本方案可用于制备和表征CD47与整合素α4/β1共修饰的巨噬细胞膜包被聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒，以实现靶向药物递送应用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本方案可用于制备和表征CD47与整合素α4/β1共修饰的巨噬细胞膜包被聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒，以实现靶向药物递送应用。
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是心血管疾病发病率和死亡率的主要原因。将抗炎药物靶向递送至动脉粥样硬化病灶仍是一项重大挑战。本文中，我们提供了一种详细的实验方案，用于制备和表征CD47与整合素α4/β1共修饰、负载秋水仙碱并由巨噬细胞膜包覆的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒（MMM/COL NPs）。该方案包括通过质粒转染和内皮素-1刺激对巨噬细胞进行修饰、细胞膜分离、纳米颗粒制备及膜包覆过程。所获得的MMM/COL NPs通过理化特性表征、蛋白质表达分析以及体外和体内实验进行评估。功能验证包括检测其与活化内皮细胞的细胞结合能力、巨噬细胞摄取情况、在泡沫细胞中的抗炎效应，以及在小鼠动脉粥样硬化模型中的生物分布。此外，本文还强调了关键实验参数和质量控制步骤，以确保不同实验室之间的可重复性和一致性。本方案为动脉粥样硬化研究中用于靶向药物递送的仿生纳米颗粒的制备提供了一种稳健且可放大的方法。
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，通过动脉管腔狭窄和不稳定斑块破裂导致致命的心血管事件和脑卒中，给全球健康带来重大负担1,2,3。在动脉粥样硬化病灶处抑制炎症反应是主要的治疗靶点4,5。秋水仙碱是一种强效抗炎药物，在减少不良心血管事件方面显示出良好前景6,7。然而，由于其治疗窗狭窄以及存在全身性副作用，限制了其临床应用，因此需要开发靶向递送系统，以提高药物在斑块部位的富集，同时降低毒性8。
细胞膜包被的纳米颗粒（NPs）已成为一种强大的靶向药物递送平台，可利用来源细胞的天然生物学功能9,10,11。在参与动脉粥样硬化的细胞类型中，巨噬细胞发挥着关键作用12,<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案中描述的所有动物实验程序均经南京鼓楼医院机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院制定的《实验动物护理和使用指南》。
1. RAW 264.7 巨噬细胞的改造
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
DLS 测量使用 Zetasizer Nano ZS 系统在 25°C 下进行，背向散射角为 173°。样品用去离子水稀释 20 倍（最终浓度约为 0.1 mg/mL），测量前平衡 2 分钟。每个样品重复测量三次，结果以均值 ± 标准差表示。DLS 和 TEM 显示，包膜后纳米颗粒尺寸增大，并证实了核-壳结构的形成（图1）。COL NPs 的流体动力学直径为 180.8 ± 5.2 nm，多分散系数（PDI）为 0.12 ± 0.03，zeta 电位为 −17.2 ± 0.67 mV（n = 3）。膜包覆后，MMM/COL NPs 的粒径为 202.0 ± 6.1 nm，PDI 为 0.15 ± 0.04，zeta 电位为 −27.4 ± 1.84 mV（n = 3）。典型的质量回收率为每 10 mg PLGA 回收 8.7 ± 0.4 mg（产率为 87%）。 次优结果可能包括多分散性指数（PDI）升高 > 0.3），表明粒径均匀性较差，或包衣后粒径未增加（粒径变化） < 10 nm），表明膜包覆效率较低。此外，包覆后zeta电位.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案提供了一种构建和应用CD47与整合素α4/β1共修饰的巨噬细胞膜包被纳米颗粒用于靶向动脉粥样硬化治疗的综合方法。该系统的关键优势包括通过整合素α4/β1与VCAM-1相互作用实现主动靶向，以及通过CD47介导的信号通路减少巨噬细胞对纳米颗粒的摄取，上述效应已在体外摄取实验中得到验证图3）和 体内 生物分布结果（图4）。与简单的天然膜相比，使用修饰后的膜可增强特定的、具有治疗相关性的性能。这种双重修饰策略具有独特性，因为它能同时克服纳米颗粒药物递送中的两大主要障碍，且无需引入可能引发免疫原性的合成靶向配体。
该方案中的关键步骤包括巨噬细胞修饰的效率、细胞膜分离的完整性，以及挤出过程中膜包覆的均一性。在膜分离步骤中，尽管本方案的标准流程采用15,000 × g离心，但对于需要高度纯化质膜且细胞器污染最少的应用，建议使用100,000 × g的超速离心。比较数据显示，纯化后的膜在免疫逃逸能力方面略有增强。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
作者感谢赵金璇博士和余佳琪博士提供的科学建议，以及PROMAB工作人员提供的技术支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 7-氨基放线菌素D（7-AAD） | 赛默飞世尔科技公司（美国） | A1310 | 用于流式细胞术活/死细胞区分的活力染料 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG | 赛默飞世尔科技（美国） | A-11008 | CD68免疫荧光染色二抗 |
| 抗小鼠 CD47 抗体 | Abcam（美国） | ab214453 | 用于 Western blot 分析以验证 CD47 表达 |
| 抗小鼠整合素 α4 抗体（B-2） | Santa Cruz Biotechnology（美国） | sc-376334 | 用于 Western blot 分析以验证整合素 α4 表达 |
| 抗小鼠整合素 β1 抗体（A-4） | Santa Cruz Biotechnology（美国） | sc-374429 | 用于 Western blot 分析以验证整合素 β1 表达 |
| ApoE-/- 小鼠 | 杰克逊实验室（美国） | N/A | 用于体内动脉粥样硬化模型 |
| BCA 法检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司（美国） | 23225 | 用于测定蛋白质浓度 |
| 黑色硅胶板 | N/A | N/A | 用于固定主动脉以进行离体成像 |
| CD47 质粒（pcDNA3.1(+)） | 泛生科技（中国） | G0177361-1 | 包含小鼠 Cd47 基因用于过表达 |
| 秋水仙碱 | Sigma-Aldrich（美国） | C9754 | 纳米颗粒中的治疗性有效载荷 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | 徕卡显微系统 | TCS SP8 | 用于荧光成像和共定位分析 |
| 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0） | 赛默飞世尔科技（美国） | N/A | 用于免疫荧光染色中的抗原修复 |
| 透析管（截留分子量 3,500 Da） | Sigma-Aldrich（美国） | PURD35030 | 用于纳米颗粒纯化 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich（美国） | D2447 | 纳米颗粒制备用溶剂 |
| DiI（1,1-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）′-二正十八烷基-3,3,3′,3′-高氯酸四甲基吲哚羰花青 | 碧云天（中国） | C1036 | 纳米颗粒核心的荧光标记 |
| DiO（3,3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐 | 碧云天（中国） | C1038 | 巨噬细胞膜的荧光标记 |
| DiR | 碧云天（中国） | Y239280 | 用于活体荧光成像 |
| DAPI | 赛默飞世尔科技公司（美国） | D3571 | 荧光成像用核复染 |
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | 赛默飞世尔科技公司（美国） | 11965092 | 细胞培养基 |
| 动态光散射分析仪（Zetasizer Nano ZS） | 马尔文帕纳科（英国） | N/A | 用于纳米颗粒尺寸、多分散系数（PDI）和泽塔电位的动态光散射（DLS）测量 |
| ELISA试剂盒 | R&D Systems（美国） | 取决于目标细胞因子 | 用于定量炎症性细胞因子 |
| 内皮素-1（ET-1） | Sigma-Aldrich（美国） | E7764 | 用于刺激整合素 α4/β1 表达 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco（Thermo Fisher Scientific，美国） | 10091148 | 细胞培养基添加剂 |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学（美国） | FACSCalibur | 用于荧光信号采集 |
| 流式细胞术分析软件（FlowJo v10.8.1） | BD 生物科学（美国） | N/A | 用于流式细胞术数据分析 |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） | 富恒生物技术（中国） | FH1122 | 用于体外靶向实验 |
| 图像分析软件（ImageJ） | 美国国立卫生研究院 (USA) | N/A | 用于定量图像分析 |
| 活体成像系统 | 珀金埃尔默（美国） | IVIS Lumina III | 用于全身荧光成像 |
| 异丙醇（60%） | Sigma-Aldrich（美国） | 34863 | 用于油红O染色过程中的分化步骤 |
| Lipofectamine 3000 | 赛默飞世尔科技公司（美国） | L3000001 | 转染试剂 |
| 磁力搅拌器和搅拌子 | N/A | N/A | 用于纳米颗粒制备 |
| 马松’s Trichrome 染色试剂盒 | Abcam（美国） | ab150686 | 用于胶原染色 |
| 小型挤出机 | Avanti Polar Lipids（美国） | 610000 | 用于膜挤出 |
| 小鼠 RAW 264.7 细胞系 | 富恒生物技术（中国） | FH0328 | 巨噬细胞来源 |
| 小鼠平滑肌细胞系 | 富恒生物技术（中国） | FH-Y063 | 用于安全性评估 |
| 油红O | Sigma-Aldrich（美国） | O0625 | 用于脂质染色 |
| Opti-MEM | 赛默飞世尔科技公司（美国） | 31985062 | 用于转染的低血清培养基 |
| 氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL） | 中国易源生物科技有限公司 | YB-002 | 用于诱导泡沫细胞形成 |
| 青霉素–链霉素 | 赛默飞世尔科技（美国） | 15140122 | 细胞培养用抗生素添加剂 |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma-Aldrich（美国） | 78830 | 蛋白酶抑制剂 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技公司（美国） | 10010023 | 洗涤与稀释缓冲液 |
| 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA，50:50；分子量 90,000） | 大连美仑生物技术（中国） | MB5649-1 | 用于纳米颗粒制备的聚合物 |
| 聚碳酸酯膜滤器（200 nm，400 nm） | 沃特曼（英国） | 800282 | 用于挤出 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich（美国） | P9333 | 裂解缓冲液组分 |
| P3000 试剂 | 赛默飞世尔科技公司（美国） | L3000001 | 转染增强剂 |
| 旋转式切片机 | Leica Biosystems（德国） | RM2235 | 用于石蜡切片 |
| 注射泵 | 哈佛仪器公司（美国） | 70-3007 | 用于控制纳米颗粒的形成 |
| 透射电子显微镜（TEM） | 赛默飞世尔科技（美国） | Talos F200S | 用于纳米颗粒成像 |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich（美国） | T2663 | 缓冲液组分 |
| 肿瘤坏死因子α（TNF-α）α) | R&D Systems（美国） | 410-MT | 用于激活内皮细胞 |
| 超纯水 | Milli-Q（默克，美国） | ZMQSV0T01 | 用于纳米颗粒制备和透析 |