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一种利用人成骨细胞和脱细胞细胞外基质建立骨骼肌肉疾病模型的三维骨培养平台

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DOI：

10.3791/70782

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2026年6月23日

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de Odontología, Universidad San Sebastián, 2Laboratorio de Biotecnología y Biofarmacia, Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, 3Hospital Traumatológico de Concepción, Servicio Salud Concepción

本文内容

摘要

本方案描述了利用嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶并添加脱细胞外基质的人类成骨细胞构建三维骨组织的方法。该方法成本低、可扩展，并且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了一个具有转化潜力的平台。

摘要

建立骨质疏松等肌肉骨骼疾病的模型需要 体外 能够准确再现人类骨骼生物学关键特征的平台。传统的三维培养系统可为细胞间及细胞与基质间的相互作用提供有价值的见解，但其对昂贵材料、生物打印机或专用基础设施的依赖限制了更广泛的应用。本文介绍一种稳健且经济高效的三维骨组织构建方案，该方案利用源自人类的骨细胞嵌入 GelMA 水凝胶中，并添加来自捐赠股骨头的脱细胞细胞外基质（dECM），通过移液操作在生理温度（37 °C）下使用常规实验室设备即可制备出可重复的类骨结构。

所获得的构建物具有较高的存活率和结构完整性，可支持免疫荧光成像和分子检测等后续应用。通过引入患者来源的脱细胞细胞外基质（dECM），该方法能更真实地反映人类骨组织重塑及疾病进展过程，从而提升转化研究的相关性。该策略为药物筛选、再生医学以及骨生物学机制研究提供了一个易于操作且可扩展的平台。总体而言，本实验方案为高成本的生物打印技术提供了一种实用的替代方法，并可轻松适配于其他组织特异性的脱细胞细胞外基质（dECM）来源。

引言

该方法旨在通过将 GelMA 与来源于人骨组织的脱细胞细胞外基质（dECM）相结合，建立一种经济高效且可重复的三维细胞培养平台，用于模拟骨质疏松症等肌肉骨骼系统疾病。该策略能够构建出更接近生理微环境的类骨结构，相较于传统的二维培养，更有利于在生物学相关条件下研究细胞间及细胞与基质间的相互作用1。采用患者来源的骨细胞及临床获取的股骨头 dECM，可提高研究的转化价值，实现在体外实验与临床研究需求之间的有效衔接2。

该方法旨在解决现有三维培养和生物制造系统的关键局限性，这些系统通常需要生物打印机、专有生物材料或昂贵的耗材（例如 Matrigel），从而限制了其在许多实验室的可及性3,4。此外，合成水凝胶往往难以重现矿化骨细胞外基质的生化复杂性或驻留骨细胞的行为5。相比之下，本方案采用人骨源性脱细胞细胞外基质（dECM），在保留矿化成分、天然蛋白质和信号分子的同时，避免了增材制造技术所需的复杂设备条件6。

GelMA与dECM的结合具有多项优势。GelMA支持细胞黏附、存活和分化，且可在37 °C下进行加工，无需特殊设备即可实现细胞包封。使用低成本的紫外光源（365 nm）进行交联进一步提高了其可及性7。添加dECM可为构建物提供合成替代物中所缺乏的组织特异性信号，从而增强成骨相容性，并有助于后续实验分析，如免疫荧光和分子谱型分析8。

该方法符合当前开发与人类相关的骨模型的研究趋势，有助于减少对动物实验的依赖，而动物实验的转化准确性常因物种间差异而受限1,9,10。本方案遵循“3R原则”11，并可进行调整以利用其他组织特异性脱细胞细胞外基质（dECM）生成构建物，从而拓展其在软骨、皮肤及心血管组织工程中的潜在应用12。

总体而言，该技术为在生理相关条件下研究骨骼生物学提供了一个易于使用且可扩展的平台。该方法与常规实验室设备兼容，并能够整合人类临床样本，因此特别适用于高校和医院的研究团队。该技术不仅为深入研究骨骼相关过程提供了平台，还可作为再生医学和个体化治疗开发等转化应用的起点。

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方案

本研究已获得智利康塞普西翁卫生服务科学伦理委员会的批准。人骨组织来自在智利康塞普西翁创伤医院接受髋关节置换手术的患者捐赠的股骨头，捐赠前已获得患者的书面知情同意。样本储存于 −80 °C，直至使用。所有操作均符合机构关于人源组织在研究中伦理使用的指导方针。所有人骨组织均来自智利康塞普西翁创伤医院患者捐赠的股骨头，捐赠过程均获得知情同意，并经康塞普西翁卫生服务科学伦理委员会批准。所有操作均符合机构关于人源组织使用的规定。

1. GelMA 的合成

  1. 将10 g A型明胶A溶于100 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.5）中 60 °C 持续搅拌。
  2. 将温度降低至 50 °C 以0.5 mL/min的速度加入5 mL甲基丙烯酸酐，同时轻轻搅拌1–3小时。
  3. 稀释反应混合物5倍× 用预热至 40 °C 以终止反应。
  4. 使用12–14 kDa透析膜，对3–5 L蒸馏水透析该溶液 40 °C 5–7天，每天更换水。
    注意：（关键步骤）确保每天完全更换水溶液，以去除未反应的甲基丙烯酸酐。
  5. 将透析后的溶液冻干24小时，并将冻干的GelMA储存于 4 °C 直至使用。

2. GelMA 水凝胶制备

  1. 制备5、10或15 w/v%的GelMA水凝胶，每批10 mL。
  2. 将0.5、1.0或1.5 g冻干GelMA溶解于9.5 mL去离子水中，温度为50 °C。
  3. 将溶液冷却至37 °C。
  4. 加入0.5 mL Irgacure 2959光引发剂溶液（0.5 w/v%，溶于无水乙醇）。
  5. 轻轻混匀，并在37 °C下维持溶液，直至通过0.22 µm醋酸纤维素膜滤器进行无菌过滤。

3. 骨脱细胞

  1. 将股骨头逐渐解冻至 25 °C。将每个股骨头切成两半，再分割成更小的碎片。
  2. 将组织碎片浸入 60 °C 的无菌蒸馏水中，超声处理 15 分钟（40 kHz，连续模式）。
  3. 用预热至 60 °C 的 300 mL 蒸馏水洗涤样品，同时在 200 rpm 条件下振荡 5 分钟。
  4. 在 25 °C 下以 1850 × g 离心 15 分钟。重复洗涤和离心步骤三次。
  5. 将组织置于含有 3% 过氧化氢和 0.02% 过氧乙酸的溶液中，在 60 °C 下超声处理（40 kHz，连续模式）10 分钟，以实现组织灭菌。
  6. 将组织转移至 300 mL 70% 乙醇中，在 21 °C 下超声处理（40 kHz，连续模式）10 分钟。
  7. 用 300 mL 蒸馏水洗涤样品两次，每次在 60 °C 下以 200 rpm 振荡 10 分钟，并在 25 °C 下以 1850 × g 离心 15 分钟。
  8. 首先将骨组织在 -80 °C 预冷冻 4 小时，然后在 0.05 mbar、-40 至 -60 °C 条件下冻干去细胞骨组织 24 小时，使用宽底容器以确保干燥均匀，并避免样品过高。
    注意：（关键步骤）确保样品在容器内的高度不超过 2–3 cm，以防止冻干不完全。

4. 骨微粒制备

  1. 将脱细胞骨碎片放入含有消毒溶液的250 mL锥形瓶中，使用匀浆器匀浆，直至获得均匀的白色溶液（补充视频1）。
  2. 在25 °C条件下以1850 × g 离心15分钟，弃去上清液，并在25 °C、200 rpm振荡条件下用300 mL蒸馏水洗涤沉淀物两次，每次10分钟。最后在25 °C条件下以1850 × g 再次离心15分钟。
  3. 将所得材料在-40至-60 °C、0.05 mbar条件下冷冻干燥48小时，随后于-80 °C保存备用。
  4. 使用已灭菌的陶瓷研钵对冻干的皮质骨或髓质骨进行机械研磨，直至获得细粉（图1）。
  5. 将粉末过200 µm筛网，称量最终材料，并于-80 °C保存。
    注意：（关键步骤）筛分前务必确保粉末完全干燥，以防止团聚及颗粒尺寸筛选不准确。

补充视频 1：骨组织匀浆化操作。使用匀浆器对脱细胞骨碎片进行匀浆处理，直至形成均匀的白色悬浮液。请点击此处下载该文件。

figure-protocol-1
图1：骨微粒制备。（A）经OV5匀浆器匀浆并保存在-80 °C下的脱细胞骨碎片。（B、C）用于将脱细胞骨研磨成细粉的已灭菌陶瓷研钵。（D）过筛后的最终脱细胞骨微粒。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 骨凝胶的制备

  1. 通过在 50 °C 下将 1 g GelMA 溶解于 9.5 mL 去离子水中，制备 10 w/v% 的 GelMA 溶液。
  2. 将溶液冷却至 37 °C，然后加入光引发剂 Irgacure 2959 溶液。
  3. 保持溶液温度为 37 °C，并使用 0.22 µm 滤膜进行无菌过滤。
  4. 加入 1% w/v 的脱细胞骨微粒（DBMP）。
  5. 在 40 °C 下小心混合并反复吹打，避免产生气泡，直至形成均匀的悬浮液，得到骨凝胶（BG）。
  6. 将 BG 储存于 4 °C，最长可保存 2 周。
    注意：（关键步骤）在加入细胞前，需将水凝胶保持在其胶凝温度以上（≥37 °C），以防止过早固化。

6. 骨细胞原代培养

  1. 骨髓提取与初步清洗
    1. 使用无菌外科器械从股骨头内部提取并切碎骨髓组织（图2）。
    2. 将切碎的组织转移至无菌培养皿中。
    3. 用添加了抗生素-抗真菌溶液（100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、0.25 µg/mL 两性霉素）的α-MEM培养基清洗组织三次。
    4. 用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）冲洗一次。
      注意：（关键步骤）尽量缩短组织获取与处理之间的时间，以保持细胞活性。
  2. 酶消化
    1. 将组织在I型胶原酶溶液中于37 °C轻柔振荡孵育25分钟。
    2. 用HBSS清洗。
    3. 重复步骤6.2.1–6.2.2两次（共进行三次胶原酶消化）。
    4. 将组织在0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）中于37 °C孵育25分钟。
    5. 用HBSS清洗，并重复EDTA步骤两次。
    6. 进行最后一次I型胶原酶消化（37 °C孵育25分钟），随后用HBSS清洗。
      注意：（故障排除）消化不完全可能导致细胞得率低；如有需要，可将酶孵育时间延长5–10分钟。
  3. 细胞回收与培养
    1. 收集胶原酶溶液，并将最后一次HBSS清洗液转移至50 mL离心管中。
    2. 在室温下以1,000 × g离心5分钟。
    3. 弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL完全α-MEM培养基中。
    4. 将细胞悬液接种至两个T75培养瓶中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
      ​注意：每2–3天更换一次培养基，直至达到足够的汇合度（图3）。

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图 2：骨髓组织的获取。（A）从髋关节置换手术中获取的股骨头，显示用于细胞分离的骨髓区域。（B）切碎的骨髓骨组织碎片，在酶消化前置于无菌培养皿中。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：原代骨细胞培养。从人骨髓骨组织分离后，骨细胞贴壁并在T75培养瓶中以单层形式生长增殖。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 三维细胞培养

  1. 将适量的BG水凝胶在37 °C预热。
    注意：（关键步骤）确保操作区域无气流；降温会加速提前凝胶化。
  2. 收集培养的骨细胞，于15 mL离心管中以500 × g 离心5分钟。
  3. 将沉淀用200 µL培养基重悬，并与BG水凝胶混合，获得最终细胞密度至少为1000个细胞/µL的混合物（此后称为生物墨水）。
  4. 使用1000 µL移液器吸取50 µL生物墨水，并在沉积前保持在37 °C。
  5. 将50 µL生物墨水逐个移入培养板的每个孔中（补充视频2）；在室温下静置约5分钟以完成物理凝胶化（图4）。
  6. 对每个孔施加365 nm紫外光照射1分钟，以实现不可逆交联（0.30 J/cm2）。
  7. 加入培养基，并将构建物在37 °C、5% CO2条件下孵育至所需时间点。每个时间点使用单独的培养板。

figure-protocol-4
图 4：三维细胞培养结构的制备。 移液后立即置于孔板中的含细胞 GelMA 结构，以及经紫外光（365 nm）交联后的状态。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 2：制备含细胞的三维结构。 在紫外光交联之前，使用简单的移液技术将水凝胶-细胞混合物沉积到12孔板中。请点击此处下载该文件。

8. 生物相容性测试

  1. 活/死细胞染色
    1. 将含细胞的支架在所需时间间隔内进行培养。
    2. 用无菌 PBS 轻柔洗涤。
    3. 在避光条件下，用含有 0.2% 碘化乙啶同二聚体-1（EthD-1）和 0.05% 钙黄绿素 AM（calcein AM）的 PBS 溶液孵育构建物 30 分钟。
    4. 使用配备钙黄绿素 AM（~495/515 nm）和 EthD-1（~495/635 nm）滤光片的荧光显微镜立即成像。标准的异硫氰酸荧光素（FITC）和德克萨斯红滤光片组分别适用于钙黄绿素 AM 和 EthD-1 的检测。
    5. 通过绿色胞质荧光识别活细胞，通过红色细胞核荧光识别死细胞。
      ​注意：平面图像可使用 ImageJ（Fiji）进行处理。所有比较样本的物镜、曝光时间、增益和照明强度保持一致，并仅作调整以避免信号饱和。为尽量减少自体荧光引起的误判，每次实验中所有样本均采用相同的采集设置，并使用不含细胞的支架/骨微粒构建物作为对照，以识别与生物材料相关的背景荧光模式。这些对照有助于我们在图像解读过程中区分颗粒来源的信号与真正的圆形细胞染色。
  2. AlamarBlue 定量
    1. 在完全培养基中配制 5% 的 AlamarBlue 工作液。
    2. 将支架置于 AlamarBlue 溶液中，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 2.5 小时，避光。
    3. 取 100 µL 上清液，设三个复孔转移至 96 孔板中，包括对照组。
    4. 在 360/40 nm 激发波长和 460/40 nm 发射波长下测定荧光强度。
    5. 将荧光值归一化至对照组，以确定相对代谢活性。

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结果

成功从人股骨头中分离出原代骨细胞，分离后约5天可在培养中检测到这些细胞。细胞呈星状形态，并形成了相互连接的网络结构，具有骨细胞形态的典型特征，表明分离、贴壁和存活均获得成功（图5）。

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图5：三维成骨细胞培养物的代谢活性。 在每个时间点对含有成骨细胞的构建物进行AlamarBlue代谢检测。与对照组相比，所有重复实验中均观察到显著差异（ANOVA，P = 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

本方案提供了一种简便且具有转化价值的方法，用于构建三维类骨结构，克服了现有方法的一些关键局限性，例如对昂贵生物打印机或专有基质材料的依赖13。通过将 GelMA 与人脱细胞骨细胞外基质8相结合，仅需使用常规实验室设备即可制备出具有生理相关性的结构。这种简便性使其可在资源有限的环境中推广应用，同时保留研究肌肉骨骼疾病机制所需的关键生物学信号。采用原代人骨细胞14和临床骨组织进一步增强了该模型的转化适用性，可在接近生理条件下实现与患者相关的骨疾病建模以及生物材料反应的评估6,15。以此平台为基础，可进一步开展更具针对性的研究，以探究特定的生物学指标，例如骨质疏松来源细胞的药物反应、骨细胞特异性基因表达谱的变化，以及与骨重塑相关的关键标志物（如 sclerostin 或 RANKL）的调控情况。

若干关键步骤对于确保可重复性和材料...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢康塞普西翁大学病理解剖学单位的 Carolina Delgado 博士提供的支持以及显微镜资源的使用许可。

作者感谢来自智利国家研究与科技发展署（ANID）的资助支持，项目编号为VIU24P0041和SUC260026。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮（Irgacure 2959）Sigma-Aldrich410896-10G水凝胶聚合光引发剂
AlamarBlue 细胞活力检测试剂 InvitrogenDAL1100用于定量细胞活力检测
抗生素-抗真菌剂（100´） Gibco15240-062培养基组分
细胞培养瓶（T75）SPL Life Sciences70075用于骨细胞培养
Ⅰ型胶原酶Gibco17100-017用于骨样本的酶消化
15 mL 锥形管SPL Life Sciences50015用于水凝胶制备
DarkDawn D15-365 nmDarkDawn-用于水凝胶的紫外交联
不含钙、镁的 DPBS 粉末Gibco21600069水凝胶溶剂，LIVE/DEAD 试剂盒溶剂
EDTA 二钠盐 2-HIDWinklerED-0760用于骨样本的酶消化
Eppendorf 离心机 5702Eppendorf5702000010用于骨微粒制备
分析纯乙醇Supelco1,00,98,32,511用于骨脱细胞（稀释至 70%），光引发剂溶剂
胎牛血清GibcoA52567-01培养基组分
猪皮来源明胶Sigma-AldrichG1890-500G水凝胶组分
HBSS（10´）Gibco14185-052用于骨髓样本洗涤
L-抗坏血酸-2-磷酸Sigma-AldrichA8960-5G培养基组分
LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒InvitrogenL3224用于定性活力/细胞毒性检测
MEM Alpha（1´）Gibco12571-063培养基组分
甲基丙烯酸酐Sigma-Aldrich276685-500G水凝胶组分
微量离心管Citotest4610-1844用于 AlamarBlue 和 LIVE/DEAD 染料的配制
NuncIon delta 表面 Thermoscientific15062812 孔板，用于样品接种
OLYMPUS BX43 荧光光源 Olympus U-LH100HGEvidentU-LH100HG荧光分析光源
RC-6 Plus 离心机Thermo Scientific Sorvall46910用于骨脱细胞和骨微粒制备
Synergy HTX 多功能酶标仪BioTek Instruments-分光光度计 
带针头注射器NIPROSY3-WN-R-03用于水凝胶过滤
96 孔组织培养板Jet BiofilTCP001096用于 AlamarBlue 细胞活力检测的 96 孔板
超声清洗机VWE97043-958用于骨样本的超声处理

参考文献

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