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CD47和整合素α4/β1修饰巨噬细胞膜涂层多聚(乳酸共乙醇酸)纳米颗粒的分离、合成与表征

DOI:

10.3791/70791

May 29th, 2026

In This Article

Summary

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该方案能够制备和表征CD47和整合素α4/β1共修化巨噬细胞膜包覆多聚(乳酸-共乙醇酸)纳米颗粒,用于靶向药物递送。

Abstract

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动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,是心血管发病率和死亡率的主要原因。向动脉粥样硬化部位靶向投放抗炎药物仍是重大挑战。本文提出了CD47和整合素α4/β1共修饰巨噬细胞膜包裹的多(乳酸-共乙醇酸)纳米颗粒(MMM/COL NPs)的制备和表征详细方案。该方案包括通过质粒转染和内皮素-1刺激进行巨噬细胞修饰、膜分离、NP制备和膜涂层。所得的MMM/COL非自然体通过物理化学表征、蛋白质表达分析以及体外和 体内 检测进行评估。功能验证包括评估细胞与活化内皮细胞的关联、巨噬细胞摄取、泡沫细胞中的抗炎效果以及小鼠动脉粥样硬化模型中的生物分布。此外,重点介绍了关键实验参数和质量控制步骤,以确保实验室间的重复性和一致性。该方案为生成仿生NPs提供了一种稳健且可扩展的方法,用于动脉粥样硬化研究中的靶向药物递送应用。

Introduction

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动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,导致致命的心血管事件和中风,包括动脉腔狭窄和不稳定的斑块破裂,是全球健康负担的重要原因 1,2,3。动脉粥样硬化部位炎症反应的下调是主要的治疗靶点4,5。秋水仙碱是一种强效抗炎药,已显示出减少心血管不良事件的潜力 6,7。然而,其临床效用受限于有限的治疗窗口和全身性副作用,因此需要针对性递送系统以增强斑块部位的积累,同时最大限度地减少毒性8。

细胞膜涂层纳米颗粒(NPs)已成为靶向药物递送的强大平台,利用源细胞的自然生物功能 9,10,11。在参与动脉粥样硬化的细胞类型中,巨噬细胞起着关键作用 12,13,14。

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Protocol

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本方案中描述的所有动物操作均经南京鼓楼医院机构动物护理与使用委员会批准,并遵循国立卫生研究院制定的实验动物护理和使用指南。

1. RAW 264.7巨噬细胞的修饰

  1. 准备RAW 264.7细胞,完成Dulbecco改良鹰培养基,辅以10%胎儿牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素,CD47过表达质粒,脂蛋白3000转染试剂,内皮素-1(ET-1),磷酸缓冲生理盐水(PBS)及无菌组织培养材料。
  2. 在37°C加5%二氧化碳的加湿培养箱中培养264.7细胞,保持细胞数量达到每孔约4–5×10个5 细胞,6孔板中。
  3. 进行CD47修改
    1. 通过将2.5微克质粒DNA与5微升P3000试剂混合于125微升Opti-MEM无血清培养基中制备质粒DNA溶液。
    2. 通过将3.75微升转染试剂稀释于125微升无血清培养基中制备转染试剂溶液。
    3. 用这些体积做6孔板格式。在保持DNA:P3000比为1:2(μg:μL)和DNA与转染试剂比为1:1.5(μg:μL)的同时,按比例对所有组分进行比例标度。
      注意:例如,10厘米盘使用10微克DNA、20微升P3000和15微升转染试剂。
    4. 将DNA溶液与转染试剂溶液结合,在25°C下培养15分钟....

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Results

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DLS测量使用Zetasizer Nano ZS系统在25°C、173°背散射角下进行。样品在去离子水中稀释20倍(最终浓度约0.1 mg/mL),并在测量前平衡2分钟。每个样品均以三倍测量,结果以平均±标准差表示。DLS和TEM显示膜涂层后NP尺寸增加,并证实了芯壳结构的形成(见图1)。COL核泡泡的流体动力直径为180.8±5.2纳米,PDI为0.12±0.03,ζ电位为−17.2±0.67毫伏(n=3)。膜涂层后,MMM/COL非泡泡电的尺寸为202.0±6.1纳米,PDI为0.15±0.04,ζ电位为−27.4±1.84毫伏(n=3)。典型的质量回收率为8.7±10毫克PLGA回收率为0.4毫克(产率87%)。 不理想的结果可能包括多分散指数增加(PDI > 0.3),表明尺寸均匀性差,或涂层后尺寸不增(尺寸变化<10纳米),暗示膜涂层效率低下。此外,涂层后zeta电位变化小于5 mV,可能表明膜覆盖不完整。颗粒浓度通过NP追踪分析为2.4×1011

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Discussion

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该方案提供了构建和应用CD47和整合素α4/β1共修饰巨噬细胞膜涂层NPs的综合方法,用于靶向动脉粥样硬化治疗。该系统的主要优势包括通过整合素α4/β1–VCAM-1相互作用进行主动靶向,以及减少与CD47介导信号相关巨噬细胞摄取,这一点得到了体外摄取实验(见图3)和 体内 生物分布结果(见图4)的支持。使用改良膜而非简单的原生膜,增强了特定且具有治疗意义的特性。双重修饰策略的独特之处在于它同时解决了NP药物递送中的两个主要障碍,同时不引入可能触发免疫原性的合成靶向配体。

该方案的关键步骤包括巨噬细胞修饰的效率、膜分离的完整性以及挤出过程中膜涂层的均匀性。对于膜分离,虽然我们的标准方案使用15,000 × g离心,而对于需要高度纯化质膜且细胞器污染极少的应用,建议使用100,000 × g的超速离心。比较数据显示,纯化后的膜表现出略微增强的免疫逃逸能力。

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Disclosures

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作者声明没有竞争的财务利益或其他利益冲突。

Acknowledgements

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作者感谢赵金轩博士和余嘉奇博士的科学建议,以及PROMAB工作人员的技术支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7-氨基拟霉素D(7-AAD)美国,Thermo Fisher Scientific(美国)A1310流细胞术活/死活分辨的存活染料
Alexa Fluor 488结合山羊抗兔IgG美国,Thermo Fisher Scientific(美国)A-11008CD68免疫荧光染色的二级抗体
抗小鼠CD47抗体阿布卡姆(美国)AB214453用于西方墨迹分析以验证CD47表达
抗小鼠整合素和α;4 抗体(B-2)圣克鲁斯生物技术(美国)SC-376334用于西方印迹分析以验证整合素和α;4 表达式
抗小鼠整合素和β;1个抗体(A-4)圣克鲁斯生物技术(美国)SC-374429用于西方印迹分析以验证整合素和β;1 表达式
ApoE-/-杰克逊实验室(美国)用于体内动脉粥样硬化模型
BCA检测套件美国,Thermo Fisher Scientific(美国)23225用于确定蛋白质浓度
黑色硅胶板用来安装主动脉进行体外成像
CD47质粒(pcDNA3.1(+))Generay生物技术(中国)G0177361-1含有用于过度表达的小鼠Cd47基因
秋水仙碱Sigma-Aldrich(美国)C9754纳米颗粒中的治疗有效载荷
共焦激光扫描显微镜徕卡微系统TCS SP8用于荧光成像和共定位分析
柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)美国,Thermo Fisher Scientific(美国)用于免疫荧光染色中的抗原提取
透析管(MWCO 3,500 Da)Sigma-Aldrich(美国)PURD35030用于纳米颗粒纯化
二甲基亚硫酸盐(DMSO)Sigma-Aldrich(美国)D2447纳米颗粒制备溶剂
DiI(1,1′-二八癸基-3,3,3′,3′-四甲基环氨基碳氰酸过氯酸盐)Beyotime(中国)C1036纳米粒子核心的荧光标记
DiO(3,3′-二八癸基氧基酸过氯酸盐)Beyotime(中国)C1038巨噬细胞膜的荧光标记
导演Beyotime(中国)Y239280用于体内荧光成像
达皮美国,Thermo Fisher Scientific(美国)D3571荧光成像用核反染剂
杜尔贝科改良型鹰型中型(DMEM)美国,Thermo Fisher Scientific(美国)11965092细胞培养基
动态光散射分析仪(Zetasizer Nano ZS)马尔文潘纳利蒂卡(英国)用于动态光散射(DLS)测量纳米颗粒尺寸、PDI和ζ势
ELISA套件R&D 系统(美国)取决于目标细胞因子用于定量炎症性细胞因子
内皮素-1(ET-1)Sigma-Aldrich(美国)E7764用于刺激整合素和α;4/β1 表达式
胎儿牛血清(FBS)Gibco(美国Thermo Fisher Scientific)10091148细胞培养基补充剂
流式细胞仪生物科学学士(美国)FACSCalibur用于荧光信号采集
流式细胞术分析软件(FlowJo v10.8.1)生物科学学士(美国)用于流式细胞术数据分析
人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)福恒生物技术(中国)FH1122用于体外靶向测定
图像分析软件(ImageJ)美国国立卫生研究院用于定量图像分析
体内成像系统珀金埃尔默(美国)IVIS Lumina III用于全身荧光成像
异丙醇(60%)Sigma-Aldrich(美国)34863用于油红O染色时的分化
脂氧胺3000美国,Thermo Fisher Scientific(美国)L3000001转染试剂
磁力搅拌器和搅拌杆用于纳米颗粒制备
马松三色染色套件阿布卡姆(美国)AB150686用于胶原染色
迷你挤出机Avanti极地脂质(美国)610000用于膜挤压
小鼠RAW 264.7细胞系福恒生物技术(中国)FH0328巨噬细胞的来源
小鼠平滑肌细胞系福恒生物技术(中国)FH-Y063用于安全评估
油红OSigma-Aldrich(美国)O0625用于脂质染色
光学MEM美国,Thermo Fisher Scientific(美国)31985062用于转染的还原血清培养基
氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)一源生物技术(中国)YB-002用于诱导泡沫细胞形成
青霉素&达什;链霉素美国,Thermo Fisher Scientific(美国)15140122细胞培养用抗生素补充剂
苯甲基磺酰氟化物(PMSF)Sigma-Aldrich(美国)78830蛋白酶抑制剂
磷酸盐缓冲盐水(PBS)美国,Thermo Fisher Scientific(美国)10010023洗涤与稀释缓冲
聚(乳酸-共乙醇酸)(PLGA,50:50;MW 90,000)大连湄伦生物技术(中国)MB5649-1纳米颗粒制造用聚合物
聚碳酸酯膜滤网(200 nm,400 nm)Whatman(英国)800282用于挤出
氯化钾(KCl)Sigma-Aldrich(美国)P9333裂解缓冲液的组成部分
P3000试剂美国,Thermo Fisher Scientific(美国)L3000001转染增强剂
旋转切片机徕卡生物系统(德国)RM2235用于石蜡切片
注射器泵哈佛器械(美国)70-3007用于受控纳米颗粒形成
透射电子显微镜(TEM)美国,Thermo Fisher Scientific(美国)塔洛斯F200S用于纳米粒子成像
三盐酸盐Sigma-Aldrich(美国)T2663缓冲分量
肿瘤坏死因子α(TNF-&α;)R&D 系统(美国)410吨用于激活内皮细胞
超纯水Milli-Q(默克,美国)ZMQSV0T01用于纳米颗粒制备和透析

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