一种用于将 Euglena gracilis 适应于木薯基底物以进行异养培养的方法

摘要

本方案描述了逐步适应的方法 眼虫 gracilis 木薯基底物 随后的 在异养培养条件下对多种木薯产品的生长、存活率及生物量生产的评估  

摘要

木薯加工会产生富含营养的副产品，但由于其成分多变、含有生氰化合物以及活跃的微生物群落，这些副产品仍未能得到充分利用。本实验方案介绍了一种多阶段适应性策略，用于建立可在木薯来源培养基中进行异养培养的耐木薯型Euglena gracilis藻株。该方法首先将裸藻培养物同时暴露于经高压灭菌和未经高压灭菌的木薯培养基中，并置于10–30 g/L的加里（garri）浓度梯度下，以评估其对微生物复杂性和底物负荷的耐受性。随后，将培养物置于更高浓度梯度（30–50 g/L）中，以评估其在更浓稠底物中的生长表现。将获得的适应性藻株与未适应的野生型菌株在五种木薯产品——加里、干木薯浆、颗粒料、木薯皮和动物饲料中进行比较，以评估其在实际应用场景材料中的生长稳定性。本方案包括pH变化的测定、使用比色试纸检测氰化物含量，以及通过总氮定量法测定蛋白质含量前的干生物质制备。上述步骤共同构建了一个可重复的框架，用于使Euglena gracilis适应木薯来源的底物，并评估藻株在多种木薯产品中的生长性能。该方法可推动耐性强的微藻品系的开发，服务于以木薯为核心的生物加工和废弃物高值化利用应用。

引言

木薯（Manihot esculenta）是西非地区重要的粮食作物和工业作物，可产生多种加工副产品，如木薯粉、干浆、果皮和颗粒饲料^1。

木薯来源的底物主要由可发酵碳水化合物和残余营养物质组成，同时含有少量蛋白质和纤维成分，但其具体组成会因加工条件和原料来源的不同而有所变化^2,3。由于其成分异质、含有氰苷类物质，以及在传统加工和发酵过程中产生的复杂微生物群落，这些底物至今仍未能得到充分利用⁴。这些特性给直接进行微生物培养带来了挑战，并限制了木薯副产物在标准化生物加工流程中的整合应用。尽管木薯副产物资源丰富，目前仍缺乏可在这些化学成分复杂且微生物活性高的底物上稳定培养微生物系统的可重复且具有生物可持续性的方法。若能建立一种可在上述条件下稳定运行、兼具富集或解毒功能的培养系统，将有助于实现更可持续的木薯加工流程和资源的循环利用。

Euglena gracilis 是一种属于眼虫门的单细胞鞭毛生物⁵ 因其在营养物质可利用性、渗透压和化学成分发生显著波动时，具有柔韧的表膜、动态的形态变化以及可逆的包囊能力而著称⁶其代谢适应性还使其能够合成储存性多糖副淀粉⁶ 并通过有机酸代谢调节细胞pH。这些代谢特征，尤其是淀粉样多糖（paramylon）的积累，可能增强能量储存和抗逆性，从而在木薯衍生底物所特有的多变营养和化学条件下支持生物体的存活与适应。这些特征使得 E. gracilis 在化学性质多变的淡水环境中具有持续生存能力，使其成为在异质性非精炼基质上培养的有前景候选物种⁷.

当暴露于化学成分复杂或具有微生物活性的底物时，未适应的E. gracilis培养物常表现出应激反应，例如包囊化增加和运动能力下降，而已适应的种群则可能保持更稳定的形态和代谢活性⁸。与相关微生物群落的相互作用可能进一步影响其在长期接触复杂底物期间的生理表现。这些特性凸显了在利用木薯来源材料培养E. gracilis时，基于适应性策略的重要性⁹。

为应对这些挑战，本方法采用分阶段适应策略，旨在逐步使E. gracilis适应木薯来源的底物。该方法通过逐步增加底物复杂性和微生物活性的可控暴露，筛选出能够在异质培养条件下维持存活和生长的种群。该设计使E. gracilis能够与相关微生物群相互作用，并可能从中获益，同时适应逐渐提高的培养基浓度。

经过适应后，该方案将对已适应和未适应的样本进行比较评估 E. gracilis 多个木薯衍生产品中的谱系。该比较框架可用于评估在接近田间条件的基质环境中，生长一致性、形态稳定性及生理响应，因为适应过程在逐步进行 E. gracilis 以应对木薯副产物中典型的营养成分变异、化学应激因子及微生物活性。

该方法在培养过程中对pH和氰化物水平进行标准化监测¹⁰，并对收获的生物量通过总氮含量测定进行下游蛋白质分析的前处理¹¹，从而实现不同底物和菌株之间营养潜力的比较。这些检测指标共同支持对基于木薯的培养过程中代谢稳定性、底物相互作用以及生物量特征的评估，并证明适应后的E. gracilis品系能够在多种木薯副产物中稳定且持续地生长。

该方法最适合具备基本微生物学基础设施以及可获取木薯来源底物的实验室或应用研究环境。实际考虑因素包括需要一致地处理非均质培养基、具备显微镜以监测培养物状态，以及在培养过程中精确控制混匀条件以避免剪切应力。

方案

本方案使用非致病性原生生物和木薯来源的植物底物。所有操作均须根据机构规定的生物安全和化学安全要求进行，以处理含氰植物材料。

1. 木薯基培养基的制备与发酵

警告：木薯来源的材料可能含有氰苷，在特定条件下可释放氢氰酸。所有称量、水合、混合和取样操作均须在化学通风橱中进行。穿戴实验服、丁腈手套和护目镜。处理木薯基质后，应对工作台面进行去污，并根据机构规定将固体和液体废弃物作为危险化学废物处置。

1. 制备加里悬浮液
   注意：野生型 Euglena gracilis 在28°C、持续黑暗条件下培养，以120 × g 的转速进行轨道振荡。异养营养培养基的成分为确定配方，包含1.5%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.1% KH2PO4、0.1% MgSO4、0.2% (NH4)2SO4、0.01% CaCl2·2H2O，以及0.4 mL/L维生素储备液（维生素B1：2.50 g/L；维生素B12：12.5 mg/L；维生素B6：0.5 mg/L；维生素B7：0.025 mg/L）和2.0 mL/L微量元素储备液（Na2EDTA·2H2O：25.00 g/L；FeCl3·6H2O：21.00 g/L；ZnSO4·7H2O：11.0 g/L；MnCl2·4H2O：4.0 g/L；CuSO4·5H2O：0.39 g/L；H3BO3：0.285 g/L；Na2MoO4·2H2O：0.9 g/L）。
   1. 用基质类型（加里）、目标浓度（10、20、30、40 或 50 g L^-1）、重复编号及计划灭菌条件（高压灭菌或非高压灭菌）标记每个无菌的500 mL通气盖锥形瓶。
   2. 将称量舟置于分析天平上，按下“去皮/归零”键，使显示屏归零至0.000 g。
   3. 称取加里，使其与最终工作体积相匹配（例如，对于300 mL，分别称取3.0 g（10 g L^-1）、6.0 g（20 g L^-1）、9.0 g（30 g L^-1）、12.0 g（40 g L^-1）或15.0 g（50 g L^-1））。
      注意：所选浓度范围（10–50 g L^-1）旨在覆盖从基础生长条件到高基质负荷的范围，从而评估在物理化学复杂性逐渐增加条件下的适应能力。
   4. 将称量好的加里无菌操作加入各含300 mL去离子水或蒸馏水的无菌500 mL锥形瓶中，并重新盖上通气盖。
   5. 使用以下方法之一，将每种悬浮液混合3分钟，直至混合物均质化。
      注意：E. gracilis 对机械剪切力敏感；因此，选择的混合条件旨在最小化由搅拌引起的应激，同时保持细胞与基质之间的充分接触。
      1. 手动混合时，拧紧通气盖，用手以圆周运动摇动锥形瓶3分钟，直至固体均匀分散。
      2. 磁力搅拌时，无菌操作向锥形瓶中加入无菌搅拌子，将锥形瓶置于搅拌器上，调节转速至200 × g，形成浅层漩涡，避免飞溅。
   6. 在室温（25 °C）下静置10分钟，使悬浮液充分水合。
   7. 发酵前立即轻轻均质化混合物：先拧紧通气盖，用手摇动锥形瓶5次，以重新悬浮沉降的物质。
      注意：本研究使用的加里为市售木薯制品。根据制造商提供的营养信息，其主要成分为碳水化合物，含少量蛋白质，脂肪含量可忽略。该组成反映了食品和工业应用中典型的加工木薯基质。
2. 制备其他木薯制品培养基
   1. 用基质类型（干浆、颗粒、果皮或动物饲料）、浓度（30 g L^-1）、重复编号及灭菌条件（高压灭菌或非高压灭菌）标记每个无菌的500 mL通气盖锥形瓶。
   2. 将称量舟置于分析天平上，按下“去皮/归零”键，使显示屏归零至0.000 g。
   3. 根据工作体积称取基质，使其达到30 g L^-1（例如，对于300 mL，称取9.0 g）。
   4. 将称量好的基质无菌操作加入各含300 mL去离子水或蒸馏水的无菌锥形瓶中，并重新盖上通气盖。
   5. 使用以下方法之一对每种悬浮液进行水合和混合。
      1. 手动混合时，在水合期间每隔3分钟轻轻摇动锥形瓶10次。
      2. 磁力搅拌时，无菌操作加入无菌搅拌子，以200 × g 搅拌，直至材料明显水合且均匀分散。
   6. 目视检查每种悬浮液，确认固体已水合，无大块干燥结块残留。
      注意：除非下游分析测量需要，否则不得过滤木薯培养基。
3. 好氧发酵木薯基培养基
   1. 确认每个锥形瓶均配有无菌透气通气盖，以允许气体交换，同时最大限度减少环境污染物进入。
   2. 将锥形瓶直立放置于远离直射阳光和高流量气流的指定区域，室温（25 °C）下静置。
   3. 静置培养至少72小时。
   4. 记录每个锥形瓶及条件的发酵起始日期和时间。
4. 制备高压灭菌培养基
   1. 发酵完成后，确保每个500 mL锥形瓶中的液体体积不超过300 mL（不超过总体积的三分之二），以防止灭菌过程中液体沸腾溢出。
   2. 将通气盖松至“手指拧紧”位置，适合高压灭菌，并在锥形瓶上贴上高压灭菌指示胶带。
   3. 将锥形瓶放入耐高压灭菌托盘中，装入高压灭菌锅，并选择P13液体程序。
   4. 确保灭菌参数为121 °C、30分钟（液体灭菌），然后启动程序。
   5. 程序结束后，待高压灭菌锅内压力恢复至大气压后再打开门。使用耐热手套取出锥形瓶，并使其冷却至室温。
   6. 将冷却后的锥形瓶在接种前于室温下存放过夜。
      警告：高温液体和蒸汽可能导致烫伤。应缓慢打开高压灭菌锅门，仅在压力平衡且液体冷却后取出锥形瓶。
5. 制备非高压灭菌培养基
   1. 直接使用发酵后的木薯培养基，不进行高压灭菌，以保留其原有的微生物群落。
   2. 在72小时发酵期结束后立即接种非高压灭菌培养基，以尽量减少意外的环境污染物进入。
   3. 为保持各重复间操作的一致性，所有基质条件均使用相同类型的容器（无菌500 mL通气盖锥形瓶）、相同的工作体积（300 mL）和相同的发酵时间（≥72小时）。

2. 建立E. gracilis起始培养物

1. 保持 E. gracilis 菌种培养
   1. 将 E. gracilis 接种至新鲜的异养型营养培养基中，并在完全黑暗条件下于 28 °C 恒温培养，同时以 120 × g 连续轨道振荡，直至培养物进入对数生长期中期。
   2. 使用复合光学显微镜（明场）在 100×–400× 总放大倍数（10× 目镜配合 10×–40× 物镜）下观察培养物，确认细胞具有活跃的运动能力、典型的细长细胞形态以及较低的包囊化水平。
      注：细胞活力的评估依据为存在完整细胞、清晰的细胞边界以及极少的碎片。活跃运动性定义为在视野中可观察到细胞的定向移动。形态稳定性根据典型细胞形态占主导地位以及塌陷或高度不规则形态出现频率较低来判断。
   3. 在用于适应性实验前，排除存在大量细胞碎片、异常形态或包囊化程度升高的培养物。
2. 准备适应性实验的接种物
   1. 通过拧紧通气盖并手动轻轻旋转锥形瓶 15 秒，轻柔均质化起始培养物，以确保细胞均匀分布，同时避免产生剪切应力。
   2. 使用血球计数板（Neubauer 血细胞计数器）测定细胞密度。
      1. 手动轻轻旋转混匀培养物 15 秒。
      2. 用移液器吸取 1.0 mL 培养液至无菌的 1.5 mL 微量离心管中。
      3. 用 70% 乙醇清洁血球计数板和盖玻片，并静置风干。
      4. 吸取 10 µL 培养液滴加到血球计数板的两个计数区上，然后将盖玻片覆盖于湿润样品上。
      5. 使用明场显微镜（10× 物镜），聚焦于计数网格，统计指定区域内的细胞数（例如大网格的四个角区域）。
      6. 遵循标准边界规则（计数接触上边界和左边界上的细胞；不计数接触下边界和右边界上的细胞）。
      7. 对第二个计数室重复计数（和/或重新加样），并计算平均每毫升细胞数。
      8. 使用以下公式计算细胞密度：细胞数/mL = (每格平均细胞数 × 10⁴ × 稀释倍数​) / 1
         注：为改善细胞的可视性，可根据需要使用去离子水稀释样品（例如取 100 µL 样品加入 600 µL 去离子水中稀释，然后重复细胞密度测定）
   3. 调整接种体积，使所有实验培养基中的最终接种量均为 5%（v/v）。
      注：所选接种比例旨在确保足够的初始细胞密度并维持培养物的生长。
   4. 为每种处理条件分别制备接种物，以保证各实验组之间初始细胞密度一致。

3. 在高压灭菌与非高压灭菌木薯培养基中的初始适应

1. 接种适应性培养基
   注意：接种体积的选择旨在平衡足够的初始细胞密度与对适应效应的敏感性，早期适应阶段使用较小体积，常规传代时则使用较大体积以维持培养物的稳定。
   1. 将制备好的 E. gracilis 接种物加入已灭菌和未灭菌的木薯培养基中，培养基终浓度分别为 10 gL^-1、20 gL^-1 和 30 gL^-1。
   2. 在所有处理条件下使用相同的接种体积，以标准化初始细胞密度。
   3. 为混匀培养物，拧紧通气盖，轻轻旋转摇动锥形瓶 15 秒，使细胞均匀分布。
   4. 将培养物置于完全黑暗条件下，25 °C 培养，以启动异养生长。
2. 维持培养条件
   1. 对于未灭菌培养基，应尽量减少振荡，以保持原有微生物群落结构和底物分层状态。
   2. 每天手动轻柔旋转混匀所有培养物一次，持续 15 秒，以维持 E. gracilis 细胞与悬浮木薯物质的接触。
      警告：避免剧烈震荡或持续搅拌，以防剪切应力及对微生物-底物相互作用造成非预期干扰。
3. 监测早期适应过程
   1. 每 48 小时，使用无菌移液器吸头从各培养物中无菌取样 1 mL。
      1. 取样前拧紧通气盖，轻轻旋转摇动培养瓶 15 秒，确保细胞和悬浮物质均匀分布。
      2. 将一份培养物转移至无菌的 1.5 mL 微量离心管中。
      3. 根据需要，用去离子水稀释样品以利于单个细胞的观察（例如，100 µL 样品加入 600 µL 去离子水）。
      4. 用移液器吸取 10 µL 稀释后的样品滴加到洁净的载玻片上，加盖盖玻片，制备湿片用于显微镜观察。
   2. 通过光学显微镜评估培养物
      1. 使用复式光学显微镜（明场）在总放大倍数 100×–400×（目镜 10×，物镜 10×–40×）下观察样品。
      2. 评估细胞运动性、形态特征以及包囊频率，作为判断适应状态的指标。
         注意：细胞活力根据是否存在完整细胞、清晰的细胞边界及碎片较少来评估；活跃运动性定义为在视野中可观察到细胞的定向移动；形态稳定性则依据典型细胞形态占主导、塌陷或高度不规则形态出现频率低来判断。
4. 在适应过程中进行连续传代
   注意：取样和转接的时间间隔提供为固定范围，以适应生长动态的差异，同时确保各重复组间实验时间的一致性。
   1. 每 7 天，将各培养物的 20%（v/v）无菌转接到新配制的、相同 garri 浓度和灭菌条件的木薯培养基中。
   2. 保持各代次间转接体积一致，以维持选择压力。
   3. 重复连续传代，直至培养物在 30 g L^-1 木薯培养基中表现出稳定的生长、持续的运动性以及较低的包囊频率。
      暂停点：在常规混匀与取样步骤之间，培养物可静置最长 24 小时。

4. 高浓度筛选（30–50 g/L）

1. 准备高负荷底物
   1. 按照方法1中所述步骤，制备终浓度分别为 30 gL^-1、40 gL^-1 和 50 gL^-1 的以加里为基础的木薯培养基。
   2. 在发酵期间使底物充分水合，以确保细胞均匀接触溶解态和颗粒态组分。
   3. 接种前立即用手轻轻摇动锥形瓶 10–15 秒，使沉降的颗粒物轻柔重悬。
2. 接种高负荷培养物
   1. 用先前已适应 30 gL^-1 加里浓度的 E. gracilis 菌株，以 5%（v/v）接种量接种每种高浓度木薯培养基。
   2. 所有浓度组的接种体积应保持一致，以维持可比较的初始细胞密度。
   3. 将培养物置于完全黑暗条件下，在 25 °C、120 × g 持续振荡培养，以维持异养生长条件。
   4. 每天手动轻柔摇动培养物 15 秒一次，以保持细胞与悬浮底物的接触，同时避免产生剪切应力。
3. 监测高底物负荷下的培养性能
   1. 每 48 小时检查一次培养物，观察浊度、色素变化以及 E. gracilis 细胞与沉降木薯物质之间的相互作用等可见变化。
   2. 无菌条件下取少量样品，使用复合光学显微镜在总放大倍数 100×–400×（10× 目镜配合 10×–40× 物镜）下观察细胞。
   3. 评估运动能力、细胞形态及包囊频率，作为生理耐受性对提高底物浓度响应的指标（参见方法2）。
4. 确认对高底物浓度的适应性
   1. 确定在木薯浓度 ≥40 g L^-1 时仍能维持持续运动能力、稳定细胞形态和低包囊频率的培养物。
   2. 将满足上述标准的培养物指定为木薯适应型 gracilis 菌株，用于后续实验评估。

5. 木薯产品培养基中的比较生长测试

1. 准备成对的测试条件
   1. 针对每种木薯产品，包括格里、干浆、颗粒、果皮和动物饲料，准备两个相同的容器，其中含有相同底物浓度和体积。
   2. 一个容器接种经木薯驯化的E. gracilis品系，另一个配对容器接种未经驯化的野生型菌株。
   3. 每组成对条件使用相等的接种体积，以确保不同品系间的初始细胞密度具有可比性。
2. 维持成对培养
   1. 将所有成对培养物在完全黑暗条件下于25 °C孵育，并以120 × g持续轨道振荡，以维持异养生长条件。
   2. 每天轻柔地手动倒置混合培养物一次，以保持细胞与悬浮底物的接触。
   3. 在整个孵育期间记录可见变化，包括浊度、色素沉着和沉降模式。
3. 记录观察到的形态学差异
   1. 在规定的取样时间点，无菌采集各培养物的等分试样用于显微镜分析（参见方法2.2中的等分试样采集与显微镜分析）。
   2. 使用复合光学显微镜（明场）在100×–400×总放大倍数下（10×目镜配合10×–40×物镜）检查样品。
   3. 记录驯化品系与野生型培养物在运动性、包囊频率以及整体细胞形态方面的差异。

6. pH 监测

1. 采集 pH 样品
   1. 在第0、3、6、9和12天，使用无菌吸头无菌吸取各实验条件下1 mL培养物。
   2. 让样品静置 2 分钟，以使悬浮固体沉降。
   3. 小心地将澄清的上清液转移至一支干净的微量离心管中，避免扰动沉淀 沉降物质。
2. 测量pH值
   1. 按照制造商的说明，使用适当的标准缓冲液在测量前对pH计进行校准。
   2. 将校准后的pH探针插入澄清的上清液中，注意不要扰动任何残留的沉淀物质。
   3. pH值读数稳定后立即记录。
   4. 在样品之间用去离子水彻底冲洗探针，以防止交叉污染。

7. 使用比色试纸检测氰化物

警告：含氰化物的上清液具有危险性。所有取样和检测步骤均须在化学通风橱或通风良好的区域进行。佩戴适当的个人防护装备，包括手套和眼部防护装置。避免皮肤直接接触样品和试纸条，并根据机构的危险化学品废弃物处理指南处置使用过的试纸条和液体废弃物。

1. 采集氰化物样品
   1. 在第0、4、8和12天，使用无菌吸头从每种实验条件下无菌吸取1 mL培养上清液。
   2. 让样品静置2分钟，以使悬浮固体沉降。
   3. 小心收集澄清的上清液，避免扰动颗粒物质。
2. 进行比色法氰化物检测。
   1. 将比色法氰化物检测试纸条浸入澄清的上清液中，浸泡时间按照制造商说明进行。
   2. 取出试纸条，在常温条件下静置推荐时间，使其充分显色。
   3. 将显色后的试纸条与制造商提供的参考比色卡进行比对，以确定氰化物浓度。
3. 记录氰化物水平
   1. 根据参考比色卡，记录每个样品在各个时间点的氰化物浓度。
   2. 将每条显色后的试纸条与参考比色卡一同拍照，或按照制造商建议保存试纸条，以供后续验证。

8. 适应性 E. gracilis 培养物的维持与稳定

1. 合并适应性培养物
   1. 在木薯浓度≥40 gL^-1 的加里培养基中成功适应后，通过显微观察确认每个重复培养物中均有存活的 E. gracilis 细胞。
   2. 采用无菌操作技术，将适应性品系的所有重复培养瓶轻柔地合并至一个无菌容器中，以制备均一的主培养物。
2. 制备维持培养基
   1. 根据方法1所述步骤，配制选定维持浓度的木薯基培养基。
   2. 根据后续实验需求，选择经高压灭菌或非高压灭菌的培养基。
   3. 在所有后续传代过程中保持一致的灭菌条件，以确保微生物暴露条件的一致性。
3. 接种维持培养物
   1. 用20%（v/v）的合并主培养物接种新鲜维持培养基。
   2. 通过手动轻轻旋转混匀培养物，使细胞均匀分布，同时避免产生剪切应力。
   3. 将培养物置于完全黑暗条件下，在25 °C、120 × g 持续振荡培养，以维持异养生长条件。
4. 进行常规维持与传代
   1. 每日轻柔地手动倒置培养物一次，以防止细胞和底物材料长时间沉降。
   2. 每30天通过无菌操作技术合并重复培养瓶中的维持培养物，进行一次整合。
   3. 使用整合后的培养物按照第8.3节所述方法重新接种新鲜维持培养基。
5. 监测培养稳定性
   1. 每次传代时，使用复合光学显微镜（明场）在100×–400×总放大倍数（10×目镜配合10×–40×物镜）下观察细胞形态和运动能力。
   2. 记录包囊化增加、细胞碎片积累或运动能力下降等变化，作为培养稳定性下降的指标。

用于下游蛋白质分析的9种生物量收获方法

1. 收集培养样品
   1. 在预期的实验终点，将培养液体转移至无菌离心管中。
   2. 转移前轻轻旋转摇动培养瓶，使培养物充分混匀，以确保所取样品具有代表性。
2. 通过离心收集生物量
   1. 在 ≥3,500 × g 条件下离心 10 分钟，使生物量形成沉淀。若沉淀未完全沉降，可重复此步骤。
   2. 确认离心管底部形成致密的细胞沉淀。
3. 移除上清液
   1. 小心倾倒或用移液器吸除上清液，避免扰动沉淀。
   2. 根据实验室废弃物处理规程处置上清液。
4. 为后续分析准备生物量​
   1. 保留细胞沉淀用于进一步处理（例如干燥、储存或蛋白质分析）。
   2. 若不能立即处理，可将沉淀短期保存于 4 °C，或根据需要冷冻以长期储存。

10. 数据处理与归档

1. 整理数据集
   1. 将所有定量测量结果，包括 pH、氰化物浓度、活力评估、细胞计数和生物量值，输入带有标签的电子表格中。
   2. 使用标准化的文件名保存显微镜图像及相关观察记录，文件名应标明底物类型、浓度、菌株编号、重复编号和采样日期（例如：NAG40G_WT1_05-01-25）。
2. 准备用于分析的数据集
   1. 确认数据集中包含所有实验重复组和预定的时间点，并确保数据完整。
   2. 将任何手写实验记录数字化，并将所有电子文件备份至安全存储设备，以防数据丢失。数据分析和图表生成使用电子表格软件（Microsoft Excel）完成，如适用，辅以 R（R 统计计算基金会）。所有核心分析均可通过基于电子表格的计算重现，R 仅用于补充性可视化。

结果

以下代表性结果展示了成功应用所述实验方案后预期得到的结果，以及在非最佳条件下观察到的结果范围。与这些结果相对应的代表性数据如图所示 图1, 图2, 图3, 图4, 图5, 图6, 图7综上所述，这些结果为解读适应过程中的生长动态、存活率、形态学特征及蛋白质表达结果提供了实用指导 E. gracilis 在异养、完全黑暗的培养条件下，丝状绿藻可适应以木薯为基础的培养基。此外，这些结果验证了该实验方案的关键生物学结果，包括成功适应、持续生长、高存活率、形态稳定、在不同培养基上表现一致以及可测量的蛋白质生产。

在全部实验过程中，每种处理（所有类型的木薯培养基）均设置三个重复。我们承认，重复数目的设定取决于任何遵循上述方案的团队根据自身判断及实际操作条件而定。成功应用本方案可实现E. gracilis在以木薯渣为基础的培养基中、完全黑暗条件下的持续异养生长。成功的实验结果表现为平滑的S型生长曲线、重复组间差异较小以及稳定维持的后期细胞密度。在已适应的种群中，表现出细胞呈圆形、细胞膜增厚等形态学特征，这些特征可作为积极结果的标志且被持续观察到。相比之下，不健康或塌陷的细胞通常呈现不规则、碎片化或结构受损的形态，常伴随活力下降，可与适应性培养中观察到的完整圆形或半包囊形态相区分。作为参考，文中提供了野生型E. gracilis典型细长形态的代表性图像（图8），以便将基础细胞结构与已适应或发生改变的形态区分开来。在30 g L^-1木薯渣培养基中培养的细胞，其综合生长表现更高，以生长曲线下的面积（AUC）衡量，优于较低浓度组，表明对木薯底物的利用效率更高，并实现了成功的生理适应（图1）。

在较低的木薯粉浓度（10–20 g L^-1）下，通常观察到次优结果，此时可检测到生长，但生长幅度降低，且在重复实验间变异较大。在较高浓度（40–50 g L^-1）下，培养物可能达到较高的峰值细胞密度；然而，这些条件常表现出延迟的稳定化过程或更大的时间变异性（图2）。

在成功的实验中，细胞活力在整个培养期间保持较高水平，仅在实验中期出现轻微波动。台盼蓝排斥实验表明，在所采集的时间点中，维持在 30 g L^-1 加里浓度下的培养物中，活细胞（未染色）的比例显著高于死细胞（蓝色染色）（图 3）。若出现与此模式偏离的情况，例如染色细胞比例增加、运动能力下降，或形态向圆形或塌陷状转变，则可能提示培养条件不理想，并可作为启动故障排查的早期信号。细胞活力与形态学评估基于一致的观察标准，包括细胞完整性、定向运动能力，以及细长形态与圆形或塌陷形态的相对比例。

次优结果表现为存活率出现短暂下降，这种情况最常在较高木薯粉浓度下观察到。在后续时间点可能观察到部分恢复；然而，这些条件下在整个培养期间的存活率表现出更大的变异性（图4）。这些生长模式表明，中等底物浓度（例如，30 g L^-1）在营养供应与胁迫之间达到平衡，从而实现更稳定的生长。这些趋势反映了预处理条件和分阶段适应对培养性能的影响，因为逐步暴露于复杂性递增的底物有助于提高生理稳定性并获得可重复的生长行为。较低浓度会限制生物量的产生，而较高浓度则导致更大的变异性以及稳定化过程的延迟。

形态学评估可提供适应状态的定性指标。积极结果包括出现并持续存在运动能力降低的圆形或半包囊状细胞，且在多次连续传代培养中保持完整（图5）。

相比之下，次优培养条件下的菌体（通常与野生型菌株或早期适应阶段相关）会表现出从细长、可运动的细胞形态突然转变为不规则或塌陷的形态，且伴随着生长稳定性的降低。

当该方案应用于其他木薯来源的底物（包括果 pulp、颗粒和果皮）时，经适应的E. gracilis培养物在多种底物类型上均表现出可重复的生长。与野生型培养物相比，成功的实验结果表现为生长曲线更早趋于稳定，且后期衰退程度降低（图6）。

次优结果包括生长启动延迟或重复实验间的变异性增加，尤其是在物理异质性较大的底物中。

成功实施该方案可获得具有可测粗蛋白含量的E. gracilis生物量，该含量由外部实验室采用燃烧法（杜马斯法）测定。适应性培养物中的蛋白质百分比与野生型培养物中测得的结果相当，总蛋白产量的增加与生物量积累的提升相对应（图7）。

培养基化学性质的监测支持了适应过程中培养物与底物之间的相互作用，并验证了将pH和氰化物检测纳入实验方案的合理性。pH值随时间呈现逐渐变化的趋势，表明存在代谢活性和底物利用，其中适应后的培养物表现出更稳定的变化趋势。氰化物检测结果进一步支持了这一结论，因为适应后的培养物中可检测到的氰化物水平降低，而野生型培养物则波动较大。综合来看，这些结果表明，这些监测步骤能够有效捕捉与适应相关的培养基化学变化，并有助于对培养物性能的解读。尽管本研究未探讨其潜在机制，但这代表了一个重要的未来研究方向，特别是在工业规模应用方面。

长期维持与传代流程支持了适应性Euglena gracilis品系在延长培养周期中的持续存活。通过反复传代维持的培养物在多次维持周期中始终保持着运动能力、典型的形态特征以及稳定的生长行为。尽管未对长期性能进行定量评估，但这些观察结果提供了代表性证据，表明该适应性品系可在指定条件下被可靠地维持。

综上所述，这些结果证实，该适应性培养方案能够支持E. gracilis在以木薯为基础的培养基上实现稳定的生长、良好的存活率和生物量积累，且随着时间推移，其表现稳定，并能持续降低氰化物水平。

所有图和表均以单独文件提供，未嵌入稿件正文中。图和表的放置位置偏好在稿件文本中通过括号内的标注予以说明（例如，(图 1)）。除非另有说明，所有图和表将在最终出版物中位于“代表性结果”部分的下方。

所有图均以单独文件提交，多图组合的图应提供为单个合并图像。显微镜图像需在每个图中包含比例尺。数据图需标注坐标轴并明确定义测量单位，误差线应在相应的图注中予以说明。

所有表格均以单独的 .xls 或 .xlsx 文件提交，包含原始或汇总的数值数据，且无装饰性格式。

图1：在10、20和30 gL^-1 木薯粉条件下，E. gracilis 在完全黑暗环境中的生长动态。 显示了各底物浓度下随时间变化的平均细胞密度。误差条表示生物学重复之间的标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：E. gracilis 在较高木薯粉浓度（30–50 g L^-1）下的生长表现。 细胞密度变化轨迹显示了在较高底物浓度下，峰值密度、稳定时间以及变异性的差异。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过台盼蓝排斥法测定的斜生栅藻（E. gracilis）在30 gL^-1 加里培养基中的细胞活力变化趋势。图中显示了在不同取样时间点的活细胞比例。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：在较高木薯粉浓度下培养的 E. gracilis 的活力波动。 实验期间细胞活力的瞬时变化如图所示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：适应后 E. gracilis 种群的代表性形态。代表性倒置光学显微镜图像显示了适应后观察到的圆形及半包囊状细胞。比例尺 = XX µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：适应菌株与野生型 E. gracilis 在木薯来源底物上的生长表现。 图中显示了适应菌株与野生型菌株在多种木薯制品上培养的生长轨迹。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：木薯培养的E. gracilis生物量中的粗蛋白含量和总蛋白产量。 蛋白质含量通过SGS燃烧法（杜马斯法）的外部分析进行定量。总蛋白产量与生物量积累一并展示。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：标准条件下野生型 E. gracilis 的代表性形态（40倍放大）。 在光学显微镜下观察到的健康、未适应状态的 Euglena gracilis 的代表性图像，显示其典型的细长形态。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

影响本方案成功的关键因素是在木薯底物浓度与异养培养过程中生理稳定性之间的平衡 E. gracilis. 木薯来源的材料会引入物理异质性、残留颗粒物以及不稳定的营养释放动力学，这些因素直接影响细胞的生长行为和培养体系的稳定性^2,3. 在实验方案的步骤中，底物制备与浓度 选择 因此代表最敏感的控制点。作为 已证明 根据代表性结果，中间底物浓度能够可靠地支持持续生长，且复孔间差异有限。 而 较低浓度限制生物量积累，而较高浓度则增加时间变异性及瞬时应激反应。这些结果表明，底物最大加载量并不必然产生 最佳的 或在使用异质性农工材料时的稳定培养性能。 所选的预处理步骤和底物浓度范围旨在逐步增加挑战性 E. gracilis 在化学和微生物复杂性逐渐增加的条件下，这些环境中观察到的生长稳定性和存活率差异支持了该分阶段方法的有效性，并证实中间底物浓度在营养可利用性与生理应激之间提供了平衡。

异养生长期间的培养操作会进一步影响适应性进化结果。在完全黑暗条件下保持持续而轻柔的混匀至关重要 维持 接触 E. gracilis 细胞和悬浮基质材料，同时避免过高的剪切应力。混合不足会导致沉降和局部营养梯度，干扰生长和活力测定，尤其在未经过高压灭菌的培养基中更为显著¹². 这些观察结果与 上一步 有研究报告指出，空间异质性和底物暴露不均可能掩盖微生物培养系统中的生理响应。因此，本方案强调采用常规倒置而非持续振荡，以此作为均匀性与培养完整性之间的一种实用折中策略。 

为了应对木薯基底物固有的变异性，本方案包含了多种故障排除措施和灵活调整的环节。对发酵木薯培养基进行高压灭菌可降低微生物载量并改变底物结构，尤其在早期适应阶段，有助于提高短期一致性。相比之下，在成功适应后，只要接种密度和混合程度足够以维持稳定的生长，未经过高压灭菌的培养基 可 有 效 使 用。这种分阶段的方法与先前的研究一致，这些研究 表 明，逐步施加的选择压力可使微生物群落随时间推移逐渐耐受日益复杂的环境^13,14。在此背景下，长期监测至关重要，因为生长或活力的暂时性下降 常 在 后 续传代过程中恢复，且不会影响整体适应的成功。 

活力测定和形态学监测在整个适应过程中作为快速诊断工具。台盼蓝排斥法提供了生理强健性的定量指标，而基于显微镜的运动性和 包囊 评估则可对底物过载或适应延迟等非理想条件发出早期预警¹⁵。重要的是，该方案强调随时间变化的趋势而非单点测量值，因为活力或形态的短期波动并不总能预测长期培养失败。 这种纵向观察视角对于区分短暂的应激反应与持续的生理衰退至关重要。 在培养过程中检测到的氰化物水平降低表明，在所述条件下木薯来源底物的部分脱毒作用正在发生。这种降低可能源于与发酵相关的降解、挥发以及微生物活动的共同作用。尽管本研究未直接探究氰化物去除的具体生化机制和动力学过程，但这些观察结果支持将氰化物监测作为评估底物转化和培养可行性的一个实用指标。

该方法存在若干局限性，应予以承认。首先，仅以粗蛋白百分比无法全面反映营养价值或功能性蛋白质质量，解释结果时必须结合生物量总量与组成指标进行综合考量¹⁶ 。其次，使用加工最少且成分不均一的底物 会引入 无法完全消除的变异性，即使采用标准化制备流程亦难以避免。这一挑战在农业工业生物加工领域已被广泛认知¹⁷ ，反映的是实际应用中的现实限制，而非实验设计本身的缺陷。第三，尽管本方案已 优化 适用于实验室规模和中试规模的培养，但若进一步放大至超过台式规模的体积，则需加强对混合动力学、氧气传递和固相处理的控制，并需考虑反应器构型及流体动力学条件，这一点已在其他微藻和原生生物系统中得到证实¹⁸。

与依赖精制糖或严格控制的光养系统的现有 E. gracilis 培养方法相比，本方案通过在低成本木薯来源底物上实现完全异养条件下的生长，提供了显著的方法学优势。该方法避免了对纯化碳源的依赖^19,20 ，且无需专用的照明设施，从而提高了 E. gracilis 培养的操作灵活性。这对于关注资源利用效率、废弃物高值化利用以及在木薯生产地区开展分布式生产的应用尤为重要。 

该方法的更广泛意义在于其适用于微生物适应性、可持续生物加工和生物质高值化利用等研究领域。通过将逐步增加底物暴露与简单、低成本的监测工具相结合，该方案为将非传统底物整合到微生物培养流程中提供了一个可重复的框架。尽管本方案是为 E. gracilis开发的，但其中分阶段适应、长期性能评估以及基于形态学的决策等核心原则，可广泛适用于其他正在探索用于循环生物经济应用的微藻和原生生物系统^21,22。因此，该方案不仅是一种培养方法，更是一个可在现实底物限制条件下进行应用型微生物适应研究的通用框架。 本方法在设计时以可及性为主要目标，因此最适合具备基础微生物学设施并可获得关键生物资源（特别是Euglena gracilis培养物和木薯来源底物）的实验室或应用研究环境。此外，该系统具有时间上的灵活性，基于木薯的培养基可全年制备和发酵，不受季节限制。尽管该方案是在实验室规模下开发和验证的，但其使用低成本木薯来源底物且加工需求极少的特点，支持其未来向更大规模培养系统的潜在扩展。

尽管本方案为适应性培养建立了可重复的框架，但对生长动力学、生物量生产率和底物转化效率进行进一步的定量分析，对于优化其在规模化或工业应用中的性能仍具有重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌器 - 533LS 蒸汽 灭菌器	Getinge	533LS	用于木薯培养基的蒸汽灭菌。 使用液体循环程序对培养基进行灭菌。
Bright-Line™ 血细胞计数板 替换用 盖玻片	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	专为血细胞计数板设计的加厚盖玻片。
干燥木薯 粉浆	Psaltry International	N/A	提供的木薯底物
木薯颗粒	Psaltry International	N/A	提供的木薯底物
木薯皮	Psaltry International	N/A	提供的木薯底物
木薯 底物（加里）	本地供应商	N/A	来源于木薯的加里 原料，作为碳 源使用；用 去离子水配制。
离心机 Thermo Scientific Sorvall ST16 离心机	Thermo Scientific Sorvall ST16 离心机	75004241	可达到 ≥3,500 × g，用于收获生物量。
离心管 例如 Axygen（A Corning 品牌）	Corning	MCT-150-C-S	无菌，最小容积 1.5 mL
洁净水 例如 UltraPure™ DNase/RNase- 无蒸馏 水	ThermoFisher Scientific	10977035	去离子或蒸馏水，用于培养基配制
复合光学 显微镜	Olympus	N/A	标准的复式显微镜，适用于常规细胞观察与计数。
氰化物检测 试纸条， 比色法。 CN- 10–30 mg/L	MQuant	110044	半定量氰化物检测。作为危险废物处理。
无菌标准 称量皿	Fisher Scientific	01-549-750	用于称量木薯底物和干生物量。
Euglena gracilis （适应性 菌株）	N/A	N/A	本研究中构建的木薯适应性菌株
Euglena gracilis （野生型）	N/A	N/A	非适应性对照菌株。维持相同的标准培养条件。
裸藻生长 培养基 组分	多种	N/A	根据实验室标准配方配制的基础裸藻培养基。
FreeZone 6 升 控制台式冻 干机	Labconco	70061xxxx	用于生物量脱水
血细胞计数板 带标准 刻度	Weber Scientific	NC1587539	用于手动细胞计数。
磁力搅拌器 带加热板	IKA	N/A	可选；在培养基配制和底物悬浮过程中提高一致性。
移液器 （P20, P200, P1000）	Eppendorf	N/A	可调体积移液器，用于无菌液体转移。
小型离心机	Eppendorf	N/A	可选；有助于在收获生物量时快速沉淀。
Parafilm 封口膜	Bemis	PM996	在无通气盖时用于临时密封烧瓶或培养皿。
pH 指示 试纸	Fisher Scientific	13-640-520	作为 pH 计的替代方法，用于快速定性评估培养基 pH。
pH 计带 探头 Thermo Scientific Orion Star A211 台式 pH 计	Thermo Scientific Orion Star A211 台式 pH 计	13-645-519	使用前需校准。用于测量培养上清液的 pH 值。
冷藏 储存（4°C）	Frigidaire	FRT18S6JW7	培养基的短期储存
摇床 培养箱（避光）	Thermolyne	M49235	可进行轨道振荡的培养箱，转速范围 100–150 RPM，温度范围 24–28 °C；在避光条件下使用，以支持异养型裸藻的生长。
喷雾瓶 （32 盎司）	Boardwalk	BWK03010	用于台面消毒和常规无菌操作（70% 乙醇溶液）
电子表格 软件	Microsoft Excel	N/A	数据采集、整理与分析
无菌移液 吸头	Eppendorf	N/A	无菌、一次性吸头，适用于 P20、P200 和 P1000 移液器。
无菌 血清学 移液管（5, 10, 25 mL）	Corning	N/A	独立包装的无菌移液管，用于培养物转移和取样。
台盼蓝 溶液 0.4%，液体， 经无菌过滤， 适用于细胞 培养	Sigma-Aldrich	T8154	活体染料，用于通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。
样品收集 用管（50 mL）	Falcon	14-432-22	用于 pH 和氰化物取样
通气盖 锥形瓶（250 至 500–500 mL）	Corning® 250 mL 聚碳酸酯带通气盖锥形瓶	431144	带通气盖的聚碳酸酯锥形瓶；可高压灭菌；用于无菌和非无菌液体培养。
废液容器	多种 — 符合实验室设定标准	N/A	高压灭菌袋以及锐器或玻璃废料容器，用于符合生物安全要求的废弃物处置。