物转移到无菌的1.5毫升微离心管中。
      3. 根据需要用去离子水稀释样品，以改善单个细胞的可见性。（例如，100微升样品被稀释在600微升去离子水中）。
      4. 通过将10微升稀释样品移液到干净的显微镜载玻片上，并用盖片覆盖，制备湿装显微镜载玻片。
   2. 通过光学显微镜评估培养物
      1. 使用复合光学显微镜（明场）在100×–400×总放大倍率（10×目镜，物镜10×–40×）检查样品。
      2. 评估细胞运动、形态和包囊频率作为适应状态的指标。
         注：存活能力基于具有明确细胞边界且碎片最少的完整性细胞。主动运动被定义为细胞在视野内可观察到的方向性运动。形态稳定性基于特征细胞形状的主导性和低塌缩或高度不规则型态的低频率进行评估。
4. 在适应过程中执行序列通道
   注意：采样和转移间隔作为定义范围，以适应生长动态的变异性，同时保持重复间的实验时间一致。
   1. 每7天，将每种培养物的20%（v/v）无菌转移到同样加里浓度和灭菌条件下新鲜制备的木薯培养基中。
   2. 保持通道间转移体积一致，以保持选择压力。
   3. 重复连续传代，直到培养物在30克^L-1 木薯培养基中表现出稳定生长、持续的运动性和低囊肿频率。
      暂停点：培养物在常规混合和采样步骤之间可保持不动长达24小时。

4. 高浓度选择（30–50 g/L）

1. 准备高载基底
   1. 按照方法1所述程序，制备最终浓度为30 ^gL-1、40 ^gL-1和50 ^gL-1 的garri基木薯培养基。
   2. 在发酵期间，让底物充分水合，以确保细胞均匀暴露于溶解和颗粒成分。
   3. 在接种前，用手轻轻旋转瓶子，轻轻地将沉积颗粒悬浮10–15秒。
2. 接种高负载培养物
   1. 在每个高浓度木薯培养基中接种5%（v/v）的 E. gracilis 谱系，这些菌株已适应30 ^gL-1 garri。
   2. 在所有浓度下标准化接种量，以保持初始细胞密度的相当。
   3. 培养物在完全黑暗中25°C孵育，并以120 x g 进行持续轨道摇晃，以维持异养生长条件。
   4. 每天混合一次培养物，通过轻柔手动旋转15秒，保持细胞与悬浮底物的接触，同时避免剪切应力
3. 监测高基材负载下的表现
   1. 每48小时检查一次培养物，观察稀疏度、色素沉积及E . gracilis 细胞与沉积木薯材料间的可见变化。
   2. 无菌采集小等距，并使用复合光学显微镜在100×–400×总放大倍率（10×眼部，物镜10×–40×）检查细胞。
   3. 评估细胞的运动性、细胞形态和囊肿频率，作为对底物浓度增加的生理耐受性指标（参见方法2）。
4. 确认对高基底浓度的适应
   1. 识别在木薯浓度为≥40 g ^L-1时，保持持续运动、形态一致和低囊肿频率的培养物。
   2. 指定符合这些标准的培养物为适应木薯的gracilis 谱系，供后续实验评估。

5. 木菜培养基中的比较生长测试

1. 准备配对测试条件
   1. 对于每种木薯产品，包括加里、干果肉、颗粒、果皮和动物饲料，准备两个相同的容器，容器中含有相同的底物浓度和体积。
   2. 将一个导管接种适应木薯的 E. gracilis 谱系，配对导管接种未适应的野生型菌株。
   3. 每种配对条件下使用相等的接种量，以确保谱系间初始细胞密度相当
2. 保持配对培养
   1. 所有配对培养物在完全黑暗、25°C下孵育，并以120 x g 持续轨道摇晃，以维持异养生长条件。
   2. 每天通过轻柔的手动倒置混合一次培养物，以保持细胞与悬浮底物之间的接触。
   3. 记录孵化期内的可见变化，包括浑浊度、色素沉淀和沉降模式。
3. 记录中观察到的形态差异
   1. 在规定的采样间隔内，从每个培养物中无菌采集分量进行显微镜分析（详见方法2.2的分量采集和显微镜分析）
   2. 使用复合光学显微镜（明场）在100×–400×总放大倍率（10×目镜，物镜10×–40×）检查样品。
   3. 记录适应型与野生型培养在运动性、包膜频率及整体细胞形态上的差异。

6. pH监测

1. 采集pH样本
   1. 在第0、3、6、9和12天，使用无菌移液管尖端无菌提取每个实验条件下1毫升培养液。
   2. 让样品静置2分钟，以便浮浮固体沉降。
   3. 小心地将澄清后的上清液转移到干净的微离心管中，同时不扰动沉积物。
2. 测量pH值
   1. 在测量前，按照制造商的说明使用合适的标准缓冲液校准pH计。
   2. 将校准好的pH探针插入澄清后的上清液中，同时不扰动任何残留沉积物。
   3. pH读数稳定后立即记录pH值。
   4. 样品间用去离子水彻底冲洗探头，以防止交叉污染。

7. 使用比色试纸进行氰化物检测

注意：含氰化物的上清液具有危险性。所有采样和测试步骤均在化学排气罩或通风良好的区域内完成。请佩戴适当的个人防护装备，包括手套和护目镜。避免直接接触样本和试纸，并按照机构危险化学废物处置指南处理废纸和液体废物。

1. 采集氰化物样本
   1. 在第0、4、8和12天，使用无菌移液器尖端无菌提取每个实验条件下1毫升培养上清液。
   2. 让样品静置2分钟，以便浮浮固体沉降。
   3. 小心收集澄清后的上清液，避免扰动颗粒物。
2. 进行比色氰化物检测。
   1. 将比色氰化物试纸浸泡在澄清后的上清液中，持续时间由制造商规定。
   2. 取下条，允许在推荐时间内在环境条件下充分显色。
   3. 将显影后的试纸与制造商提供的参考刻度进行比较，以确定氰化物浓度。
3. 记录性氰化物水平
   1. 根据参考刻度，记录每个样品在所有时间点的氰化物浓度。
   2. 将每个显影的试纸与参考刻度一起拍照，或按照制造商建议保留试纸以便后续验证。

8. 适应性 E. gracilis 培养的维护与巩固

1. 结合适应的文化
   1. 在木薯浓度≥40 ^gL-1 garri成功适应后，目视确认每个复制培养中存在可活 的E. gracilis 细胞。
   2. 用无菌技术轻柔地将适应谱系的所有复制瓶合成一个无菌容器，生成均质的主培养物。
2. 准备维护介质
   1. 按照方法1所述的步骤，在选定的维护浓度下制备新鲜木薯基培养基。
   2. 根据后续实验需求选择高压灭菌或非高压灭菌培养基。
   3. 在后续所有通道中保持相同的灭菌条件，以确保微生物暴露的一致性。
3. 接种维持培养
   1. 将20%（v/v）合并主培养基的新鲜维持培养基接种。
   2. 通过手动旋转轻柔混合培养物，使细胞均匀分布，避免剪切应力。
   3. 在25°C完全黑暗下培养，并以120 x g 持续轨道摇晃，以维持异养生长条件。
4. 进行例行维护和换乘
   1. 每天通过轻柔的人工倒置维持培养，以防止细胞和底物长时间沉降。
   2. 每30天通过无菌技术结合复制瓶巩固维持培养。
   3. 使用合并培养基重新接种新鲜维持培养基，详见第8.3节。
5. 监测文化稳定性
   1. 每次通道时，使用复合光学显微镜（明场）在100×–400×总放大倍率（10×眼镜，物镜10×–40×）评估细胞形态和运动。
   2. 记录性的转变是囊肿增加、细胞残骸堆积或运动能力下降，这些都是培养稳定性下降的指标。

9 生物质采集用于下游蛋白质分析

1. 收集培养样本
   1. 在目标端点，将培养体积转移到无菌离心管中。
   2. 通过轻柔搅拌培养瓶，确保样本代表整个培养液。
2. 离心收集生物质
   1. 在≥3,500克×离心机下取样10分钟，将生物质沉淀。如果沉积物尚未完全沉降，重复这一步骤。
   2. 确认管底形成紧凑细胞颗粒。
3. 去除上清液
   1. 小心地倾倒或移液，避免搅动沉淀。
   2. 按照实验室废物规范处理上清液。
4. 为下游分析准备生物质
   1. 保留细胞沉淀以供进一步加工（例如干燥、储存或蛋白质分析）。
   2. 如果未立即处理，颗粒应以4°C储存短期使用，或根据需要冷冻长期保存。

10. 数据处理与归档

1. 组织数据集
   1. 将所有定量测量数据，包括pH值、氰化物浓度、存活能力评估、细胞计数和生物量值，输入一个带标签的电子表格。
   2. 保存显微镜图像及相关观察记录，使用标明底物类型、浓度、品株鉴定、重复次数和采样日期的标准文件名（例如NAG40G_WT1_05-01-25）。
2. 准备数据集进行分析
   1. 确认所有实验重复和计划时间点均在数据集中完整且完整。
   2. 将所有手写实验室笔记数字化，并将所有电子文件备份到安全存储，以防止数据丢失。数据分析和图形生成使用电子表格软件（Microsoft Excel）以及适用的R（R统计计算基金会）完成。所有核心分析均可通过基于电子表格的计算重现，R仅用于辅助可视化。

结果

以下代表性结果展示了成功应用该方案时的预期结果，以及在次优条件下观察到的各种结果范围。与这些结果对应的代表性数据见 图1、 图2、 图3、 图4、 图5、 图6、 图7。这些结果共同为在异养、全暗栽培条件下将 E. gracilis 适应于木薯基底物时的生长动态、存活能力、形态学和蛋白质结果提供了实用指导。此外，这些结果验证了该方案的关键生物学结果，包括成功适应、持续生长、高存活率、形态稳定、底物间表现一致以及蛋白质生成可测量。

整个实验中，每次处理使用了三份复制品（所有类型的木薯培养基）。我们承认，复制数量取决于任何遵循上述协议的团队的裁量和后勤限制。该方案的成功应用，使E. gracilis在基于garri的培养基中在完全黑暗条件下持续异养生长。积极的结果表现为平滑的S形生长轨迹、复制间的发散有限以及晚期细胞密度稳定。在适应群体中持续观察到的积极结果的形态特征包括细胞圆润和细胞膜厚。相比之下，不健康的塌缩细胞通常表现为不规则、碎片化或结构受损，且存活率降低，区别于适应培养中观察到的完整圆形或半囊肿型。参考图8附上了具有典型细长形态的野生型E. gracilis代表性图像，以区分基线细胞结构与适应或变异型态。在30克^L-1 garri下培养的培养物，其综合生长（以生长曲线下面积（AUC）衡量，相较于较低浓度，表明木薯底物利用更高效，生理适应更成功（见图1）。

在较低的加里浓度（10–20 g ^L-1）下，通常观察到次优结果，生长虽可检测，但数量减小且复制间变异性更大。在更高浓度（40–50 g ^L-1）下，培养液可能达到细胞峰值密度;然而，这些条件常表现出稳定延迟或时间变异性增加（见图2）。

在成功的实验中，细胞存活率在整个培养期内保持较高水平，仅有轻微的中期波动。Trypan Blue排除检测显示，在采样时间点内，维持30克^L-1 garri培养物中，存活（未染色）细胞比例较高（非染色）细胞（见图3）。偏离这一模式，包括染色细胞比例增加、运动能力下降，或形态趋向圆滑或塌陷，可能表明条件不理想，并作为早期故障排查的触发点。生存能力和形态评估基于一致的观察标准，包括细胞完整性、方向运动以及细长型与圆形或塌陷型态的相对流行率。

次优结果表现为存活能力的暂时性下降，最常见于高garri浓度下。部分恢复可能在后续时间点观察到;然而，这些条件在培养期间的存活能力变异性较大（见图4）。这些生长模式表明，中间基质浓度（例如30克^L-1）在养分可用性与压力之间提供了平衡，从而实现更稳定的生长。这些趋势反映了预处理条件和分阶段适应对培养表现的影响，因为逐渐暴露于日益复杂的底物有助于改善生理稳定性和可重复的生长行为。较低浓度限制生物量生产，而较高浓度则导致变异性更大和稳定延迟。

形态评估为适应状态提供了定性指标。积极结果包括出现并持续出现圆润或半囊肿且运动能力降低的细胞，这些细胞在反复亚培养过程中保持完整（见图5）。

相比之下，最优的培养物，多与野生型菌株或早期适应相关，表现出从细长、可运动细胞突然转变为不规则或塌陷形态，同时伴随着生长稳定性下降。

当该方案应用于其他木薯衍生基物，包括果肉、颗粒和果皮时，适应过 的E. gracilis 培养物在多种底物类型中表现出可重复的生长。积极结果的特点是生长曲线较早稳定，晚期下降较野生型培养减少（见图6）。

次优结果包括生长启动延迟或复制变异性增加，尤其是在物理异质性较大的底物中。

该方案的成功实施可通过外部实验室分析采用燃烧（Dumas）方法定量，具有可测量的 粗 蛋白含量。适应性培养中观察到的蛋白质百分比与野生型培养相当，总体蛋白质产出越高，生物量积累越高（见图7）。

培养基化学的监测支持了培养物与底物在适应过程中的相互作用，并验证了pH和氰化物测量在协议中的纳入。pH值随时间呈渐变，显示代谢活动和底物利用，适应性培养中趋势更稳定。氰化物测量进一步支持这一观点，适应性培养的培养物检测水平下降，而野生型培养物则变异性较大。这些结果共同表明，这些监测措施有效捕捉了与适应相关的介质化学变化，并支持对培养表现的解读。虽然其底层机制尚未被深入研究，但这对未来研究，尤其是工业规模应用来说，是一个重要领域。

长期的维护和巩固工作流程支持了适应性 Euglena gracilis 谱系在较长时间的培养期内的持续存活。通过反复传代维持的培养物在维持周期内始终保持了运动性、特征性形态和稳定的生长行为。虽然未对长期表现进行定量评估，但这些观察提供了代表性证据，表明适应后的谱系可以在特定条件下可靠地维持。

综合这些结果证实，适应方案支持E . gracilis 在木薯基底物上的强健生长、存活性和生物量生产，且性能稳定且氰化物水平随时间降低。

所有图表均作为独立文件提供，未嵌入手稿文件中。图和表格的放置偏好在手稿文本中用括号注释标示（例如，图1）。除非另有说明，所有数据和表格均应出现在最终出版物的代表性结果部分下方。

所有图表均作为单独文件提交，多面板图像则作为一张合成图像提供。显微镜图像中每个面板都包含比例条。数据图包括带有定义测量单位的标注轴，误差条则在相应图例中指定。

所有表格均以单独的 .xls 或 .xlsx 文件形式提交，包含原始或汇总的数值数据，无需装饰性格式。

图1：在10、20和30 ^gL-1 garri下完全黑暗条件下培养的E. gracilis生长动态。 每个底物浓度随时间显示的平均细胞密度。误差条代表生物复制体中的扫描电子显微镜（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：在高garri浓度（30–50 g ^L-1）下的E. gracilis生长表现。 细胞密度轨迹展示了在高密度基质中，峰值密度、稳定时间和变异性的变化。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在30 ^gL-1 garri下培养的E. gracilis细胞存活率趋势，采用Trypan Blue排除法测量。 在采样时间点上显示了可存活细胞的比例。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：在高garri浓度下培养的 E. gracilis 存活率波动。 细胞存活率在实验期间表现出短暂变化。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：适应性 E. gracilis 种群的代表性形态。 代表性的倒置光学显微镜图像显示，适应后细胞呈现圆润和半囊状。比例尺 = XX 微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：适应型和野生型 E. gracilis 在木薯衍生基质上的生长表现。 展示了适应型和野生型培养物在多种木薯产品上种植的生长轨迹。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：木薯种植的 E. gracilis 生物量的粗蛋白含量及总蛋白质产量。 蛋白质含量通过外部分析采用SGS燃烧（Dumas）方法定量。总蛋白质产量与生物量积累并列显示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：野生型E. gracilis在标准条件下的代表性形态（40倍放大）。 健康且未适应的 细叶尤格利 斯代表性图像，在光学显微镜下表现出典型的细长形态。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该方案成功的关键因素是木薯基质浓度与异养栽培E. gracilis期间生理稳定性之间的平衡。木薯来源的材料引入物理异质性、残留颗粒物和可变的养分释放动力学，直接影响生长行为和培养稳定性 ^2,3。在协议步骤中，底物准备和浓缩选择是最敏感的控制点。正如代表性结果所示，中间基底浓度可靠地支持持续生长且复制发散有限，而较低浓度限制生物质积累，高浓度则增加时间变异性和瞬态应力响应。这些结果强调，最大基质负载在处理异质农工材料时，并不一定能带来最佳或稳定的栽培性能。选定的预处理步骤和底物浓度范围旨在逐步挑战E. gracilis，以适应日益复杂的化学和微生物复杂性。这些条件下生长稳定性和存活能力的差异支持了分阶段方法的有效性，并证实中间基质浓度在养分可用性与生理压力之间提供了平衡。

异养生长期间的培养处理进一步影响适应结果。在完全黑暗条件下持续但温和的混合对于保持E. gracilis细胞与悬浮基质材料的接触，同时避免过度剪切应力至关重要。混合不足促进沉积和局部养分梯度，混淆生长和生存能力测量，尤其是在非高压灭菌培养基^中12。这些观察与之前的报告一致，表明空间异质性和底物暴露不均可能掩盖微生物培养系统中的生理反应。因此，该协议强调常规倒置而非持续搅拌，作为同质性与文化完整性之间的实际妥协。

为了适应木薯基底固有的变异性，该协议包含了多个故障排除和灵活性点。高压灭菌处理发酵木薯培养基通过减少微生物负荷和改变底物结构，特别是在早期适应阶段，提高了短期稳定性。相比之下，只要接种物密度和混合充分以维持稳定生长，非高压灭菌培养基在成功适应后仍可有效使用。这种分阶段方法与先前研究表明，渐进选择压力使微生物群体能够耐受随着时间增加的环境复杂性（^13,14）。在此背景下，纵向监测至关重要，因为生长或存活能力的暂时性下降在后续传代中常常恢复，而不影响整体适应成功率。

存活能力检测和形态监测在整个适应过程中成为快速诊断工具。排除蓝锥虫提供了生理稳健性的定量指标，而基于显微镜的运动性和囊肿评估则能及早预警过多底物负荷或适应延迟等次优条件¹⁵。重要的是，该方案强调时间趋势而非单点测量，因为短期存活力或形态波动并不总是预测长期培养失败。这一纵向视角对于区分短暂的应激反应与持续的生理衰退至关重要。在上述条件下观察到可检测氰化物水平的下降，表明木薯衍生底物在上述条件下存在部分解毒。这些减少可能是发酵相关降解、挥发和微生物活动共同作用的结果。虽然本研究未直接探讨氰化物去除的具体生化机制和动力学，但这些观察支持将氰化物监测纳入底物转化和适应过程中培养可行性的实用指标。

该方法存在若干局限性。首先，仅凭粗蛋白百分比无法完全反映营养价值或功能性蛋白质质量，解释时必须考虑总生物量产出与成分指标¹⁶。其次，使用加工极少、异质的底物会带来无法消除的变异性，即使采用标准化的制备方法。这一挑战在农工^{生物加工领域}广为人知，反映了现实世界的限制，而非实验上的不足。第三，虽然该方案针对实验室和中点规模培养进行了优化，但若规模扩大到台式规模，则需要对混合动力学、氧气转移和固体处理进行额外控制，并考虑反应堆结构和流体动力学条件，这在其他微藻类和^{原生生物系统}中已有研究。

与依赖精制糖或严格控制光营养系统的现有E. gracilis栽培方法相比，该方案在完全异养条件下，能够在低成本木薯衍生基质上生长，提供了独特的方法优势。该方法避免依赖纯化^{碳源，无需专用}照明设施，扩大了E. gracilis种植的操作灵活性。这对于专注于资源效率、废弃物增值和木薯产区分散生产的应用尤为重要。

该方法的更广泛意义在于其适用于微生物适应、可持续生物加工和生物质增值等研究领域。通过将增量底物暴露与简单、低成本的监测工具结合，该方案提供了一个可重复的框架，将非传统底物整合进微生物培养流程。虽然该系统为E. gracilis开发，但分阶段适应、纵向性能评估和形态学导向决策的基本原则，广泛可应用于其他正在探索的循环生物经济应用中的微藻和原生生物系统（^21,22）。因此，该协议不仅作为培养方法，也作为在现实底物约束下应用微生物适应的通用框架。该方法以可及性为首要目标设计，因此最适合具有基本微生物基础设施且可及关键生物资源（特别是Euglena gracilis培养物和木薯衍生底物）的实验室或应用研究环境。此外，该系统还提供时间灵活性，木薯基培养基全年都可以准备和发酵，不受季节限制。虽然该方案是在实验室规模下开发和验证的，但其采用低成本木薯衍生底物和极低的加工需求，支持了向更大规模种植系统的潜在扩展性。

虽然该方案建立了可重复的适应和培养框架，但对生长动力学、生物质生产率和底物转化效率的进一步定量分析，对于在大规模或工业应用中优化性能将非常重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌器 533LS 蒸汽 灭菌器	Getinge	533LS	木薯介质的蒸汽灭菌。 使用液体循环灭菌介质。
Bright-Line™ 血细胞计数板 更换 盖玻片	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	为血细胞计数板设计的专用厚盖玻片。
干木薯 浆	Psaltry International	N/A	提供木薯基质
木薯颗粒	Psaltry International	N/A	提供木薯基质
木薯皮	Psaltry International	N/A	提供木薯基质
木薯 基质（加里）	当地供应商	N/A	木薯衍生的加里 用作碳 源；用 去离子水制备。
离心机 Thermo Scientific Sorvall ST16 离心机	Thermo Scientific Sorvall ST16 离心机	75004241	能够 ≥3,500 × g，用于收获生物质。
离心管 例如 Axygen（A Corning 品牌）	Corning	MCT-150-C-S	无菌，至少 1.5 mL 体积
清水 例如 UltraPure™ DNase/RNase- 无菌蒸馏水	ThermoFisher Scientific	10977035	去离子或蒸馏。用于介质制备
复合光学 显微镜	Olympus	N/A	适用于常规细胞观察和计数的标准复合显微镜。
氰化物测试 条， 比色法。 CN- 10-30 mg/L	MQuant	110044	半定量氰化物检测。作为危险废物处理
无菌标准 称量船	Fisher Scientific	01-549-750	用于称量木薯基质和干生物质。
优格拉藻 (适应 谱系)	N/A	N/A	本研究中生成的木薯适应菌株
优格拉藻 (野生型)	N/A	N/A	非适应参考菌株。保持相同的标准条件。
优格拉藻生长 介质 组分	各种	N/A	根据实验室标准配方制备的基础优格拉藻介质。
FreeZone 6 升 控制台冻干 机	Labconco	70061xxxx	用于生物质脱水
带标准 线的血细胞计数板	Weber Scientific	NC1587539	用于手动细胞计数。
带热板的 磁力搅拌器	IKA	N/A	可选；在介质制备和基质悬浮过程中改善一致性。
微量移液器 (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	可调节体积移液器，用于无菌液体转移。
微型离心机	Eppendorf	N/A	可选；便于生物质收获过程中快速粘附。
Parafilm	Bemis	PM996	用于临时密封瓶或板，当通风盖不可用时。
pH 指示条	Fisher Scientific	13-640-520	用于快速定性评估培养基的 pH 的 pH 计替代品。
pH 计与 探头 Thermo Scientific Orion Star A211 台式 pH 计	Thermo Scientific Orion Star A211 台式 pH 计	13-645-519	使用前校准。用于测量培养上清液的 pH
冷藏 存储（4°C）	Frigidaire	FRT18S6JW7	介质的短期存储
摇床 孵化器（黑暗）	Thermolyne	M49235	摇动摇床孵化器，可达 100-150 RPM，温度范围 24-28 °C；在黑暗条件下使用以支持异养优格拉藻生长。
喷雾瓶 (32盎司)	Boardwalk	BWK03010	用于台面灭菌和常规无菌处理（70% 乙醇溶液）
电子表格 软件	Microsoft Excel	N/A	数据收集、组织和分析
无菌移液器 吸头	Eppendorf	N/A	与 P20、P200 和 P1000 移液器兼容的无菌一次性吸头。
无菌 血清学 移液器（5、10、 25 mL）	Corning	N/A	用于培养转移和取样的单独包装无菌移液器。
特拉蓝 溶液 0.4%，液体， 无菌过滤， 适用于细胞 培养	Sigma-Aldrich	T8154	通过特拉蓝排除法评估细胞活力的活性染料。
样品采集管 (50 mL)	Falcon	14-432-22	用于 pH 和氰化物采样
带通风盖的