一个利用人类骨细胞和去细胞化细胞外基质进行建模肌肉骨骼疾病的三维骨培养平台

摘要

该方案描述了利用嵌入甲基丙烯化明胶（GelMA）水凝胶中的人类骨细胞，并辅以去细胞化的细胞外基质，制造三维骨骼构造。该方法成本低廉、可扩展，且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了转化平台。

摘要

建模骨质疏松等肌肉骨骼疾病需要体 外 平台，能够准确重现人体骨骼生物学的关键特征。传统的3D培养系统为细胞间和细胞基质相互作用提供了宝贵的见解，但其对昂贵材料、生物打印机或专业基础设施的依赖限制了其更广泛的应用。本文介绍了一种稳健且经济高效的方案，用于利用嵌入GelMA水凝胶中的人类骨细胞生成三维骨骼构造，辅以从捐赠股骨头获得的去细胞化细胞外基质（dECM）补充。这种基于移液的方法使得在生理温度（37°C）下，使用标准实验室设备制造可重复的骨骼状构造物。

所得构造体保持高活体和结构完整性，支持免疫荧光成像和分子分析等后续应用。患者来源的dECM的加入通过更好地反映人类骨骼重塑和疾病进展，增强了转化相关性。该方法为药物检测、再生医学和骨骼生物学机制研究提供了可访问且可扩展的平台。总体而言，该方案为高成本生物打印技术提供了实用替代方案，并可轻松适应其他组织特异性dECM源。

引言

该方法旨在通过结合GelMA与来自人类骨组织的dECM，建立一个具有成本效益且可重复性的3D细胞培养平台，用于建模包括骨质疏松症在内的肌肉骨骼疾病。该策略使得比传统二维培养更贴近生理微环境的骨骼构造物得以生成，支持在生物^{相关条件下研究}细胞间及细胞基质相互作用。使用患者来源的骨细胞和来自股骨头的临床dECM提升了转化价值，并在体外实验与临床研究需求之间建立了实际^联系。

该方法旨在解决现有3D培养和生物制造系统的关键局限性，这些系统通常需要生物打印机、专有生物材料或昂贵的消耗品（如Matrigel），限制了许多^3,4的可及性。此外，合成水凝胶常常无法重现矿化骨细胞外基质的生化复杂性或常驻骨细胞的^行为5。相比之下，该方案采用了人骨衍生的dECM，保留矿化成分、天然蛋白和信号分子，同时避免了增材^{制造技术相关的}基础设施需求6。

GelMA和dECM的结合带来了多项优势。GelMA支持细胞的粘附、存活性和分化，且可在37°C下处理，实现细胞封装，无需专用设备。使用低成本紫外（UV）源（365纳米）进行交联进一步提升可及性⁷.dECM补充富含合成替代物中缺失的组织特异性线索，提升骨生成相容性，并促进免疫荧光和分子剖析等后续检测^8。

该方法与当前开发人类相关骨骼模型的努力相契合，旨在减少对动物研究的依赖，而动物研究的翻译准确性常受物种间差异限制 ^1,9,10。该方案符合3Rs¹¹的原则，并可调整用于生成利用其他组织特异性dECMs构建构件，拓展了在软骨、皮肤和心血管组织工程中的潜在应用¹²。

总体而言，该技术为研究生理相关条件下的骨骼生物学提供了一个可访问且可扩展的平台。其与常规实验室基础设施的兼容性以及能够整合人体临床样本的能力，使其特别适合学术和医院研究团队。该方法不仅为进一步的骨骼过程研究提供平台，也有望成为再生医学和个性化治疗开发中更多转化应用的起点。

方案

该研究获得了康塞普西翁卫生服务科学伦理委员会的批准。人类骨组织是在智利康塞普西翁创伤医院接受髋关节置换手术的患者捐赠的股骨头上获得的，前提是他们获得了书面知情同意。样品在使用前储存在−80°C。所有程序均符合伦理使用人体组织研究的机构指南。所有人体骨组织均取自智利康塞普西翁创伤医院患者捐赠的股骨头，患者经知情同意并经康塞普西翁卫生服务科学伦理委员会批准。所有操作均符合人体组织使用的机构指南。

1. GelMA合成

1. 将10克A型明胶A溶解在100毫升磷酸缓冲盐盐水（PBS，pH 7.5）中，温度为60°C，持续搅拌。
2. 将温度降至50°C，并以0.5毫升/分钟速率加入5毫升甲基丙烯酸酐，轻微搅拌1–3小时。
3. 将反应混合物稀释5×加入预热至40°C的PBS以停止反应。
4. 用12–14 kDa膜对3–5升蒸馏水、40°C进行透析，持续5–7天，每天更换水。
   注意：（关键步骤）确保每天完全更换水以去除未反应的甲基丙烯酸酐。
5. 将透析溶液液冻干24小时，并将冻干GelMA保存在4°C下直到使用。

2. GelMA水凝胶制备

1. 准备10毫升的GelMA水凝胶，浓度分别为5、10或15 w/v%。
2. 将0.5、1.0或1.5克冻干GelMA溶解在50°C的9.5毫升去离子水中。
3. 将溶液冷却至37°C。
4. 加入0.5毫升Irgacure 2959光启动剂溶液（绝对乙醇中0.5 w/v%）。
5. 轻柔混合，保持溶液温度37°C，直到通过0.22微米醋酸纤维素膜过滤器进行无菌过滤。

3. 骨骼脱细胞化

1. 股骨头逐渐解冻至25°C。 将每个股骨头切成两半，然后切成更小的块。
2. 将乐曲浸泡在60°C的无菌蒸馏水中，进行超声处理15分钟（40千赫，连续）。
3. 将样品用300毫升预热、60°C、200转/分钟摇晃5分钟的蒸馏水洗涤。
4. 离心机在1850克，× 15分钟，温度为25°C。 重复洗涤和离心步骤三次。
5. 在含3%过氧化氢和0.02%过氧乙酸的溶液中，以40 kHz连续声波消毒10分钟，温度为60°C。
6. 将组织转移到300毫升70%乙醇中，连续以40 kHz进行超声波处理10分钟，温度为21°C。
7. 用300毫升蒸馏水清洗样品两次，在60°C下以200转/分钟摇晃10分钟，再以1850 × g 离心机在25°C下摇匀15分钟。
8. 首先，将骨头在-80°C预冻4小时，然后在宽基底下冻干24小时，以确保均匀干燥，避免样品高度过高，温度为0.05毫巴尔，温度为-40至-60°C。
   注意：（关键步骤）确保样品在容器内高度不超过2–3厘米，以防止冻干不完全。

4. 骨微粒制备

1. 将去细胞化的骨片放入250毫升的Erlenmeyer瓶中，放入灭菌溶液中，使用均质剂均匀化，直到得到均匀的白色溶液（补充视频1）。
2. 在1850 × g 离心机，25°C离心15分钟，丢弃上清液，并用300毫升蒸馏水在25°C、200转/分钟搅拌下清洗沉淀两次，持续10分钟。在1850 × g 下进行最后离心，25°C，持续15分钟。
3. 将所得材料以0.05毫巴在-40至-60°C的液溶干燥48小时，并在-80°C下储存，直到使用。
4. 用消毒过的陶瓷砂浆机械研磨冻干的皮质骨或髓质骨，直到得到细粉（见图1）。
5. 将粉末通过200微米的网或筛，称重最终材料，并在-80°C下储存。
   注意：（关键步骤）筛分前确保粉末完全干燥，以防止聚集和颗粒大小选择不准确。

补充视频1：骨骼均质化手术。使用均质器均匀化去细胞化的骨片，直到产生均匀的白色悬浮液。请点击这里下载此文件。

图1：骨微粒制备。（A） 用OV5均质剂均质后，去除细胞化的骨片，储存在-80°C。（B，C） 用于将去细胞化骨骼研磨成细粉的灭菌陶瓷砂浆。（D）筛选后最终去细胞化的骨微粒。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 骨凝胶制造

1. 将1克GelMA溶解在50°C的9.5毫升去离子水中，制备10 w/v%的GelMA。
2. 将溶液冷却至37°C，加入Irgacure 2959光启动剂溶液。
3. 将溶液保持在37°C，并使用0.22微米过滤器进行无菌过滤。
4. 添加1%的去细胞化骨微粒（DBMP）。
5. 在40°C下，仔细混合和移液器，避免产生气泡，直到获得均匀的悬浮液形成骨凝胶（BG）。
6. 将BG储存在4°C，最多可保存2周。
   注意：（关键步骤）在细胞掺入前，保持水凝胶高于凝胶温度（≥37°C），以避免过早凝固。

6. 骨细胞原级培养

1. 骨髓提取与初步洗除
   1. 使用无菌手术器械从股骨头内部提取并剁碎骨髓组织（见图2）。
   2. 将切碎的组织转移到无菌培养皿中。
   3. 用α-MEM培养基洗涤组织三次，并补充抗生素-抗真菌溶液（100 μg/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，0.25 μg/mL两性霉素）。
   4. 用Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗一次。
      注意：（关键步骤）尽量缩短组织取材与处理之间的时间，以保持细胞存活能力。
2. 酶消化
   1. 将组织在胶原蛋白I型溶液中，37°C下温和搅拌，孵育25分钟。
   2. 用HBSS洗。
   3. 重复步骤6.2.1–6.2.2，再加两次（共三次胶原酶消化）。
   4. 将组织在0.5毫毫米的乙二亚胺四乙酸（EDTA）中，在37°C下孵育25分钟。
   5. 用HBSS洗净，再重复EDTA步骤两次。
   6. 进行最后一次胶原酶I型消化（37°C下25分钟），随后进行HBSS洗净。
      注意：（排查）消化不完全可能导致细胞产量降低;如有需要，将酶培养延长5–10分钟。
3. 细胞恢复与培养
   1. 收集胶原酶溶液，并将最终的HBSS洗涤液转移到50毫升离心管中。
   2. 在室温下以1000× 克 离心5分钟。
   3. 丢弃上清液，将沉淀液重新悬浮于2毫升完整的α-MEM中。
   4. 将细胞悬浮液播种到两个T75培养瓶中，并在37°C与5%二氧化碳下孵育。
      注意：培养基应每2–3天更换一次，直到达到足够的水流（见图3）。

图2：骨髓组织取出。 （A）髋关节置换手术获得的股骨头，显示用于细胞分离的髓质区域。（B）在酶消化前，将髓质骨块切碎放入无菌培养皿中。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：原级骨细胞培养。骨细胞在从人类髓质骨分离后，以单层形式附着并增殖于T75体内。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 3D细胞培养

1. 在37°C预热BG水凝胶的量。
   注意：（关键步骤）确保工作区无风;冷却加速过早凝胶。
2. 分离培养骨细胞，并在500×克离心机中置于15毫升管内5分钟。
3. 将沉淀重新悬浮于200微升培养基中，并与BG水凝胶混合，最终细胞密度至少为每微升1000细胞（以下称为生物墨水）。
4. 用1000微升移液器抽取50微升生物墨水，并保持37°C直到沉积。
5. 每个构造体将50微升生物墨水移液器移入培养板的每个孔（补充视频2）;在室温下物理凝胶大约需5分钟（见图4）。
6. 将每个阱暴露在365 nm紫外光下1分钟，以实现不可逆的交联（0.30 J/cm^²）。
7. 加入培养基，并在37°C、5%_CO2 下孵育，达到所需的时间点。每个时间点用单独的板。

图4：三维细胞培养构造体制备。 移液后立即、紫外（365 nm）交联后，含有细胞载GelMA构造的孔板。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频2：3D细胞构造的制备。 在紫外交联前，使用简单的移液技术将水凝胶细胞混合物沉积到12孔板上。请点击这里下载此文件。

8. 生物相容性测试

1. 活死染色
   1. 在需要的时间间隔内培养含有细胞的支架。
   2. 用无菌PBS轻柔清洗。
   3. 在黑暗中用含有0.2%乙二聚体-1（EthD-1）和0.05%钙化素AM的活/死溶液在PBS中孵育构件30分钟。
   4. 使用带钙蛋白AM（~495/515纳米）和EthD-1（~495/635纳米）滤光片的荧光显微镜立即成像。标准荧光素异硫氰酸酯（FITC）和德州红滤光片组分别兼容钙蛋白AM和EthD-1检测。
   5. 通过绿色细胞质荧光识别活细胞，通过红色核荧光识别死细胞。
      注意：平面图像可以使用ImageJ（斐济）进行处理。所有比较样品的物镜、曝光时间、增益和照明强度保持不变，仅调整以避免信号饱和。为减少自发荧光引起的误解，每个实验中所有样本均保持相同的采集设置，并使用无细胞的支架/骨微粒构造的对照观察来识别与生物材料相关的背景荧光图案。这些对照组使我们在图像解读时能够区分粒子来源信号与真正的圆角细胞染色。
2. Alamarblue 量化
   1. 在全培养基中准备5%的Alamarblue工作溶液。
   2. 在37°C、5%二氧化碳环境下，将支架孵育2.5小时，避免光照。
   3. 将100微升上清液三份传递到96孔板上，包括对照组。
   4. 测量360/40纳米激发和460/40纳米发射的荧光。
   5. 将荧光值归一化至对照组，以确定相对代谢活性。

结果

原级骨细胞成功从人类股骨头分离出来，并在取出后约5天内可在培养中检测到。细胞呈现星状形态，形成骨细胞形态特征的相互连接网络，确认了成功的分离、附着和存活能力（见图5）。

图5：三维骨细胞培养的代谢活性。 Alamarblue对含骨细胞结构的各时间区间进行代谢分析。所有复制体中均观察到相较对照组的显著差异（方差分析，P = 0.05）。 请点击此处查看该图的放...

讨论

本方案提供了一种可访问且可转化的方法，用于生成三维类骨构造，解决了当前方法中依赖昂贵生物打印机或专有矩阵等关键局限性¹³。通过将GelMA与人类去细胞化的骨外基质8结合，只需标准实验室设备即可制造出具有生理学意义的构造结构。这种简洁性使得在资源有限的环境中被采用，同时保留了研究肌肉骨骼疾病机制的关键线索。使用原发人类骨细胞¹⁴和临床骨组织，进一步增强了转化适用性，支持患者相关骨骼疾病的建模及在近生理条件下生物材料反应的评估（^6,15）。以该平台为基础，可以开展更有针对性的研究，以探讨骨质疏松源自细胞的药物反应、骨细胞特异性基因表达谱的变化，以及与骨骼重塑相关关键标志物（如硬骨蛋白或RANKL）的调控。

确保可重复性和材料性能需要几个关键步骤。在GelMA合成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基丙氧基苯丙酮（Irgacure 2959）	Sigma-Aldrich	410896-10G	水凝胶聚合光引发剂
AlamarBlue细胞活力试剂	Invitrogen	DAL1100	用于定量活力分析
抗生素-抗真菌（100'）	Gibco	15240-062	培养基成分
细胞培养瓶（T75）	SPL生命科学	70075	用于成骨细胞培养
胶原酶1型	Gibco	17100-017	用于骨样本的酶解
15 mL锥形管	SPL生命科学	50015	用于水凝胶制备
DarkDawn D15-365 nm	DarkDawn	-	用于水凝胶的UV交联
DPBS粉末，无钙，无镁	gibco	21600069	水凝胶溶剂，LIVE/DEAD试剂盒溶剂
EDTA二钠盐2-HID	Winkler	ED-0760	用于骨样本的酶解
Eppendorf离心机5702	Eppendorf	5702000010	用于骨微粒制备
纯乙醇（分析用）	Supelco	1,00,98,32,511	用于骨去细胞化（稀释至70%），光引发剂溶剂
胎牛血清	Gibco	A52567-01	培养基成分
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	G1890-500G	水凝胶成分
HBSS（10'）	Gibco	14185-052	用于骨髓样本洗涤
L-抗坏血酸2-磷酸盐	Sigma-Aldrich	A8960-5G	培养基成分
LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒	Invitrogen	L3224	用于定性活力/细胞毒性分析
MEM Alpha（1'）	Gibco	12571-063	培养基成分
甲基丙烯酸酐	Sigma-Aldrich	276685-500G	水凝胶成分
微离心管	Citotest	4610-1844	用于alamarBlue和LIVE/DEAD染料制备
NuncIon delta表面	Thermoscientific	150628	12孔板用于样本接种
OLYMPUS BX43荧光光源Olympus U- LH100HG	Evident	U- LH100HG	荧光分析光源
RC-6 Plus离心机	Thermo Scientific Sorvall	46910	用于骨去细胞化和骨微粒制备
Synergy HTX多模式读取器	BioTek Instruments	-	分光光度计
带针注射器	NIPRO	SY3-WN-R-03	用于水凝胶过滤
组织培养板96孔	Jet Biofil	TCP001096	96孔用于alamarBlue活力分析
超声波清洗器	VWE	97043-958	用于骨样本超声波处理