小鼠肾缺血-再灌注损伤期间通过激光散斑对比成像监测微血管灌注

摘要

采用激光散斑对比成像系统监测小鼠右肾切除后单侧肾缺血-再灌注过程中肾微血管血流的变化。

摘要

激光散斑对比成像（LSCI）是一种非侵入性技术，可用于大范围测量表层血流灌注。凭借其高时空分辨率，LSCI能够对成像区域内不同区域的异质性血流变化进行半定量分析。本文展示了在小鼠单侧肾缺血-再灌注损伤（IRI）过程中应用LSCI技术记录血流的方法。在切除右侧肾脏后，调整小鼠体位及LSCI系统物镜的焦点位置，以确保左肾位于视野范围内。在肾脏缺血前、缺血期间及缺血后均进行LSCI扫描。此外，通过选择感兴趣区域（ROI），可同时监测各区域的血流情况。LSCI方法可实现肾脏微血管灌注的可视化，并提供血流的实时动态图谱。该技术可用于监测微血管血流，评估干预措施对小鼠肾IRI或其他类似动物模型中再灌注动力学和空间均一性的影响。

引言

缺血-再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的主要病因之一，与患者的高发病率和高死亡率密切相关^1,2。肾血流动力学的改变是缺血导致AKI的关键因素之一¹。缺血-再灌注诱发的微循环功能障碍是损伤发生的主要原因，可导致细胞缺氧和线粒体功能障碍^3,4。因此，实时监测血流变化是确保动物模型中肾脏缺血或再灌注成功实施并评估IRI程度的有效方法。

目前有多种技术可用于测量组织的微血管灌注，包括激光多普勒血流仪（LDF）⁵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH）自体荧光成像^6,7,8、红外成像⁹以及吲哚菁绿（ICG）血管造影¹⁰。其中，红外成像和NADH自体荧光成像为间接测量微血管灌注的方法。LDF通过光学探头仅监测局部血流量⁵，而扫描式LDF无法足够快速地监测缺血/再灌注（I/R）条件下组织微血管灌注的实时变化¹¹。ICG血管造影也可识别肾脏阻塞血管¹⁰，但需要使用造影剂，限制了其可进行测量的次数¹²。激光散斑对比成像（LSCI）是一种高效、无创的实时监测肾微灌注的方法¹³，已被用于获取与血流动力学相关的空间分辨信息。当相干光束照射到粗糙表面时，由于光程存在微小差异，反射或散射的光波之间会发生相互干涉，形成明暗斑点的随机分布图案，称为"散斑"。LSCI通过分析激光照射组织时产生的"动态散斑"模糊程度，来映射浅表组织中的血流速度^12,14,15。本研究中，LSCI系统采用785 nm激光波长，空间分辨率为3 µm，视场范围可在6.3 mm × 4.7 mm至42 mm × 31 mm之间调节，成像速度最高可达每秒120帧，从而实现对皮质微血管灌注的高分辨率、实时成像。基于上述优势，LSCI已广泛应用于多种实验和临床环境中的血流监测，包括烧伤创面¹⁶、视网膜灌注¹⁷、脑血流¹⁸、食管¹⁹以及肠道²⁰。

需要注意的是，激光散斑成像（LSCI）主要评估浅表组织的灌注情况，提供的是相对而非绝对的血流值，且可能受到组织光学特性和运动伪影的影响。在解读成像数据时，应考虑这些固有特性。

本研究采用右肾切除模型，以利于对侧肾脏的暴露和成像，利用激光散斑衬比成像技术（LSCI）监测了单侧肾缺血/再灌注（I/R）小鼠模型在缺血前、缺血期间及再灌注后的微血管灌注变化，揭示了肾脏表面血流的空间异质性。

方案

所有动物实验均遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》以及《实验动物护理和使用指南》，并经汕头大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。为消除性别和品系对缺血再灌注损伤（IRI）效应的影响，本研究仅使用雄性C57BL/6N小鼠。所有小鼠在年龄和体重上均相匹配，以获得可比结果。样本量设定为n = 5，与先前采用激光散斑血流成像（LSCI）进行技术验证的方法学研究一致²¹。动物在实验过程中接受人道护理，实验结束后通过吸入CO₂实施安乐死。所用试剂和设备列于材料表中。

在开始手术操作之前，打开激光散斑对比成像系统。本研究中使用的系统采用波长为785 nm的激光。将工作距离设置为手术区域上方约15–20 cm处。该系统基于空间对比算法，以激光散斑灌注单位（LSPU）计算血流。确保仪器预热充分并运行稳定后再继续操作。

1. 动物准备与剖腹手术

1. 每次手术前对手术台进行灭菌。将所有所需材料（灭菌器械、棉签、纱布、预先稀释的麻醉剂、加热垫、血管夹、生理盐水、脱毛膏、棉球、缝线、皮肤消毒剂和缝合线）准备好并放置在手术台上。
2. 术前30分钟，对小鼠皮下注射美洛昔康（0.2 mg/kg体重），以缓解疼痛。
3. 将一定量的灭菌生理盐水倒入洁净容器中。取一块纱布，在其中间剪出一个合适的开口。
4. 通过腹腔注射2.5%三溴乙醇（400 mg/kg体重；先前用无菌生理盐水稀释）对小鼠进行麻醉。
   注意：在右肾切除术过程中使用三溴乙醇作为麻醉剂。在长时间血流监测操作中则使用1%异氟烷进行麻醉。
5. 用胶带将小鼠固定在加热垫上，并使用脱毛膏去除小鼠腹部区域的毛发。在整个手术过程中，使用加热垫维持直肠温度在37 °C ± 0.5 °C。
6. 先用75%酒精，再用碘伏棉签对术区皮肤进行消毒。
7. 使用镊子轻捏小鼠脚趾。当确认小鼠无疼痛反应后，用剪刀沿腹部中线做垂直切口。轻轻分离皮肤与腹膜，然后切开腹膜进入腹腔。
8. 在小鼠身上使用牵开器以获得最佳视野，并用纱布覆盖手术区域，使纱布上的开口与腹腔对齐，同时用生理盐水润湿纱布。

2. 右肾切除术

1. 使用棉签轻轻将肠管推向纱布一侧，暴露右侧肾脏及其周围组织。折叠纱布覆盖肠管，并用生理盐水润湿，防止肠管干燥。
2. 使用弯头镊子提起右侧输尿管。将两根6-0缝线穿过输尿管，并在两个位置进行结扎。
3. 使用显微剪刀在两个结扎线之间切断输尿管。
4. 将棉球用生理盐水润湿后，用精细镊子夹取棉球，轻轻上推肝脏并用棉球固定，以暴露肾脏及其右侧的血管。
5. 使用弯头镊子沿右侧肾脏侧缘钝性分离肾周脂肪垫，直至完全暴露肾动脉和肾静脉。
   注意：同时分离位于肾脏上方的肾上腺组织团块。
6. 小心将弯头镊子从肾动脉和肾静脉下方滑过，形成一个通道。然后，将一根6-0编织丝线绕过血管并将其共同结扎。
7. 在靠近肾脏处切断已阻断的肾动脉和肾静脉，移除肾脏及其残留的附着组织。
8. 移除用于固定肝脏的棉球。

3. 利用激光散斑对比成像（LSCI）在缺血-再灌注期间监测肾血流量

1. 打开LSCI系统及仪器专用软件。
2. 点击 原始图像 和 预览 用于查看手术区域的原始未处理图像。
3. 调整小鼠位置，使用以600 mL/min流速输送的1%异氟烷维持麻醉 通过 一个鼻锥，并在观察原始图像的同时调整相机的放大倍数，以获得目标肾脏的清晰视野。
4. 点击 同步显示 以查看实时血流图像。将放大倍数设置为 2.5× 并选择 自动血流调节 以优化图像。然后，锁定 血流参数此外，设置为每5000 ms记录一幅图像帧。
   注意：可使用湿润的棉球固定肾脏位置，并隔离周围器官和组织，以增强肾脏区域与背景之间的区分度。
5. 将方形区域参数大小设置为112，并在肾脏视图上以固定方向均匀排列5个方形区域。点击 实时图像配准 和 记录 开始记录血流数据。
   注意：该仪器将自动记录激光散斑灌注单位（LSPU），该单位代表感兴趣区域（ROIs）内的实时血流值，可用于后续分析。在检测过程中，呼吸相关的运动或环境变化可能导致视野偏移。若系统提示检测区域出现此类情况，应立即停止当前记录，然后点击 实时图像配准 和 记录 再次。
6. 记录30分钟基线后，分离左肾血管周围的脂肪组织。使用止血钳夹住微型夹，并将其置于左肾动脉和静脉近肾门处。继续实时监测30分钟。
7. 松开微型夹具以启动再灌注。监测并记录肾脏微血管血流的实时恢复情况。
8. 在监测血流再灌注至少60分钟后，停止监测，并使用7-0编织丝线缝合腹部切口。

4. 术后恢复与护理

1. 通过腹腔注射1 mL生理盐水给予液体，以预防手术后脱水。
2. 将小鼠置于加热垫上。仔细监测小鼠，直至其恢复意识、表现警觉并能够自主恢复正常体位。

结果

本研究旨在检测IR诱导的急性肾损伤（AKI）过程中肾血流的变化。因此，我们采用了一种常见小鼠模型，即先进行右肾切除术（图1A），随后对对侧肾脏实施IR手术（图1B）。由于需要在缺血再灌注过程中实时监测血流，所有对小鼠的操作均在整个实验过程中于仪器区域完成（图1C）。

设定仪器参数并调整视野后，我们首先进行了30分钟的血流测量，以监测肾脏微血管灌注的基线水平。在最初的30分钟内，小鼠肾脏微血管中的血流逐渐趋于稳定（图2A-C）。值得注意的是，在缺血前，不同感兴趣区域（ROI）的灌注水平存在异质性（图2B）。在夹闭肾动脉和肾静脉后，血流迅速下降，整个肾脏微循环立即进入无灌注状态（图2...

讨论

本研究描述了激光散斑衬比成像（LSCI）系统在小鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）过程中，用于实时、高分辨率可视化肾微血管血流动力学的应用。与传统的终点测量方法或空间分辨率有限的技术（如激光多普勒血流仪，LDF）相比，该方案能够提供二维灌注图谱，精确捕捉肾脏微循环内的区域异质性。LSCI在术中实时监测方面的高效性和易用性是本方法的关键优势。

通过监测雄性小鼠在缺血前、缺血期间及缺血后的血流变化，我们发现，在经历30分钟缺血后恢复再灌注时，小鼠肾脏微血管血流无法恢复至基线水平，且在靠近或远离肾门的区域之间存在异质性。该结果与大鼠实验所得结果一致¹¹。这种先出现短暂高灌注、随后持续低灌注的模式，与在脑部模型中观察到的微血管反应具有相似性²¹，提示不同器官之间可能存在共同的病理生理机制。合理选择感兴趣区域（ROI）可实现对肾脏灌注动力学空间差异的定量分析。此外，激光散斑衬比成像（LSCI）能够提供整个肾脏微血管灌注的实时图谱，这些是该方法的关键优势。我们的结果表明，该方法可用于：（1）监测诱导肾缺...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸收罐（用于麻醉）	深圳市莱悦生物科技有限公司，中国	10-0210
医用酒精（75%）	恒利雅，新疆，中国	N/A	皮肤消毒剂
麻醉蒸发器	Midmark	https://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
棉签	青岛海诺生物工程有限公司，中国	https://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
脱毛膏	VEET	https://www.veet.com.cn/jingchun/whx
纱布绷带	稳健医疗用品股份有限公司，深圳，中国	https://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
加热垫	任丘市鼎盛采暖设备有限公司，中国	HD-1902	用于维持体温
碘伏溶液	泰新康，金溪，中国	https://www.11467.com/nanchang/co/120661.htm	皮肤抗菌剂
异氟烷	RWD生命科学有限公司，中国	R510-22-10	吸入性麻醉剂
激光散斑对比成像（LSCI）系统	湖北迅维光电科技有限公司，中国	SIM BFI HR PRO	MoorFLPI-2 等效系统
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三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402-100G	2.5% 溶液；可注射麻醉剂