网络药理学与实验验证探讨肉桂对抗股骨头 steroid 性坏死的作用

摘要

本研究旨在通过整合网络药理学、分子动力学模拟和动物实验，探讨肉桂在治疗股骨头坏死中的潜在作用机制。

摘要

股骨头甾体诱导性骨坏死（SONFH）可导致严重疼痛和活动受限，显著影响患者的生活质量。已有研究表明，肉桂（Cinnamomi Cortex，CC）可有效缓解该病症，但其作用机制尚不明确。本研究旨在鉴定CC的活性成分，并探讨其在SONFH中的作用机制。通过HERB 2.0、PubChem和SwissADME数据库筛选活性成分，并利用Swiss Target Prediction数据库预测其相应靶点。结合GEO、DisGeNET、GeneCards和OMIM数据库获取SONFH相关靶点，并与化合物相关靶点取交集以确定共同靶点。使用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。采用分子对接（MD）和分子动力学模拟验证最具潜力的化合物-靶点相互作用。研究人员共鉴定出563个潜在靶点，其中包括61个与SONFH相关的靶点，AKT1、HIF-1α和STAT3为其中的核心节点。KEGG富集分析表明，HIF-1α信号通路是关键作用机制之一。此外，动物实验结果显示，CC的活性组分可有效减轻SONFH小鼠模型中股骨头的结构损伤。研究结果提示，CC可能通过协调缺氧适应，并调控血管生成与成骨过程，从而改善SONFH。

引言

股骨头 steroid 性坏死（SONFH）是一种重要的骨关节疾病，由多种因素导致股骨头血供中断或减少所致¹。骨细胞及骨髓成分的死亡可引起股骨头内部结构损伤以及髋关节功能障碍²。临床上，患者通常表现为髋部疼痛和活动受限³。若未得到有效的治疗，80% 的 SONFH 患者将进展为股骨头塌陷，需接受全髋关节置换术⁴。该病给患者带来严重的心理压力和沉重的经济负担⁵。目前临床实践推荐联合使用抗凝药物、溶栓药物、血管扩张剂和降脂药物治疗 SONFH，虽显示出一定的临床潜力，但总体疗效仍有限⁶。

近年来，传统中医药（TCM）在治疗股骨头坏死（SONFH）方面 increasingly 显示出积极影响⁷。中医药在缓解症状、控制疾病进展、改善关节活动度及提升患者生活质量方面具有潜力⁸。临床上，肉桂（CC）及其组分已被广泛用于改善SONFH，并表现出显著疗效⁹。CC中富含多种生物活性物质，具有抗炎、抗氧化、促进血管生成及改善微循环等多种生物学作用¹⁰。既往在骨组织工程与骨代谢领域的研究表明，肉桂醛作为CC的主要活性成分，可调节与骨重建相关的信号通路¹¹。初步研究显示，右归丸（YGPs）可通过促进血管生成和调节炎症反应，对SONFH发挥治疗潜力¹²。作为YGPs中的君药，CC具有温阳益气、通经活络之功效，对SONFH产生有益的治疗作用¹³。然而，其疗效的确切机制尚不明确。阐明CC改善SONFH所涉及的多靶点调控网络，不仅有助于理解其药理本质，也将促进其合理临床应用及相关干预策略的开发。整合生物信息学与网络药理学为解析其作用机制提供了有效途径¹⁴。

网络药理学可鉴定中药中的生物活性成分，并预测这些药物成分与基因靶点之间的关联¹⁵。分子动力学（MD）用于验证候选活性化合物与关键治疗靶点之间的结合相互作用。分子动力学通过模拟运动，利用牛顿力学评估配体-受体结合的稳定性与柔性¹⁶。作者结合网络药理学、分子动力学及分子动力学模拟，系统研究了苍术（CC）对股骨头坏死（SONFH）的潜在作用。研究结果为今后深入探讨苍术改善股骨头坏死的药效物质基础及其作用机制提供了参考依据。研究流程图见图1。

方案

所有实验方案均经浙江中医药大学动物实验伦理委员会（IACUC-20240708-22）批准，并遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理与使用指南》。本实验使用了20只10周龄、体重为20至22 g的雌性C57BL/6J小鼠，小鼠来源于浙江中医药大学动物中心。本方案中使用的所有试剂、设备和软件清单详见材料表。

筛选 CC 的活性化合物及其作用靶点
通过 Herb 2.0¹⁷ 数据库，以“CC”为关键词检索 CC 的化学成分。过滤掉无 PubChem ID 或具有相同 ID 的化合物。随后合并并去除重复项，获得与 CC 对应的靶点。基于 Lipinski 五规则（分子量 ≤ 500，miLogP ≤ 5，nOHNH ≤ 5，nOH ≤ 10）¹⁹，利用 PubChem 数据库¹⁸ 进行初步筛选。作者通过 PubChem 数据库确定每种化学成分的 SMILES 表示形式。使用 SwissADME 数据库，筛选具有“高”胃肠道吸收能力且药物相似性（Druglikeness）中“是”（Yes）的数量 ≥2 的化合物²⁰。利用 SwissTargetPrediction 数据库²¹ 提取预测概率大于零的靶蛋白。然后合并并去除重复项，最终获得与 CC 对应的作用靶点。

与SONFH相关的基因靶点汇编
SONFH相关靶点从以下数据库获取：DisGeNET数据库²²；GeneCards数据库²³；OMIM数据库²⁴以及GEO数据库²⁵。作者从OMIM和DisGeNET数据库下载并去除了重复的SONFH基因。在去除重复项后，从GeneCards数据库共获得233个与疾病相关的靶点。所有检索到的靶点相关性评分均大于0，并被纳入后续分析。所获取基因中的最低相关性评分为6.48。与SONFH相关的差异表达基因（DEGs）来自GEO数据库中GPL15207平台的GSE123568系列。使用R语言中的limma包校正批次效应，并以|logFC| > 1且P < 0.05为标准筛选差异表达基因（DEGs）²⁶。采用ggplot2包绘制火山图以可视化DEGs的分布情况，并生成热图展示分析结果。通过使用R语言中的Venn包去除重复靶点，构建了SONFH疾病靶点库。

构建蛋白质-蛋白质相互作用网络
基于穿仓（CC）活性成分的预测靶点与股骨头坏死（SONFH）相关靶点，使用 Venny 2.1.0²⁷ 绘制了维恩图。为获取蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据，作者将靶点导入 STRING 数据库²⁸，物种筛选条件限定为“智人（Homo sapiens）”，置信度指数 ≥0.4。作者使用 Cytoscape 3.7.2 构建 PPI 网络并识别关键靶点，采用度中心性（DC）分析 PPI 网络中的关键靶点，参数筛选标准为大于中位数两倍以上。为进一步明确关键靶点，使用了 Cytoscape 的附加插件。

使用基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行富集分析
通过DAVID数据库对CC和SONFH的共同靶点进行GO和KEGG富集分析²⁹。为了可视化展示排名前10的GO条目和排名前20的KEGG通路，采用Wei Sheng Xin³⁰绘制富集气泡图。

网络构建
通过草药-化合物-靶点（H-C-T）和化合物-靶点-通路（C-T-P）网络，阐明了川芎（CC）改善股骨头坏死（SONFH）的分子机制。网络图由 Cytoscape 3.10.3 软件绘制。H-C-T 网络基于川芎中的活性化合物及其共同作用的靶点构建，随后使用“Analyze Network”工具进行分析。为加深对通路、化合物与靶点之间关系的理解，利用 Network Tools 将排名前 20 的通路及其相关靶点和化合物整合构建为 C-T-P 网络。

分子对接验证
核心靶点：HIF-1α、STAT3、ESR1、AKT1、SRC、ERBB2、CASP3 和 EGFR 来源于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析结果。通过 UniProt 数据库³¹ 检索靶点信息，并限定物种为人类，再经 RCSB PDB 数据库³² 进行验证。选择分辨率相对较高的人源蛋白结构。活性成分来源于 C-T-P 网络分析，其对应的三维结构从 PubChem 数据库以 mol2 格式下载。每个文件在 Chem3D 中打开并进行能量最小化处理。随后，作者使用 AutoDockTools³³ 软件对受体蛋白进行脱水、加氢处理，并计算 Gasteiger 电荷。配体与受体均保存为 PDBQT 格式。根据结合位点的空间位置及结合能力，评估对接的可行性与稳定性。利用 AutoDock Vina 预测对接网格盒和大分子结构。本研究中，配体的所有可旋转键均允许自由旋转，而受体则设定为刚性结构。对接评分反映受体与配体之间的结合亲和力，评分越低，结合亲和力越高。依据此原则，作者选择结合能最有利的构象，进一步分析配体与蛋白之间的结合相互作用。可视化结果由 PyMOL 软件展示。

分子动力学模拟
使用 GROMACS³⁴ 和 CHARMM36 力场进行分子动力学模拟。将蛋白质-配体复合物置于立方周期性模拟盒子中心，溶质与盒子边界的最小距离为 1.0 nm，并采用 SPC216 水模型对体系进行溶剂化。通过添加适量的 Na⁺ 和 Cl⁻ 反离子使体系保持电中性。采用最陡下降法进行能量最小化，随后使用共轭梯度法消除不利的原子接触。长程静电相互作用采用粒子网格埃瓦尔德（PME）方法计算，截断距离为 10 Å。所有涉及氢原子的共价键使用 LINCS 算法进行约束。温度通过 V-rescale 恒温器维持在 300 K，压力通过 Berendsen 恒压器在 1 bar 下以各向同性耦合方式进行控制。在平衡阶段，对配体施加位置限制，力常数为 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻²。在能量最小化完成后，体系先后进行 2 ns 的 NVT 和 2 ns 的 NPT 平衡模拟，随后进行 100 ns 的生产阶段分子动力学模拟，时间步长为 2 fs。每 10 ps 记录一次原子坐标，用于后续轨迹分析。

在SONFH小鼠模型中的实验验证
动物及SONFH模型的建立
选取20只10周龄、体重20至22 g的雌性C57BL/6J小鼠，购自浙江中医药大学动物中心。小鼠在受控环境中适应7天，期间可自由摄食和饮水。所有小鼠随机分为四组（每组n = 5）：对照组、SONFH组、SONFH + CC低剂量（CC-Low，7.5 g/kg/d）组和SONFH + CC高剂量（CC-High，15 g/kg/d）组。SONFH模型的建立参照既往方法。简言之，在第0天，SONFH组、SONFH + CC-Low组和SONFH + CC-High组的小鼠接受两次静脉注射脂多糖（LPS；20 µg/kg）。随后，在LPS注射后24小时开始，每隔24小时进行一次肌肉注射甲基泼尼松龙（MPS；40 mg/kg），共注射三次。治疗组小鼠从最后一次MPS注射当天起，每日经口灌胃给予CC提取物，持续6周。对照组小鼠在相应时间点给予等体积生理盐水。

样本采集与制备
在为期6周的治疗期结束后，处死小鼠。仔细分离并获取双侧股骨头。对于每只动物，左侧股骨头在4 °C下固定48小时，用于后续脱钙及石蜡包埋。右侧股骨头固定后，不进行脱钙，直接用于显微CT扫描。

组织学分析（ABH 染色）
脱钙并经石蜡包埋后，对股骨头切片采用阿利新蓝/苏木精（Alcian Blue/Hematoxylin, ABH）染色法以评估骨坏死的改变。简言之，切片在1%阿利新蓝（pH 2.5）中染色30分钟，冲洗后用 Harris 苏木精复染。经脱水和封片后，在光学显微镜下观察切片。 骨坏死的定量分析 由两名不知分组情况的观察者使用 ImageJ 软件完成。 空陷窝率 通过计算每个样本软骨下区三个随机选择的高倍视野中（空陷窝数/总陷窝数）×100% 得出。 核固缩率 的计算方法与此类似。

显微计算机断层扫描（Micro-CT）分析
使用高分辨率显微CT扫描仪分析股骨头的三维骨微结构。固定后的样本以10 µm的分辨率进行扫描（70 kV，114 µA）。采用CTAn软件重建并分析涵盖主要承重区域的标准化球形感兴趣体积（VOI）。定量分析以下 形态计量参数 ：骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、 和骨小梁分离度（Tb.Sp）。

免疫荧光（IF）染色
为评估骨微环境，对石蜡切片进行免疫荧光染色。经过抗原修复和封闭后，切片与以下一抗在4 °C下孵育过夜：兔抗HIF-1α抗体（1:200）、兔抗ALP抗体（1:300）和兔抗VEGF抗体（1:150）。洗涤后，切片与荧光标记的二抗混合液孵育：Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG。细胞核用DAPI复染。使用荧光显微镜在一致的曝光条件下采集图像。 每个标志物的相对荧光强度 通过ImageJ软件在每样本三个视野中进行定量分析。

统计学分析
所有定量数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。采用 GraphPad Prism 软件（版本 9.0）进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验，以确定各组之间的统计学差异。P 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

确定穿山龙（CC）的活性成分及预测靶点，并构建“药材-成分-靶点”（H-C-T）网络。
为探究穿山龙（CC）关键成分及其在股骨头坏死（SONFH）改善中的作用机制，作者利用 HERB 2.0 数据库筛选出所有穿山龙（CC）的成分。在 209 个候选活性成分中，共发现 85 个可能具有生物活性的化合物（补充表 1）。通过 Swiss Target Prediction 平台预测并剔除重复及无效条目后，获得与这些穿山龙（CC）成分对应的 563 个潜在作用靶点（补充表 2）。作者已成功鉴定出穿山龙（CC）的活性成分及其作用靶点。

为了研究与股骨头坏死（SONFH）发生和进展相关的分子机制，并鉴定潜在的生物标志物靶点。对 GEO 数据库中 GSE123568 数据集的分析鉴定出与 SONFH 相关的差异表达基因（DEGs），包括 207 个上调基因和 216 个下调基因。425 个差异表达基因的火山图如图 2A所示，而按表达水平排序的前 60 个差异表达基因的表达模式以热图形式展示于图 2B，颜色强度反映经对数转换后的表达值。DisGeNET、OMIM 和 GeneCards 数据库提供了与 SONFH 相关的 711 个靶点。结合来自 GEO 数据库的 425 个差异表达基因，共获得 1136 个与 SONFH 相关的靶点。在去除重复项后，最终确认了 1115 个与 SONFH 相关的靶点，如图 2C所示。 作者已初步建立了 SONFH 的疾病靶点文库。

为确定靶点和主要成分，对穿参（CC）的563个靶点与SONFH相关靶点1115个进行交集分析，得到61个共同靶点（图3A 和补充表3），并将这些靶点导入Cytoscape 3.10.3构建“H-C-T”网络（图3B）。该网络包含147个节点和413条边。拓扑学分析显示，(S)-4-壬内酯（degree：16）、异均葛根醇（Isohomogenol，degree：15）、乙酸橙花酯（Neryl acetate，degree：14）、野葛内酯A（Melilotocarpan A，degree：14）和3-甲氧基肉桂醛（3-methoxycinnamaldehyde，degree：13）与蛋白靶点的连接度最高。

蛋白质相互作用网络的构建与拓扑学分析。
为了进一步探究川芎（CC）改善无菌性股骨头坏死（SONFH）的作用靶点，将61个共同靶点导入STRING数据库后，使用Cytoscape 3.10.3软件可视化蛋白质相互作用（PPI）网络。该网络包含60个节点和463条边。在图4A中，节点的颜色和大小由浅色、小尺寸逐渐变为深色、大尺寸，表示节点度值从低到高递增。MCODE插件将这些靶点聚类为两个功能模块（图4A），其中模块1包含23个节点和216条边，得分为19.636。为进一步表征网络结构，采用度中心性（DC）、介数中心性（BC）和接近中心性（CC）作为拓扑学参数指标。以这些参数的中位数作为阈值，作者筛选出8个核心靶点（图4B）。CytoHubba插件利用MCC算法对节点进行排序，鉴定了排名前10的基因（图4C）。

GO 富集分析
为进一步探究 CC 在股骨头坏死（ONFH）改善中的作用机制，对 61 个潜在靶点进行了 GO 富集分析，涵盖生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三个方面。共富集到 435 个 GO 条目，包括 293 个 BP 条目、41 个 CC 条目和 101 个 MF 条目。这些结果见补充表 4、5和6。图 5A通过气泡图直观展示了排名前 10 的富集 BP、CC 和 MF 条目。分析结果表明，BP 条目主要与信号转导、RNA 聚合酶 II 介导的转录正向调控、凋亡过程的负向调控、DNA 模板化转录的正向调控以及 RNA 聚合酶 II 介导的转录负向调控相关。MF 条目主要涉及蛋白质结合、金属离子结合和相同蛋白质结合。CC 分析结果显示，大多数靶点主要定位于细胞质、膜结构和质膜。

KEGG 分析
为了揭示 CC 可能通过哪些潜在的生化机制改善激素性股骨头坏死（SONFH），进行了 KEGG 通路富集分析，以阐明 CC 改善 SONFH 的生化机制。采用 P < 0.05 且 FDR < 0.05 作为筛选标准，共鉴定出 48 个 KEGG 富集条目（补充表 7）。根据富集倍数（Fold Enrichment）和基因计数，将前 20 条显著富集的通路通过气泡图和柱状图进行可视化展示（表 1、图 5B 和 5C）。使用 Cytoscape 3.10.3 构建了一个包含 167 个节点和 589 条边的成分-靶点-通路（C-T-P）网络（图 5D）。GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析结果表明，CC 对 SONFH 的作用主要与卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、HIF-1 信号通路以及脂质代谢与动脉粥样硬化相关。

分子对接验证
为评估活性化合物与关键靶点之间的潜在相互作用，将C-T-P网络中的10种化合物——茴香脑（anethole）、野苜蓿素A（melilotocarpan A）、乙酸橙花酯（neryl acetate）、辛酸（caprylic acid）、异homogenol（isohomogenol）、3-甲氧基肉桂醛（3-methoxycinnamaldehyde）、(S)-4-壬内酯（(s)-4-nonanolide）、肉豆蔻醚（myristicin）、冰片（borneol）和乙酸肉桂酯（cinnamyl acetate）——与关键靶点AKT1、HIF-1α、STAT3、ESR1、CASP3、SRC和EGFR进行分子对接。所有化合物-靶点组合的完整对接结果汇总于补充表8，化合物、靶点及对接参数的详细信息见补充表9。图6展示了结合能分布的热图。

总体而言，多个化合物-靶点对表现出相对有利的结合亲和力，较低的结合能值表明预测的相互作用更为稳定。值得注意的是，分子对接结果显示，不同化合物与靶点之间的结合亲和力均存在明显异质性。某些化合物（如野苜蓿素A）在多个靶点上 consistently 表现出相对较强的结合亲和力，而其他化合物则表现出中等或较弱的相互作用，提示不同化合物对预测的药理效应贡献可能并不均等。

此外，不同靶点之间也观察到变异性。例如，某些靶点如 STAT3 和 EGFR 与多种化合物表现出相对较弱或中等的结合亲和力，部分数值接近 -5.0 kcal/mol，而与 AKT1 或 SRC 等靶点相比则较低。该模式表明，并非所有核心靶点都必然作为已鉴定化合物的直接高亲和力结合伙伴，而可能在相互作用网络中发挥间接调控作用。此类差异可能与配体和蛋白质结合位点之间的结构相容性差异以及靶点自身的固有特性有关。

在所评估的配对中，AKT1 与苜蓿酚A的结合能最低（-9.6 kcal/mol），表明其可能存在有利的相互作用。图7展示了该复合物的预测结合模式。具体而言，AKT1的SER205与苜蓿酚A、茴香脑和肉豆蔻素形成氢键。此外，预测苜蓿酚A还可与HIF-1α的GLY309、STAT3的LEU438和THR440、ESR1的SER433和ARG412，以及SRC的ARG500和GLU510形成氢键。

为筛选代表性候选化合物，采用各靶标最低结合能，并设定结合能阈值≤ -5.0 kcal/mol，以指示相对稳定的相互作用。根据上述标准，鉴定出蜜果草素A（melilotocarpan A）、茴香脑（anethole）和肉豆蔻素（myristicin）为潜在的关键化合物。总体而言，CC的大多数活性成分均显示出与所选治疗靶标发生潜在相互作用的可能性，其中部分化合物在多个靶标中表现出相对更强的结合趋势。然而需要注意的是，分子对接（MD）是一种简化的计算方法，仅能对潜在相互作用提供初步预测，可能无法充分考虑蛋白质的柔性及复杂的生物环境因素。因此，应谨慎解读这些结果，所观察到的相互作用并不构成直接结合的确凿证据。

分子动力学模拟
为了进一步评估复合物的稳定性，作者选择了 AKT1-芒柄花环丙烷 A、HIF-1α-芒柄花环丙烷 A 和 STAT3-芒柄花环丙烷 A 复合物进行分子动力学模拟。在预测的靶点中，STAT3 和 HIF-1α 因其在蛋白质相互作用网络中的核心作用及其与股骨头坏死（SONFH）病理过程的生物学相关性而被选中进行分子动力学模拟。STAT3 在蛋白质相互作用网络中表现出最高的连接度之一，提示其可能在多个信号通路中发挥调控作用。HIF-1α 被选中是因为 KEGG 富集分析将 HIF-1 信号通路鉴定为与骨坏死中血管生成及缺氧适应最相关的通路之一。

同时，作者选择AKT1作为代表性靶点，因其具有较高的分子对接得分，并且与股骨头坏死（SONFH）的病理特征，特别是缺氧诱导的血管生成和骨再生，具有直接相关性。由于计算资源的限制，本研究选取了三个代表性复合物进行详细的分子动力学（MD）模拟，这是基于网络药理学的分子模拟研究中常用的策略。均方根偏差（RMSD）可有效评估蛋白-配体复合物的构象稳定性，较低的RMSD值表明结构更稳定。如图8A所示，AKT1-芒柄花次碳A复合物在前12 ns内完成弛豫，随后进入稳定平台期，在50–55 ns处仅出现短暂波动，之后迅速恢复平衡。整个模拟过程中的总体RMSD约为0.369 nm。图8B显示，HIF1A-芒柄花次碳A复合物在前16 ns内完成弛豫，随后维持稳定的平台状态，在38–42 ns之间出现短暂波动，之后迅速重新稳定。该复合物的总体RMSD为0.25 nm。在 图8C中，STAT3-芒柄花次碳A复合物在0.3 ns内即完成弛豫，随后达到稳定平台期，在5–80 ns之间出现短暂波动。整个模拟过程的总体RMSD约为0.21 nm。如图所示，AKT1-芒柄花次碳A、HIF-1α-芒柄花次碳A以及STAT3-芒柄花次碳A复合物均保持稳定，未出现显著变化，表明其结合状态相对稳定。

使用均方根波动（RMSF）评估了蛋白质中氨基酸残基的灵活性。 图9A全局平均残基波动约为0.17 nm，表明稳定性主要由结构核心和结合口袋维持。较高的柔性主要局限于内在具有移动性的区域，如末端片段和环区，而非口袋核心区域。众所周知，这些区域在本质上具有较高的柔性。 图9B 结果显示，约94%的残基其RMSF值低于0.20 nm，仅有约6%超过0.30 nm，表明蛋白主链及内部残基的波动处于稳定范围内。图9C显示，残基的平均全局RMSF值约为0.17 nm，数据中未发现超过0.15 nm的波动，表明结合口袋在整个模拟过程中保持稳定的构象。AKT1-芒柄花次烷A和HIF-1α-芒柄花次烷A复合物均表现出强而稳定的相互作用。

氢键对于促进蛋白质-配体相互作用至关重要。图10A显示，AKT1-苜蓿酚A复合物通常形成一个氢键，氢键数量在0到2之间变化。苜蓿酚A与HIF-1α之间的距离小于0.35 nm。AKT1常与苜蓿酚A在邻近区域发生相互作用。HIF-1α-苜蓿酚A复合物形成0到2个氢键，主要为一个氢键，如图10B所示。在图10C中，STAT3-苜蓿酚A复合物的氢键数量为0到4个。大多数情况下，苜蓿酚A与HIF-1α之间的A原子距离小于0.35 nm。HIF-1α-苜蓿酚A复合物可形成1-3对近距离接触，有时甚至可达7-9对。这表明小分子与靶标蛋白之间存在有效的氢键相互作用。综上所述，AKT1-苜蓿酚A和HIF-1α-苜蓿酚A复合物均表现出稳定性和结合强度。

CC 抑制 SONFH 小鼠的炎症反应和细胞凋亡
通过 ABH 染色进行的组织学分析显示，SONFH 组出现明显的骨坏死改变，表现为空骨陷窝增多、核固缩以及小梁结构紊乱；而经 CC 治疗后，这些病理特征明显减轻（图 11A）。定量分析证实，与 SONFH 组相比，CC 治疗组的空骨陷窝比例和核固缩比例显著降低（图 11B–C）。显微 CT 分析显示，SONFH 组存在严重的小梁骨丢失，而给予 CC 后该现象得到部分逆转（图 11D）。一致地，CC 治疗显著提高了 BV/TV 和 Tb.Th，同时相对于 SONFH 组降低了 Tb.Sp（图 11E–G）。免疫荧光染色显示，SONFH 组 HIF-1α 表达升高、ALP 水平降低，并伴有 VEGF 表达改变。CC 治疗可调节 HIF-1α 和 VEGF 的表达，并增强 ALP 信号，提示骨微环境和成骨活性得到改善 （图 11H）。

数据可用性：
本研究中使用或分析的数据集可通过以下链接获取：https://zenodo.org/records/19730455。

图1： CC改善SONFH的网络药理学研究策略流程图。 图1显示，本研究从数据库中筛选出CC活性成分的潜在靶点，并以SONFH为核心疾病。将这些靶点与疾病相关靶点取交集后，构建“成分-靶点-通路”网络以及GO和KEGG功能富集分析。随后采用分子对接和分子动力学模拟评估关键成分与核心靶点之间的结合亲和力，最终通过实验验证进行确认。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：与SONFH相关的交集靶点筛选。（A）火山图显示疾病样本中差异表达基因的分布情况。红色点表示上调基因，蓝色点表示下调基因，灰色点表示无显著差异表达的基因。（B）热图显示60个差异表达基因的表达模式，其中列表示样本，行表示基因。（C）维恩图显示从不同数据库获得的疾病相关靶点的重叠情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：CC与SONFH交集靶点的筛选。（A）维恩图展示了CC中活性成分预测靶点（黄色）与SONFH相关疾病靶点（紫色）之间共享的61个共同靶点的分布情况。（B）中药-化合物-靶点（H-C-T）网络展示了化合物与其对应靶点之间的相互作用关系。蓝色方形节点代表疾病，绿色方形节点代表活性化合物，橙色方形节点代表共同靶点。边线表示化合物与其靶点之间的相互作用。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析鉴定候选靶点。 （A）使用MCODE插件进行聚类的PPI网络。（B）在PPI网络中进行拓扑筛选的示意图流程。（C）通过CytoHubba插件从PPI网络中提取的关键基因。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：61 个共有靶点的 GO 富集分析结果与 KEGG 通路富集分析。（A）气泡图显示 BP、CC 和 MF 的前 10 个 GO 富集分析条目。（B）气泡图展示前 20 条显著富集的 KEGG 通路。（C）基于 KEGG 功能分类的前 20 条富集通路分布情况。（D）C-T-P 网络示意图，揭示 CC 可能改善股骨头坏死的潜在作用机制。请点击此处查看该图的放大版本。

图6： CC活性化合物与关键靶点之间相互作用的结合能热图（kcal/mol）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 7：关键靶点与特异性活性化合物的结合模式。 AKT1-刺甘草异黄酮A（A1）、HIF-1α-刺甘草异黄酮A（B1）、STAT3-刺甘草异黄酮A（C1）、ESR1-刺甘草异黄酮A（D1）、CASP3-刺甘草异黄酮A（E1）、SRC-刺甘草异黄酮A（F1）、EGFR-刺甘草异黄酮A（G1）、AKT1-茴香脑（H1）、AKT1-肉豆蔻素（I1）。对应的（A2）、（B2）、（C2）、（D2）、（E2）、（F2）、（G2）和（H2）分别展示其二维结合模式。（I2）未显示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：分子动力学（MD）的RMSD。 （A）AKT1-Melilotocarpan A复合物的RMSD值。（B）HIF-1α-Melilotocarpan A复合物的RMSD值。（C）STAT3-Melilotocarpan A复合物的RMSD值。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 9：分子动力学（MD）的 RMSF。（A）AKT1-Melilotocarpan A 复合物的 RMSF 值。（B）HIF-1α-Melilotocarpan A 复合物的 RMSF 值。（C）STAT3-Melilotocarpan A 复合物的 RMSF 值。请点击此处查看此图的放大版本。

图10：分子动力学中的氢键。（A）AKT1-Melilotocarpan A 复合物的氢键数值。（B）HIF1A-Melilotocarpan A 复合物的氢键数值。（C）AKT1-Melilotocarpan A 复合物的氢键数值。请点击此处查看此图的放大版本。

图11： CC抑制股骨头中的炎症反应和细胞凋亡，从而改善SONFH。（A）ABH染色的代表性股骨头切片。空陷窝以黑色箭头指示，固缩核以箭头指示。（B–C）空陷窝比例（B）和固缩核数量（C）的定量分析。n = 5。（D）股骨头的代表性三维显微CT重建图像。（E–G）显微CT参数的定量分析，包括骨体积分数（BV/TV）、小梁分离度（Tb.Sp）和小梁厚度（Tb.Th）。（H）股骨头切片中HIF-1α、VEGF和ALP的代表性免疫荧光染色；细胞核用DAPI复染。数据以均值±标准差表示（n = 5）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。

术语		富集倍数	P值	计数	用户ID
膀胱癌		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
HIF-1信号通路		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR,VEGFA,CASP3,ERBB2,KDR,PDCD4,PTPN6
EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药		16.66	3.84E-07	8	CCR1,CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
黏附连接		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300,PTGS2,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA
内分泌耐药		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NOS2,NOS3,ERBB2,STAT3, SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
癌症中的蛋白聚糖		11.43	1.19E-10	14	CXCL8,SRC,NOS3,CASP3,STAT3,PPARG,MMP9,BCL2L1,NFE2L2
松弛素信号通路		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NOS2,NOS3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
甲状腺激素信号通路		9.56	7.64E-05	7	NOS2,SRC,NOS3,MMP2,NOS1,MMP9,EGFR,VEGFA
流体剪切应力与动脉粥样硬化		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
乙型肝炎		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
JAK-STAT信号通路		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
人巨细胞病毒感染		7.34	6.2E-06	10	CREBBP,CASP3,EP300,TYK2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
脂质与动脉粥样硬化		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
癌症中的微小RNA		6.25	2.06E-06	12	CREBBP,SRC,ERBB2,EP300,PTPN6,PTPRF,EGFR
化学致癌作用 - 受体激活		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
癌症中的通路		5.94	6.64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
钙信号通路		5.90	0.00011	9	KAT2B,CREBBP,SRC,EP300,HIF1A,ESR1,MTOR
人乳头瘤病毒感染		4.00	0.00324	8	SRC,NOS3,MMP2,KDR,MMP9,NFE2L2,VEGFA

表1： 前20条富集通路的KEGG富集分析结果。

补充表1：CC中活性化合物的基本信息。请点击此处下载该文件。

补充表 2：CC 中 85 种活性成分的作用靶点。请点击此处下载该文件。

补充表3：61个CC-SONFH共同靶点的信息。请点击此处下载该文件。

补充表4：基因本体富集分析中生物过程类别术语的结果。请点击此处下载该文件。

补充表5：基因本体富集分析中细胞组分分类术语的结果。请点击此处下载该文件。

补充表6：基因本体富集分析中分子功能类别术语的结果。请点击此处下载该文件。

补充表7：KEGG富集分析通路结果。请点击此处下载该文件。

补充表8：化合物-靶标对的分子对接结合能（kcal/mol）。请点击此处下载该文件。

补充表9：分子对接靶点与组分的详细信息。请点击此处下载该文件。

讨论

在本研究中，作者通过多个数据库获取了85种来自CC的生物活性化合物，并进行了筛选，其中主要化学成分包括茴香脑（anethole）、野苜蓿素A（melilotocarpan A）和肉豆蔻醚（myristicin）。为鉴定靶点，作者将563个CC药物靶点与1116个与激素性股骨头坏死（SONFH）相关的靶点取交集，最终获得61个共同靶点。作者将这61个共同靶点导入STRING和DAVID数据库，构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并探究可能的药理学通路。结果在PPI网络中识别出10个关键靶点，包括HIF-1α和STAT3。根据前期研究，缺血和缺氧是SONFH的两个主要致病特征³⁵。CC可能通过多种生物过程对SONFH产生积极作用，包括血管生成和转录调控。KEGG富集分析表明，这些作用可能通过HIF-1α信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路以及其他信号通路实现。这提示CC可能通过这些关键靶点及其相关通路发挥对SONFH的作用。为进一步阐明CC成分是否与靶点紧密结合，基于上述网络药理学研究结果，即复方活性成分的筛选结果以及PPI网络中靶点的筛选结果，作者对野苜蓿素A-AKT1、野苜蓿素A-HIF-1α以及STAT3-野苜蓿素A复合物进行了分子动力学模拟。结果显示，野苜蓿素A能够稳定结合AKT1、HIF-1α和STAT3，表明CC确实可能通过作用于这些关键靶点发挥积极作用。综上所述，CC可能通过多成分、多靶点、多通路的机制，对SONFH患者的生存质量产生保护作用。

该研究团队一直致力于阐明YGPs在骨相关疾病中发挥治疗作用的机制。先前的研究表明，YGPs通过激活β-catenin抑制破骨细胞生成并促进成骨，从而在兔股骨头坏死（SONFH）模型中增强骨形成并改善股骨头小梁微结构³⁶。此外，研究人员发现，YGPs主要通过减轻炎症反应和促进血管生成来对SONFH发挥治疗作用¹²。YGPs不仅能改善SONFH，还能缓解骨质疏松。通过抑制IL-17/NF-κB信号通路并降低Th17免疫反应，YGPs成功阻止了卵巢切除诱导的骨量丢失³⁷。通过动物实验，研究人员证实YGPs的组分之一山茱萸（Cornus officinalis）可通过抑制炎性介质分泌和骨细胞凋亡来影响SONFH的进展³⁸。肉桂（CC）作为YGPs中的君药，具有温阳益气、通经活络的功效，在改善SONFH和缓解患者痛苦方面发挥着关键作用。综上所述，这些研究体现了该团队长期以来对YGPs在骨坏死中作用机制的深入探索，并明确将CC确定为在SONFH中值得进一步开展机制研究的核心药物。

在预测的活性成分中，茴香脑、肉豆蔻素及其他成分已显示出对骨骼相关疾病的生物学活性。研究表明，茴香脑能够抑制骨吸收标志物的升高，并通过抑制下游信号通路及关键调控因子，最终减少破骨细胞的分化及其吸收功能³⁹。研究还表明，茴香脑具有抗炎特性，并可抑制人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的脂肪向分化⁴⁰。肉豆蔻素可通过抑制PI3K/Akt和NF-κB通路来减轻炎症反应，并保护血管平滑肌细胞⁴¹。铁死亡是股骨头坏死（SONFH）发病机制中的关键机制之一，它是一种由铁依赖性脂质过氧化引发的程序性细胞死亡形式。肉豆蔻素可通过抑制铁死亡，从而保护成骨细胞膜的氧化还原稳态⁴²。另一种成分冰片已被证实可在30分钟内抑制破骨细胞吸收功能所特有的肌动蛋白环结构的形成，该结构反映了细胞的极化状态⁴³。这些发现表明，这些成分可能在CC对SONFH的保护作用中发挥重要作用，值得进一步研究。在所有这些成分中，Melilotocarpan A被选为代表性配体，因其在分子动力学分析中与多个核心靶点表现出最稳定的结合亲和力。在排名靠前的化合物中，Melilotocarpan A在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中的多个关键蛋白上均表现出持续且强烈的结合能力，提示其可能是CC的主要生物活性成分之一。

此外，PPI 网络分析结果表明，HIF-1α 和 STAT3 可能是核心靶点。HIF-1α 是细胞对缺氧反应的核心调控因子。在激素性股骨头坏死（SONFH）实验中，激活 HIF-1α 可增强血管生成和骨修复，从而缓解股骨头坏死⁴⁴。此外，研究发现 HIF-1α 在缺氧条件下对软骨组织具有保护作用⁴⁵。上调 HIF-1α 可抑制铁死亡，并激活 STAT3，促进骨髓单核细胞向破骨细胞分化⁴⁶。STAT3 是一种信号转导与转录激活因子。人骨髓间充质干细胞（HBMSCs）可促进 STAT3 转化为磷酸化 STAT3（p-STAT3），从而在缺氧条件下增强软骨细胞的增殖、迁移及抗凋亡作用⁴⁷。STAT3 能增强人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的成骨分化能力和抗凋亡效应，同时增加其血管内皮生长因子（VEGF）的分泌，促进骨微血管再生⁴⁸。AKT1 是一种蛋白激酶，是血管生成信号通路中的关键中介分子。AKT1 参与骨血管生成-成骨耦合过程及小梁骨的形成⁴⁹。综上所述，这些核心靶点汇聚于血管生成、缺氧适应、炎症反应和骨重塑等过程，提示穿山甲（CC）可能通过调控这些靶点及其相关信号通路，发挥对激素性股骨头坏死（SONFH）的保护作用。

为了探讨穿心莲内酯（CC）在改善无菌性股骨头坏死（SONFH）中的作用机制，研究人员进行了GO分析和KEGG富集分析。GO分析结果显示，靶基因主要富集于缺氧反应、细胞对脂多糖的反应以及血管生成的正向调控等生物学功能。KEGG富集分析表明，CC在SONFH中的药理作用主要与糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1α信号通路、脂质与动脉粥样硬化等信号通路相关。SONFH的发生是由于股骨头血流中断，导致股骨头缺乏营养支持，进而引发细胞凋亡⁵⁰。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β组成，其中HIF-1α在缺氧和缺血环境下的转录反应中起关键作用⁴⁷。既往研究表明，HIF-1α通过VEGF/AKT/mTOR信号级联反应协调成骨与血管生成，从而显著促进脂肪来源干细胞的成骨分化。缺血发生后，组织出现缺氧，导致细胞内HIF-1α水平显著升高，进而增强VEGF的表达，促进血管修复与再生⁵¹。缺氧会破坏线粒体能量生成，并增加活性氧（ROS）的形成。这些变化促进破骨细胞生成，抑制成骨细胞活性，最终诱导骨细胞凋亡。高表达的HIF-1α可使细胞能量代谢从氧化磷酸化转向糖酵解，减少ROS的产生，从而减轻成骨细胞和骨细胞的凋亡^52,53。松质骨支持骨髓的造血功能，并储存钙等矿物质。HIF-1α活性的增加可直接促进松质骨的形成⁵⁴。此外，HIF-1α在缺氧条件下可维持软骨细胞的存活与稳态⁴⁵。因此，HIF-1α信号通路已成为ONFH的治疗靶点，具有治疗ONFH的潜在应用价值。

在AGE-RAGE信号通路中，晚期糖基化终末产物（AGEs）是由碳水化合物与蛋白质、脂肪或其他生物大分子发生非酶促共价交联反应而形成的⁵⁵。AGEs可通过引发炎症反应和氧化损伤，对细胞和组织造成损害。AGE与RAGE相互作用后，通过四条通路传导信号，分别为：（1）JAK-2-STAT1，（2）PI3K-AKT，（3）MAPK-ERK，以及（4）NADPH氧化酶-ROS⁵⁶。最终，磷酸化的NF-κB进入细胞核，启动促炎性细胞因子、生长因子、促纤维化细胞因子及氧化应激相关基因的转录表达。研究表明，AGE-RAGE可通过MAPK信号通路及氧化应激的激活促进成骨细胞凋亡，并通过抑制内质网应激感受器水平以及DNA甲基化/Wnt通路来抑制成骨分化⁵⁷。此外，研究还表明，AGEs和RAGE参与了血管钙化过程⁵⁸。

在脂质与动脉粥样硬化信号通路中，氧化脂质可激活 PPARγ。PPARγ 是脂肪生成的主要调控因子，能够抑制成骨分化⁵⁹。此外，多项研究表明，脂质会影响破骨细胞和成骨细胞的分化与成熟，从而破坏骨稳态⁶⁰。大量基础研究已证实，细胞凋亡在股骨头坏死（SONFH）的生理与病理机制中具有重要作用。后续的体内动物实验进一步证实，川芎（CC）的有效组分可有效抑制 SONFH 中的细胞凋亡与炎症反应，从而延缓疾病进展。

与这些发现一致，网络药理学和实验分析表明，CC 可能通过协调缺氧适应、调控血管生成以及调节代谢过程来改善激素性股骨头坏死（SONFH）。定量显微CT分析显示，CC干预显著恢复了骨体积分数（BV/TV），降低了骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨小梁厚度（Tb.Th），并促进了骨微结构的修复。KEGG富集分析进一步揭示HIF-1α信号通路是介导这些效应的关键机制。综上所述，这些动物实验表明，CC可能通过调控与缺氧和炎症相关的生物过程，促进血管生成和骨重建，从而缓解SONFH，其作用机制可能涉及HIF-1α信号通路等关键通路。

尽管获得了一些重要的初步发现，本研究仍存在一些局限性。作者仅依赖现代生物信息学方法（包括网络药理学和分子动力学）以及部分动物实验来探讨CC在股骨头坏死（SONFH）中的作用。因此，预测结果的可靠性和准确性仍需进一步验证 体内 和 体外 实验。本研究为CC改善股骨头坏死（SONFH）的潜在机制提供了初步线索，但尚需进一步的实验验证。通过整合网络药理学与分子动力学（MD），作者系统地绘制了CC在SONFH中的候选生物活性成分、关键靶点及富集通路。综上所述，本研究通过整合网络药理学与 体内 验证结果表明，这些机制主要与HIF-1信号通路的调控以及成骨再生的促进有关。如相应图示所示，CC的改善作用以剂量依赖性方式显著调节了HIF-1α、VEGF和ALP等关键蛋白的表达，进一步支持其在协调缺氧适应、血管生成和成骨活性中的作用。显微CT分析结果进一步证实了上述发现，显示CC干预有效恢复了骨体积分数并改善了骨小梁微结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% PFA	biosharp	BL539A
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218
阿利新蓝染色试剂盒	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps 研究所		版本 1.2.7
AutoDockTools	Scripps 研究所		版本 1.5.7
生物信息学在线平台			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 力场			用于分子动力学参数化
CTD			https://ctdbase.org
Cytoscape	Cytoscape 联盟		版本 3.10.3；插件：CytoHubba、CytoNCA
DAPI 染色液	碧云天生物技术股份有限公司	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020；用于对接结果可视化
DisGeNET			https://disgenet.com
EDTA 脱钙液	碧云天生物技术股份有限公司	C0167-3L
内源性过氧化物酶阻断液	碧云天生物技术股份有限公司	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
山羊抗兔 IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
山羊血清	碧云天生物技术股份有限公司	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		版本 10；用于统计分析与作图
GROMACS	GROMACS		版本 2022；使用 CHARMM36 力场
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	杭州华安生物技术有限公司	HA721997
高分辨率显微CT设备	Bruker	SkyScan
Lipinski 规则筛选条件			分子量 ≤ 500；miLogP ≤ 5；氢键供体数 ≤ 5；氢键受体数 ≤ 10
脂多糖	Sigma-Aldrich	L4516
甲基泼尼松龙	国药集团化学试剂有限公司	CATOCCAD302504100MG
中性树胶	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
石蜡	国药集团化学试剂有限公司	C416770020
粒子网格埃瓦尔德法 (PME)			用于长程静电相互作用计算
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrödinger		用于蛋白质结构可视化与预处理
R	CRAN		版本 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	瑞士研究所		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	瑞士研究所		http://www.swisstargetprediction.ch
TIP3P 水模型			用于溶剂化处理
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	杭州华安生物技术有限公司	ET1604-28
维生信			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		用于数据处理、分子对接和分子动力学模拟
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司	10023418