CD47和整合素α4/β1修饰巨噬细胞膜涂层多聚（乳酸共乙醇酸）纳米颗粒的分离、合成与表征

摘要

该方案能够制备和表征CD47和整合素α4/β1共修化巨噬细胞膜包覆多聚（乳酸-共乙醇酸）纳米颗粒，用于靶向药物递送。

摘要

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是心血管发病率和死亡率的主要原因。向动脉粥样硬化部位靶向投放抗炎药物仍是重大挑战。本文提出了CD47和整合素α4/β1共修饰巨噬细胞膜包裹的多（乳酸-共乙醇酸）纳米颗粒（MMM/COL NPs）的制备和表征详细方案。该方案包括通过质粒转染和内皮素-1刺激进行巨噬细胞修饰、膜分离、NP制备和膜涂层。所得的MMM/COL非自然体通过物理化学表征、蛋白质表达分析以及体外和 体内 检测进行评估。功能验证包括评估细胞与活化内皮细胞的关联、巨噬细胞摄取、泡沫细胞中的抗炎效果以及小鼠动脉粥样硬化模型中的生物分布。此外，重点介绍了关键实验参数和质量控制步骤，以确保实验室间的重复性和一致性。该方案为生成仿生NPs提供了一种稳健且可扩展的方法，用于动脉粥样硬化研究中的靶向药物递送应用。

引言

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，导致致命的心血管事件和中风，包括动脉腔狭窄和不稳定的斑块破裂，是全球健康负担的重要原因 ^1,2,3。动脉粥样硬化部位炎症反应的下调是主要的^{治疗靶点4,5}。秋水仙碱是一种强效抗炎药，已显示出减少心血管不良事件的潜力 ^6,7。然而，其临床效用受限于有限的治疗窗口和全身性副作用，因此需要针对性递送系统以增强斑块部位的积累，同时最大限度地减少毒性^8。

细胞膜涂层纳米颗粒（NPs）已成为靶向药物递送的强大平台，利用源细胞的自然生物功能 ^9,10,11。在参与动脉粥样硬化的细胞类型中，巨噬细胞起着关键作用 12,13,14。蛋白α4/β1在巨噬细胞上表达，通过结合在活化内皮细胞（EC）上表达的血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）来介导动脉粥样硬化斑块的招募。CD47，一个“别吃我”信号，使单核吞噬细胞系统能够规避吞噬作用^15,16。通过工程化巨噬细胞膜使其这些蛋白比原生巨噬细胞膜更过表达，可以通过整合素α4/β1–VCAM-1的相互作用制造出具有增强靶向功能的NPs，并通过CD47介导的信号传递减少吞噬^作用6。双重修饰策略在增强对激活ECS的靶向和降低吞噬清除率方面，改进了原生膜涂层NP和配体基靶向系统。与仅表达这些蛋白质基线水平的天然巨噬细胞膜不同，我们的工程膜在不引入可能触发免疫原性的合成靶向配体的情况下，提供了增强的功能。

本方案详细介绍了带CD47和整合素α4/β1共修饰巨噬细胞膜的秋水仙素载多（乳酸共乙醇酸）NPs（COL NPs）的制备和特性分析，生成修饰巨噬细胞膜涂层NP（MMM/COL非咽着）。我们描述了RAW 264.7巨噬细胞的遗传和药理修饰方法、修饰膜的分离、PLGA非骨干细胞的制备与涂层，以及全面的 体外 和 体内 功能测定。该方法为制备和评估仿生NPs在动脉粥样硬化研究中的靶向药物递送应用提供了可重复的框架。

方案

本方案中描述的所有动物操作均经南京鼓楼医院机构动物护理与使用委员会批准，并遵循国立卫生研究院制定的实验动物护理和使用指南。

1. RAW 264.7巨噬细胞的修饰

1. 准备RAW 264.7细胞，完成Dulbecco改良鹰培养基，辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素，CD47过表达质粒，脂蛋白3000转染试剂，内皮素-1（ET-1），磷酸缓冲生理盐水（PBS）及无菌组织培养材料。
2. 在37°C加5%二氧化碳的加湿培养箱中培养264.7细胞，保持细胞数量达到每孔约4–5×10个⁵ 细胞，6孔板中。
3. 进行CD47修改
   1. 通过将2.5微克质粒DNA与5微升P3000试剂混合于125微升Opti-MEM无血清培养基中制备质粒DNA溶液。
   2. 通过将3.75微升转染试剂稀释于125微升无血清培养基中制备转染试剂溶液。
   3. 用这些体积做6孔板格式。在保持DNA：P3000比为1：2（μg：μL）和DNA与转染试剂比为1：1.5（μg：μL）的同时，按比例对所有组分进行比例标度。
      注意：例如，10厘米盘使用10微克DNA、20微升P3000和15微升转染试剂。
   4. 将DNA溶液与转染试剂溶液结合，在25°C下培养15分钟。
   5. 将转染复合物加入无抗生素DMEM中，辅以10% FBS，约2–2.5个，×10个⁶ 细胞/10厘米盘。
   6. 转染后6小时更换为含抗生素的全新全培养基。
4. 进行整合素α4/β1修饰
   1. 在无血清培养基中刺激100 nM ET-1的转染或非转染细胞24小时，以上调整合素α4/β1表达。
      注意：通过定量聚合酶链反应（qPCR）和Western印迹分析验证CD47、整合蛋白α4和整合蛋白β1的修饰效率。

2. 修饰巨噬细胞膜（MMM）的分离

1. 用细胞刮刀采集修改后的RAW 264.7细胞。
2. 在4°C下，将细胞以900×克离心5分钟。
3. 用冷的1×PBS清洗细胞颗粒三次。
4. 将细胞沉淀物重新悬浮于2毫升预冷却低渗溶液中（10 mM Tris-HCl，pH 8.0,1 mM KCl，1.5 mM MgCl_2,1 mM 苯甲基硫酰氟化物），并在冰上孵育15分钟。
5. 将悬浮液用液氮冷冻2分钟，然后在37°C的水浴中解冻5分钟。重复冻融循环五次，完全溶解细胞。
   注意：液氮可能导致严重的低温烧伤。请佩戴适当的保温手套和面部防护。
6. 将裂解液在850×克下离心10分钟，温度为4°C，以去除细胞核和未破碎的细胞。
7. 在15,000 × g下离心，4°C下离心30分钟。 为获得更高的膜纯度，需将15,000×克离心后获得的上清液转移到超速离心机管中，并在4°C下以100,000×克离心机进行1小时离心。
   注意：确保超速离心管保持适当平衡并适配高速离心，以防止转子失衡或故障。
   注意：超速离心可获得纯化的质膜，减少细胞器污染。
8. 收集含有MMM片段的沉淀，并将其重新悬浮于300微升的1×PBS或裂解缓冲液中，得到约1–2 mg/mL的蛋白质浓度。
9. 使用BCA蛋白定量测定试剂盒测定膜蛋白浓度。
   注意：分离膜可储存在−80°C以备后续使用。

3. 制备秋水仙碱负载的PLGA非物质（COL NPs）

1. 将10毫克PLGA（50：50，MW90,000）和1毫克秋水仙碱溶解在1毫升二甲基亚尔福化物（DMSO）中。
   注意：DMSO可能渗透皮肤并增强其他物质的吸收。处理时请佩戴适当的个人防护装备（丁腈手套、实验服和安全护目镜）。收集含DMSO的溶液作为有机溶剂废弃物，并通过持牌危险废物处置服务进行处置。秋水仙碱有毒，且可能致畸。收集所有受秋水仙碱污染的材料（溶液、手套和管子）作为危险药品废弃物，并根据机构和地方法规通过持牌危险废物处置服务进行处置。
2. 用磁性搅拌器搭配10毫米特氟龙涂层搅拌棒，以500转/分钟的转速在25°C搅拌溶液。
3. 使用配备5毫升注射器和26克针头的注射器泵，在25°C下，以约1毫升/分钟的速率滴入4毫升超纯水。
4. 继续搅拌混合物3小时，以促进NP形成。
5. 将NP悬浮液转移到透析袋（MWCO 3,500 Da）。
6. 在2升蒸馏水中，4°C，轻轻搅拌，转速200转/分钟。
7. 继续透析24小时，6、12和24小时完全更换透析缓冲液，以去除游离秋水仙碱和DMSO。
   注意：收集所有有机溶剂和试剂，包括透析产生的，作为有机化学废弃物。不要直接倒进下水道。遵循机构的有害废物处置规范。
8. 收集透析后的COL非物质悬浮液，并在4°C下储存。
   注意：COL天然气颗粒物可短暂保存至4°C（最长3天）。对于荧光标记，在步骤3.1中将0.1%（w/w）的1,1′-二癸基-3,3,3′，3′-四甲基氨基碳酸二氯酸盐（DiI）染料加入PLGA溶液中。
9. 确认去除DMSO和游离秋水仙碱的情况
   1. 收集最终透析液（24小时最后变化后的缓冲液），并使用紫外-可见光（UV–Vis）光谱光度法进行分析。
   2. 将透析液从200到400纳米扫描，并与对照样本（新鲜透析缓冲液）进行比较。
   3. 确认在约210 nm（DMSO特征）或345 nm（秋水仙碱特征）处无吸收峰，表明残留溶剂和游离药物已成功去除。
   4. 或者，根据制造商说明使用DMSO检测试剂盒测定残余DMSO浓度。确保残余DMSO低于0.1%（v/v），以避免下游检测中的细胞毒性。

4. 膜涂层NPs（MMM/COL非泡泡药）的制备

1. 用水浴超声器在40 kHz、110瓦下对分离的MMM悬浮液进行20分钟超声处理。样品体积保持在1.5 mL管内，温度低于25°C，视需要用冰浴。
2. 利用微型挤出机将超声泡膜悬浮液挤出至孔径为400纳米的聚碳酸酯膜滤膜，形成膜囊泡。
3. 将步骤3.5中的COL非泡泡与MMM囊泡混合，膜蛋白与PLGA质量比为1：1。
   1. 根据蛋白质定量测定，使用含有10毫克蛋白质的膜悬浮液，以换取10毫克PLGA。
   2. 用1毫升移液器轻柔地将COL非泡和MMM囊泡上下混合15次。
4. 将混合物通过孔径为200纳米的聚碳酸酯膜过滤器共挤出，重复挤出15次。
5. 收集含有MMM/COL不分子的悬浮液，并在4°C下储存以立即使用。

5. NP的特征描述

1. 在以下条件下，利用动态光散射（DLS）测量流体动力直径、多色散指数（PDI）和ζ势：温度，25°C;背散射角，173°;平衡时间，2分钟;每个样本进行三次重复测量。
2. 将样品稀释为去离子水的20倍（最终浓度约0.1 mg/mL）。
   注意：稀释可最小化多种散射效应。
3. 利用透射电子显微镜（TEM）可视化MMM/COL非泡泡蛋白的核壳结构。
   1. 将5微升NP悬浮液（约0.1 mg/mL）置于发光放电的碳涂层铜栅极（300目）。
   2. 让样品在25°C下吸附2分钟。
   3. 用滤纸轻轻触摸网格边缘去除多余液体。
   4. 将5微升1%醋酸铀酰溶液涂于网格上，并在25°C下孵育1分钟。
   5. 用滤纸去除多余的污渍。
   6. 让网格完全自然干燥至少10分钟后再进行成像。
      注意：醋酸铀酰具有毒性且具有放射性。请佩戴适当的个人防护装备（手套、白袍和护目镜），并按照机构的危险物质指南处理废物。
4. 在第二步或膜分离前，用3,3′-二八癸基氧基酸碳酸盐（DiO）染料标记膜，并在膜分离前标记完整细胞，并用DiI标记PLGA核心。
5. 利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析DiO（绿色）和DiI（红色）信号的共定位。
   1. 激发/发射参数设定如下：DiO（绿色），激发488 nm，发射550 nm;DiI（红色），激发561纳米，发射620纳米。
   2. 使用60×油浸式物镜（数值孔径1.4）。
   3. 把针孔设为1个Airy单位。
   4. 调整探测器增益以避免像素饱和。
   5. 以1024×1024像素分辨率和2×线平均获取图像。
   6. 保持激光功率低于5%，以减少光漂白。
6. 利用西方墨迹分析分析MMM/COL非孔表面上的CD47、整合素α4和整合素β1的存在情况。
7. 确定药物的负荷和释放
   1. 在DMSO中裂解100微升体积的NPs，测量345纳米的秋水仙吸收率，以确定药物载荷和封装效率。
   2. 将1毫升MMM/COL NP悬浮液（含约100微克秋水仙碱）放入透析袋（MWCO，3,500 Da）。
   3. 封好袋子，浸泡在50毫升含20%FBS的PBS（pH值7.4）中，浸泡在100毫升玻璃烧杯中。
   4. 使用带有20毫米特氟龙涂层搅拌棒的磁性搅拌器，保持释放介质在37°C，持续搅拌，转速100转/分钟。
   5. 在整个实验过程中保持水槽条件。
      注意：20% FBS在PBS中的秋水仙碱溶解度为>1 mg/mL;释放培养基中秋水仙碱的最大浓度为饱和度的<10%。
   6. 在预定时间点（0、1、2、4、8、12、24、36、48和62小时）提取500微升释放介质。
   7. 用等量的新鲜预热PBS（37°C），含20%FBS替换取出的体积。
   8. 在345纳米使用紫外-可见光谱光度法测量取出样品中的秋水仙碱浓度。
   9. 所有测量要三份完成。

6. 体外 功能测定

1. 种子人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）。用10 ng/mL肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激细胞24小时，以上调VCAM-1。
2. MMM/DiI非助种子与HUVECs的细胞关联
   1. 将细胞与DiI标记的MMM/COL非泡泡物（MMM/DiI非泡泡药）在5%二氧化碳气氛中，以50 μg/mL浓度（基于PLGA芯质）在37°C下孵育4小时。
   2. 用预冷PBS清洗电池三次。每次清洗后，在300×克下离心5分钟，温度为4°C。
   3. 将洗净细胞重新悬浮在含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中。将最终细胞浓度调整为1×10⁶ 细胞/毫升。
   4. 设置流细胞术或CLSM的仪器参数。通过549 nm激发和565 nm发射（PE通道）检测DiI荧光。
   5. 从样本中获取数据。每个样本至少采集10,000个事件以进行流式细胞术，或捕捉CLSM的代表性场域。
   6. 使用60×油浸透镜，从不同区域（不含边缘）每个样品选择五个代表性场。确保单元完整且不重叠。
   7. 在图像采集前对样品进行盲处理。通过随机移动关卡来选择场地，而不是手动选择特定区域。
   8. 在盲测条件下对所有样品应用相同的阈值和分析参数。
   9. 使用FSC-A/SSC-A门控排除细胞碎片。选择采用FSC-A/FSC-H门控的单胞。
   10. 使用活体染料染色选择活细胞。加入7-氨基拟霉素D（7-AAD），浓度为1 μg/mL，在4°C黑暗下孵育5分钟，用于活细胞门控检测。
   11. 分析荧光强度以量化细胞关联。使用平均荧光强度作为量化指标。使用FlowJo（v10.8.1）流式细胞术分析软件进行数据分析。
3. RAW 264.7巨噬细胞对MMM/DiI不当分子的细胞摄取
   1. 在5% CO₂大气中，以50 μg/mL浓度（基于PLGA核心质量）与未修饰的RAW 264.7巨噬细胞一起与未修饰的MMM/COL巨噬细胞一起孵育4小时。
   2. 准备单元进行分析，步骤6.2.2–6.2.3中描述。
   3. 设置仪器参数，用于DiI检测，激发波段为549 nm，发射波长为565 nm（PE通道）。
   4. 从样本中获取数据。每个样本至少采集10,000个事件。
   5. 使用FSC-A/SSC-A门控排除细胞碎片。选择采用FSC-A/FSC-H门控的单胞。
   6. 使用活体染料染色选择活细胞。加入7-AAD，浓度为1 μg/mL，在4°C黑暗下培养5分钟，用于活细胞门控。
   7. 分析荧光强度以量化细胞吸收。使用平均荧光强度作为量化指标。使用流式细胞术分析软件进行数据分析。
4. 泡沫电池测定
   1. 通过与氧化低密度脂蛋白（oxLDL）以50 μg/mL培养48小时，将RAW 264.7细胞分化为泡沫细胞。通过Oil Red O染色确认泡沫细胞形成，该染色由细胞内脂质积累指示。
   2. 用游离秋水仙碱、COL非水芹或MMM/COL天然气颗粒物，在等效秋水仙碱浓度1微米处处理泡沫细胞。在含5%二氧化碳的加湿环境中，37°C下培养细胞24小时。
      注意：选择此浓度基于初步剂量-反应实验，评估细胞存活能力和抗炎效果。
   3. 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测量炎症性细胞因子水平。
      1. 处理后（24小时）立即采集细胞培养上清液。
      2. 在300×克下，4°C离心5分钟，去除细胞碎片。
      3. 将澄清后的上清液转移到干净的管子中，并在−80°C下储存直到分析。
      4. 按照制造商说明，使用ELISA试剂盒测量TNF-α和白细胞介素-6水平。
      5. 在三倍井中完成所有测量，并独立重复实验三次。
      6. 报告细胞因子浓度为绝对值（pg/mL），无需额外归一化，因为所有组的细胞种子密度和处理条件一致。

7. 动脉粥样硬化模型中的体内治疗应用

注意：所有动物操作必须经相关机构动物护理与使用委员会批准。

1. 建立动物模型
   1. 在8周龄雄性载脂蛋白E敲除（ApoE⁻/⁻）小鼠中建立易感的动脉粥样硬化斑块模型（C57BL/6背景）。
   2. 手术前一周，随意喂食含15%脂肪和0.25%胆固醇的高脂饮食，术后持续4周。
   3. 在颈动脉收缩手术期间，使用异氟醚麻醉小鼠（诱导时2%–3%，维持治疗时1.5%–2%），并皮下注射丁丙诺啡（0.1 mg/kg）以缓解疼痛。
   4. 用直径0.3毫米的针头与左侧颈总动脉并列收缩。用6-0丝绸结扎绳绑住动脉和针头，然后取出针头以形成部分收缩。
   5. 通过组织学评估确认术后4周时易受影响斑块形成。
   6. 进行血液素和嗜青（H&E）、Oil Red O和Masson三色染色，以评估斑块形态、脂质沉积和胶原蛋白含量。
   7. 定义易感斑块面积为斑块面积>血管横截面积的40%，纤维帽厚度<120微米，脂质核心面积占总斑块面积>40%，以及显著的CD68阳性巨噬细胞浸润。
2. 通过尾静脉静脉注射100微升DiI标记的MMM/COL非必需品，剂量为2 mg/kg（基于PLGA核心质量）。
   1. 使用 体内 成像系统对小鼠注射后1天进行成像，以评估全身生物分布。
      1. 用异氟醚麻醉小鼠（诱导3%，维持麻醉1.5%–2%，氧气流量分别为1和0.5升/分钟）。通过呼吸频率和脚趾夹击反射监测麻醉深度。
      2. 将小鼠仰卧放在37°C加热台上，以维持成像时的体温。
      3. 使用DiI设置（激发549 nm，发射565 nm）并使用CY3或TRITC滤光片组获取荧光图像。使用自动曝光模式（通常为50–200毫秒）和反射荧光采集。
      4. 同时捕捉对应的明场图像，分辨率为1024×1024像素，用于解剖参考。
   2. 采集主要器官和颈动脉，进行体外荧光成像。
      1. 对小鼠使用异氟醚麻醉（诱导时3%，维持麻醉时2.5%–3%）。
      2. 通过左心室穿刺，以每分钟5 mL的流量灌注20毫升冰冷PBS（pH 7.4）小鼠，以去除残留血液和未结合的NPs。
      3. 注射后24小时内，灌注后立即采集心脏、主动脉、肝脏、脾脏、肾脏和肺。
      4. 用冰冷的PBS冲洗采集器官以去除表层血液。
      5. 纵向打开主动脉，并用不锈钢针将其平放（内皮面朝上）固定在黑色硅胶板上。
      6. 将组织保持在冰冷的PBS中，并在采收后30分钟内进行体外荧光成像。在影像检查前立即去除组织表面多余的PBS。
3. 进行剂量调整和治疗
   1. 根据初步剂量-反应研究确定秋水仙碱剂量（0.01–0.45 mg/kg，n = 7/组）。选择0.05 mg/kg秋水仙碱作为治疗剂量。
   2. 通过尾静脉注射100微升，对应NP剂量2 mg/kg（PLGA核心质量）和秋水仙碱剂量0.05 mg/kg。连续14天每天注射一次。
   3. 使用随机数生成器将小鼠随机分配到处理组（PBS、游离秋水仙碱和MMM/COL非饮品组）。所有量化均由两名观察者盲对处理组进行。
   4. 采取人道的终点，包括>20%的体重减轻、行动能力受损或出现痛苦迹象。
4. 进行终点分析
   1. 在最后一次注射后24小时内安乐死小鼠。摘取颈动脉和主动脉。通过面部检测主动脉红O染色来评估斑块负担。
   2. 量化斑块面积
      1. 使用图像分析软件，将斑块面积量化为油红O阳性面积占主动脉腔总面积的百分比（每只小鼠五切片）。
      2. 在ImageJ图像分析软件中打开该图像。
      3. 点击图片→输入→8位，将图像转换为灰度。
      4. 点击图片→调整→阈值。选择Otsu方法并应用阈值以识别油红O阳性区域。
      5. 对所有样本图像应用相同的阈值参数，并记录阈值设置以便验证。
      6. 点击分析→集合测量，选择面积。
      7. 点击分析→测量以量化所选区域。
      8. 导出量化数据。
   3. 评估斑块稳定性
      1. 通过H&E、Oil Red O和Masson三色染色对颈动脉横截面进行组织学染色，评估斑块稳定性。将胶原蛋白量化为马松氏三色阳性蓝色斑块面积的百分比。
      2. 制备含石蜡的切片厚度为5微米，最佳切割温度嵌入的冷冻切片厚度为8微米。
      3. 通过脱石蜡和重新水化切片进行H&E染色，随后在室温下用血液素染色5分钟，以及在室温下进行伊红染色2分钟（RT;23°C±2°C）。
      4. 对冷冻切片进行Oil Red O染色，方法是用Oil Red O工作液在RT下培养15分钟。切片用60%异丙醇分离2秒，然后用蒸馏水冲洗。
      5. 按照套纸说明，将Weigert铁素素培养10分钟、庞索酸紫红5分钟、磷钼二酸5分钟和苯胺蓝5分钟在RT中培养Masson三色染色。
      6. 在图像分析软件中打开组织学图像。
      7. 应用颜色阈值法以识别胶原蛋白阳性区域。执行自动阈值化，并将相同参数应用于所有样本图像。
      8. 记录阈值设置以便验证。
      9. 将总斑块面积定义为血管内膜内所有斑块面积的总和。
      10. 通过手动描绘斑块边界或使用自动阈值分割来识别所有斑块区域来测量斑块面积。
      11. 测量胶原蛋白阳性区域。
      12. 计算胶原蛋白含量为胶原阳性面积除以总斑块面积×100%。
   4. 评估巨噬细胞含量
      1. 进行CD68免疫荧光染色以评估巨噬细胞含量。将巨噬细胞含量量化为CD68阳性斑块面积百分比。
      2. 准备组织切片（5微米厚度用于石蜡嵌入切片）。在高压下使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行抗原回收，持续2分钟。
      3. 在RT用5% BSA区块30分钟。
      4. 在4°C下用兔子抗小鼠CD68单克隆一级抗体（克隆D4B9C，稀释1：200,1% BSA中）培养切片。
      5. 在RT下用Alexa Fluor 488结合的山羊抗兔IgG二次抗体（稀释比例1：500）切片1小时。
      6. 用4′，6-二酰胺二-苯吲哆酮（DAPI）对核进行反染5分钟。
      7. 在图像分析软件中打开荧光图像。
      8. 利用阈值法识别CD68阳性区域。执行自动阈值化，并将相同参数应用于所有样本图像。
      9. 记录阈值设置以便验证。
      10. 测量CD68阳性区域。
      11. 计算巨噬细胞含量为CD68阳性面积除以斑块总面积×100%。

结果

DLS测量使用Zetasizer Nano ZS系统在25°C、173°背散射角下进行。样品在去离子水中稀释20倍（最终浓度约0.1 mg/mL），并在测量前平衡2分钟。每个样品均以三倍测量，结果以平均±标准差表示。DLS和TEM显示膜涂层后NP尺寸增加，并证实了芯壳结构的形成（见图1）。COL核泡泡的流体动力直径为180.8±5.2纳米，PDI为0.12±0.03，ζ电位为−17.2±0.67毫伏（n=3）。膜涂层后，MMM/COL非泡泡电的尺寸为202.0±6.1纳米，PDI为0.15±0.04，ζ电位为−27.4±1.84毫伏（n=3）。典型的质量回收率为8.7±10毫克PLGA回收率为0.4毫克（产率87%）。 不理想的结果可能包括多分散指数增加（PDI > 0.3），表明尺寸均匀性差，或涂层后尺寸不增（尺寸变化<10纳米），暗示膜涂层效率低下。此外，涂层后zeta电位变化小于5 mV，可能表明膜覆盖不完整。颗粒浓度通过NP追踪分析为2.4×10¹¹

讨论

该方案提供了构建和应用CD47和整合素α4/β1共修饰巨噬细胞膜涂层NPs的综合方法，用于靶向动脉粥样硬化治疗。该系统的主要优势包括通过整合素α4/β1–VCAM-1相互作用进行主动靶向，以及减少与CD47介导信号相关巨噬细胞摄取，这一点得到了体外摄取实验（见图3）和 体内 生物分布结果（见图4）的支持。使用改良膜而非简单的原生膜，增强了特定且具有治疗意义的特性。双重修饰策略的独特之处在于它同时解决了NP药物递送中的两个主要障碍，同时不引入可能触发免疫原性的合成靶向配体。

该方案的关键步骤包括巨噬细胞修饰的效率、膜分离的完整性以及挤出过程中膜涂层的均匀性。对于膜分离，虽然我们的标准方案使用15,000 × g离心，而对于需要高度纯化质膜且细胞器污染极少的应用，建议使用100,000 × g的超速离心。比较数据显示，纯化后的膜表现出略微增强的免疫逃逸能力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-氨基拟霉素D（7-AAD）	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	A1310	流细胞术活/死活分辨的存活染料
Alexa Fluor 488结合山羊抗兔IgG	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	A-11008	CD68免疫荧光染色的二级抗体
抗小鼠CD47抗体	阿布卡姆（美国）	AB214453	用于西方墨迹分析以验证CD47表达
抗小鼠整合素和α;4 抗体（B-2）	圣克鲁斯生物技术（美国）	SC-376334	用于西方印迹分析以验证整合素和α;4 表达式
抗小鼠整合素和β;1个抗体（A-4）	圣克鲁斯生物技术（美国）	SC-374429	用于西方印迹分析以验证整合素和β;1 表达式
ApoE-/-鼠	杰克逊实验室（美国）	无	用于体内动脉粥样硬化模型
BCA检测套件	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	23225	用于确定蛋白质浓度
黑色硅胶板	无	无	用来安装主动脉进行体外成像
CD47质粒（pcDNA3.1（+））	Generay生物技术（中国）	G0177361-1	含有用于过度表达的小鼠Cd47基因
秋水仙碱	Sigma-Aldrich（美国）	C9754	纳米颗粒中的治疗有效载荷
共焦激光扫描显微镜	徕卡微系统	TCS SP8	用于荧光成像和共定位分析
柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	无	用于免疫荧光染色中的抗原提取
透析管（MWCO 3,500 Da）	Sigma-Aldrich（美国）	PURD35030	用于纳米颗粒纯化
二甲基亚硫酸盐（DMSO）	Sigma-Aldrich（美国）	D2447	纳米颗粒制备溶剂
DiI（1,1′-二八癸基-3,3,3′，3′-四甲基环氨基碳氰酸过氯酸盐）	Beyotime（中国）	C1036	纳米粒子核心的荧光标记
DiO（3,3′-二八癸基氧基酸过氯酸盐）	Beyotime（中国）	C1038	巨噬细胞膜的荧光标记
导演	Beyotime（中国）	Y239280	用于体内荧光成像
达皮	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	D3571	荧光成像用核反染剂
杜尔贝科改良型鹰型中型（DMEM）	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	11965092	细胞培养基
动态光散射分析仪（Zetasizer Nano ZS）	马尔文潘纳利蒂卡（英国）	无	用于动态光散射（DLS）测量纳米颗粒尺寸、PDI和ζ势
ELISA套件	R&D 系统（美国）	取决于目标细胞因子	用于定量炎症性细胞因子
内皮素-1（ET-1）	Sigma-Aldrich（美国）	E7764	用于刺激整合素和α;4/β1 表达式
胎儿牛血清（FBS）	Gibco（美国Thermo Fisher Scientific）	10091148	细胞培养基补充剂
流式细胞仪	生物科学学士（美国）	FACSCalibur	用于荧光信号采集
流式细胞术分析软件（FlowJo v10.8.1）	生物科学学士（美国）	无	用于流式细胞术数据分析
人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）	福恒生物技术（中国）	FH1122	用于体外靶向测定
图像分析软件（ImageJ）	美国国立卫生研究院	无	用于定量图像分析
体内成像系统	珀金埃尔默（美国）	IVIS Lumina III	用于全身荧光成像
异丙醇（60%）	Sigma-Aldrich（美国）	34863	用于油红O染色时的分化
脂氧胺3000	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	L3000001	转染试剂
磁力搅拌器和搅拌杆	无	无	用于纳米颗粒制备
马松三色染色套件	阿布卡姆（美国）	AB150686	用于胶原染色
迷你挤出机	Avanti极地脂质（美国）	610000	用于膜挤压
小鼠RAW 264.7细胞系	福恒生物技术（中国）	FH0328	巨噬细胞的来源
小鼠平滑肌细胞系	福恒生物技术（中国）	FH-Y063	用于安全评估
油红O	Sigma-Aldrich（美国）	O0625	用于脂质染色
光学MEM	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	31985062	用于转染的还原血清培养基
氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）	一源生物技术（中国）	YB-002	用于诱导泡沫细胞形成
青霉素&达什;链霉素	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	15140122	细胞培养用抗生素补充剂
苯甲基磺酰氟化物（PMSF）	Sigma-Aldrich（美国）	78830	蛋白酶抑制剂
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	10010023	洗涤与稀释缓冲
聚（乳酸-共乙醇酸）（PLGA，50：50;MW 90,000）	大连湄伦生物技术（中国）	MB5649-1	纳米颗粒制造用聚合物
聚碳酸酯膜滤网（200 nm，400 nm）	Whatman（英国）	800282	用于挤出
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich（美国）	P9333	裂解缓冲液的组成部分
P3000试剂	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	L3000001	转染增强剂
旋转切片机	徕卡生物系统（德国）	RM2235	用于石蜡切片
注射器泵	哈佛器械（美国）	70-3007	用于受控纳米颗粒形成
透射电子显微镜（TEM）	美国，Thermo Fisher Scientific（美国）	塔洛斯F200S	用于纳米粒子成像
三盐酸盐	Sigma-Aldrich（美国）	T2663	缓冲分量
肿瘤坏死因子α（TNF-&α;）	R&D 系统（美国）	410吨	用于激活内皮细胞
超纯水	Milli-Q（默克，美国）	ZMQSV0T01	用于纳米颗粒制备和透析