构建高效的干细胞衍生小鼠胚囊模型以用于环境研究

Summary

该方案描述了iGATA4-胚泡体的生成和分析，这是一种可扩展的基于干细胞的模型，重现了小鼠囊胚的关键特征，包括谱系组织和空蚀，并实现了对影响早期胚胎发育的环境和分子扰动的可重复性、高通量评估。

Abstract

基于干细胞的胚胎模型为研究早期哺乳动物发育及其对环境扰动的敏感性提供了有力的平台。本文提出了一种稳健且易得的方案，用于利用胚胎干细胞（ESC）、滋养层细胞干细胞（TSCs）以及为诱导GATA4表达设计的胚胎干细胞（iGATA4-ESCs）生成高保真小鼠胚胎。该系统产生iGATA4囊胚样，准确复原自然E4.5囊胚形态、谱系比例和转录特征，提供原始内胚层（PE）、表母细胞（EPI）和营养外胚层（TE）区室的可靠体 外 模型。该方案首先展示了如何维持和准备形成胚球所需的三种干细胞群体。随后概述了iGATA4胚胎在植入前培养条件下的逐步组装过程，重点介绍了关键的实验参数。为实现严格的表征，提供了经过测试的胚球固定、染色和成像工作流程。最后，举例展示了iGATA4类胚胎如何用于高通量测定。通过将大量胚球体暴露于特定环境因素下，形态变化、谱系分配和发育进展可以快速且可重复地量化。该方案共同建立了一个可扩展的平台，用于建模着床前发育、剖析早期谱系决策，以及进行多参数筛选以评估环境或分子对囊胚形成的影响。

Introduction

理解早期哺乳动物胚胎如何自我组装以及常见环境因素如何对其形成产生负面影响，需要可重复、实验可访问且可扩展的模型系统。通过结合胚胎和胚胎外干细胞生成的集成类胚胎模型，提供了^{这样的平台1,2}。该方案描述了胚胎干细胞（ESCs）、滋养层细胞干细胞（TSCs）以及为诱导GATA4表达设计的ESCs（iGATA4-ESCs），如何在植入前条件下组装，生成具有强健且比例适中的原始内胚层（PE）、表母细胞（EPI）和营养外胚层（TE）谱系的胚胎。最新研究表明，这些被称为iGATA4-囊胚3的^结构在谱系比例、转录特征和功能标记表达上与E4.5囊胚相似。体外培养时，12.5%的这些结构会转变为着床后形态。重要的是，它们可以通过毒理学和环境筛查。

该技术的发展源于已有的爆^{裂体系统2,4,5}的局限性。尽管许多协议^{6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21}产生类似早期囊胚的空化结构，大多数效率较低，或产生PE形成不完整、细胞身份不明或谱系比例错误的结构。这些不一致性降低了它们在机制研究和高通量微扰筛中的适用性。由于体内PE的规范遵循GATA6、SOX17、GATA4和SOX7的激活，且PE或其衍生物内脏内胚层（VE）的缺陷会抑制植入周发育23,24,25,26,27，从而在体外强制执行该转录程序提升爆球体的真实度。携带条件性GATA4转基因的ESC会强健转分化为VE，并在着床后条件下与ESC和TSC结合时，生成整合胚胎模型，实现胃态化并启动器官发生^28,29,30,31。该原理被应用于着床前条件，证明iGATA4-ESC可靠地产生PE并产生与自然囊胚极为相似的囊胚^3。

该方法克服了此前利用干细胞进行囊胚建模的局限，具有高的囊胚形成效率（80%的结构为囊胚，其中75%表现出正确的谱系组织和比例）和高胚胎相似性。此外，iGATA4-囊胚的模块化组装，每个囊胚谱系均源自独立培养的干细胞群体，提供了对每个胚胎区室的直接实验访问。这些特性使该系统特别适合多参数筛选应用。由于它生成了大量形态学上一致的结构队列，具有准确比例的TE、EPI和PE谱系，因此能够实现谱系特异性反应的平行扰动和定量化，统计能力是自然胚胎无法达到的。

作为原理验证，测量了生理范围^{32、33、34、35、36、37、38} 的常见环境因素对胞胚发育的影响。评估了咖啡因、尼古丁、乙醇和氨基酸修饰对空化速率、形态、适应度及谱系比例的影响，涵盖不同浓度和时间处理窗口。大多数疾病（咖啡因、乙醇、尼古丁以及模拟低蛋白饮食的）会导致胚球异常形成和结构质量受损。相比之下，提高分支链氨基酸浓度（类似高蛋白饮食）则提高了胚球形成的效率和质量。这些结果与体 外培养的天然小鼠囊胚囊3的观察效果相呼^应，表明该系统能够捕捉细微的剂量依赖性表型，并支持自然胚胎无法实现的可扩展、多维筛选流程。

在更广泛的胚胎建模背景下，该技术表明，用于建模集成着床后发育的细胞同样可以作为植入前模型使用。该方法特别适用于需要对囊胚样结构进行可扩展建模、PE形成准确且谱系整合稳健的应用。然而，与其他基于干细胞的小鼠囊胚囊模型一样，iGATA4囊胚移植到宿主小鼠后无法着床和进一步发育，因此不适合胚胎与母体相互作用的研究。总体而言，该方案提供了一种可靠且易于获取的方法，用于生成高保真度的胚胎，以模拟哺乳动物胚胎早期细胞类型的决策。

Protocol

本方案中描述的所有程序均涉及已建立的细胞系，并按照加州理工学院的生物安全机构指南执行。未进行活体动物或人体实验。

多条ESC和TSC线已被检测，发现支持iGATA4-囊胚形成。先前^研究中的 ESCs、iGATA4-ESC和TSCs已成功完成本方案中描述的所有步骤。同一作者描述了从先前建立的CD1（ICR）小鼠ESC系生成iGATA4-ESCs。

TSC是在商业化的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）基础上培养的。本协议中使用的所有化学品、试剂、套件、设备和软件均列于 材料表中。

1. 培养小鼠干细胞以形成胚球

1. MEF给料板的制备
   1. 每孔在去离子（DI）水中涂覆1.5毫升0.2%（w/v）明胶，覆盖6孔培养板。在常湿地37°C下孵育至少45分钟。
   2. 在培养过程中，准备一个15毫升离心管，内含4毫升FC培养基（见表1），预热至37°C。
   3. 用水浴解冻MEF小瓶，用8字形动作，直到只剩下一小团冰。将内容物转移到准备好的管内，然后上下移液器充分混合。离心机在500 ×克 下进行4分钟。
   4. 抽取上清液，并将沉淀液重新悬浮于1毫升FC培养基中。调整到足够容量，每孔1.5毫升中镀膜约16万个细胞。
   5. 抽取明胶，并每孔镀1.5毫升MEFs。在常常的环境中过夜无干扰。
   6. 次日更换为新鲜的每孔1.5毫升FC培养基。每48小时更换一次介质。装甲后2至7天使用MEF。MEFs可能健康寿命更长，但其支持TSC生长的能力可能会受到影响。

注意： 使用BSL-2技术，在生物安全级别（BSL）1层流柜中进行所有小鼠细胞培养。

2. 小鼠胚胎干细胞（WT ESCs和iGATA4-ESCs）的解冻与传递
   1. 解冻水电控器或iGATA4-电子电控器，步骤 为1.1.1–1.1.3。离心后，将细胞重新悬浮在1毫升N2B27/2i/LIF培养基中（见表1），并在涂有明胶的6孔板上播种~50,000个细胞，每孔含约1.5毫升。在常氧环境中37°C孵育，培养基每48小时更换一次。
   2. 在通过前，确保菌落紧密且呈圆形，突出物最少。每2至3天一班。
      注意： WT电子管细胞和iGATA4-ESC在用多西环素（DOX）诱导前形态上无法区分。
   3. 每孔在去离子水中涂覆1.5毫升0.2%明胶。在37°C下孵育至少45分钟。
   4. 每孔加入500微升细胞解离试剂，并培养3分钟。加入2毫升FC培养基，同时轻轻移液边缘。显微镜下确认>90%的脱落。如果细胞仍然附着，轻柔移液器以帮助重新休眠。
   5. 将细胞悬浮液转移到15毫升离心管中，并以500 ×克 离心4分钟。
   6. 抽取上清液，并将沉淀液重新悬浮于1毫升N2B27/2i/LIF培养基中。用血细胞计测定细胞浓度，10微升。调整体积，每孔播种~50,000个细胞。
   7. 抽取明胶并播种细胞。在常态中孵育。第二天换药，之后每48小时换一次。
3. 小鼠滋养层干细胞（TSCs）的解冻与传递
   1. 按照 步骤1.1.1–1.1.3解冻TSC。离心后，将细胞重新悬浮在1毫升TSF4H培养基中（见表1），并在MEF涂层的6孔板中播种每孔约20,000个细胞。在37°C、5%二氧化碳、5%氧气（缺氧）下孵育，培养基每24小时更换一次。
   2. 确保菌落较大（直径>75微米）且扁平后再通过。每孔加入500微升细胞解离试剂，培养5分钟。轻轻移液时加入2毫升FC培养基。确认>90%脱离。
   3. 将细胞转移到离心管，以500 ×克 旋转4分钟。
   4. 再悬浮于1毫升TSF4H培养基中。确定浓度并调整为每孔约20,000个细胞。
   5. 将板状装甲到MEFs上，并在缺氧下孵育。每24小时更换培养基，每2-3天换一次，然后进行群落合并。

2. iGATA4-质泡的形成

1. 用于细胞聚合的微孔聚合板制备
   1. 在微孔聚合板的每个孔中加入500微升抗粘附冲洗液。在2000 克× 克离心机下离心5分钟，并适当平衡以去除微孔中滞留的空气。在常氧环境中37°C孵育至少1小时或过夜。
2. 爆球体制备，第0天——WT和iGATA4-ESC的准备与镀层
   1. 预热N2B27/2i/LIF、FC和FCYL培养基（FC + 10 ng/mL小鼠重组LIF（mLIF）+2 μM ROCK抑制剂Y27632）至37°C。 将0.2%明胶放入去离子水中，并准备好细胞解离试剂。
   2. 吸入防粘附溶液时不触及井底。用1毫升PBS洗涤二次，用1毫升FCYL培养基洗涤一次。沿壁移液器，避免损坏微孔。
   3. 准备一个明胶涂层的6孔板（培养≥45分钟）用于传代细胞。
   4. 通过抽取培养基并每孔添加500微升细胞解离试剂，收集WT和iGATA4-ESCs。在37°C下孵育3分钟。 加入2毫升FC培养基，轻轻移液。显微镜下确认完全脱离。转移到15毫升管子中，用500 × 克离心4分钟。
   5. 再悬浮于1毫升FCYL培养基中。用血细胞计测定细胞浓度，10微升。调整为50万至70万细胞/毫升。计算每微井需5个WT电阻器和5个iGATA4-ESC的体积（每井6,000个细胞）。
      注意： 如果需要，可以优化其他ESC线路。起始范围为每微井4至7个ESC，ESC与iGATA4-ESC的比例为1：1。
   6. 每孔准备500微升的细胞悬浮液。使用1000微升移液器滴入微孔聚集板。用100 ×克 离心机3分钟，确认分布均匀。孵育6小时，直到聚集体形成。
   7. 通道剩余的ESC，见 第1.2节。
3. 质球体制备，第0天——TX培养基的准备
   1. 使用DMEM/F12制备~20 mL TX基础培养基（见表2）。每次实验都要新鲜准备。
      1. 添加200微升200 mM L-丙烯酰-L-谷氨酰胺补充剂（最后2 mM）。存货温度为4°C。
      2. 加入200微升10,000 U/mL青霉素/链霉素（最终各100 U/mL）。储存温度为−20°C。
      3. 加入40微升32毫克/毫升L-抗坏血酸（最终64微克/毫升）。在去离子水中准备，过滤消毒后储存在−20°C。
      4. 加入20微升的亚烯酸钠（最终14 ng/mL）。准备并储存在−20°C。
      5. 加入240微升NaHCO₃（最终543微克/毫升）。解冻后彻底搅拌均匀。
      6. 加入20微升全转铁蛋白（最终10.7微克/毫升）。解冻后搅拌。
      7. 加入~37.5微升胰岛素（最终19.4微克/毫升;批次依赖）。保存温度为4°C。
   2. 使用前立即加入Y27632至最终浓度20 μM，CHIR99021至3 μM，IL-11至30 ng/mL，FGF4至25 ng/mL，肝素至1 μg/mL，mLIF至10 ng/mL，TGFβ至15 ng/mL，8Br-cAMP至25 μM。
4. 胚球体制备，第0天 — TSC的准备与装甲
   1. 预热TSF4H、FC（表1）和传输介质（第2.3节）。准备明胶涂层板（≥45分钟）进行MEF耗尽。
   2. 每孔添加500微升细胞解离试剂，并在缺氧下培养5分钟，以收集TSCs。加入2毫升FC培养基，轻轻移液。确认脱离。转移到管子中，用离心机在500 ×克 下4分钟。
      注意： 培养>4天的TSC可能需要长达10分钟的细胞解离试剂处理。
   3. 将重悬液置于1毫升TSF4H培养基中，并以1：2比例调整至适合电镀的体积。
   4. 在明胶涂层孔上进行MEF耗尽。缺氧潜伏~45分钟。确保MEF能够挂钩，而TSC大多保持未编入。
   5. 将微孔聚集板孔中的900微升培养基替换为500微升TX培养基。回到缺氧状态。
   6. 将含TSC的上清液转移到管子内，同时不扰动连接的MEF。确定浓度（目标500,000–700,000细胞/毫升）。
   7. 计算每微孔12个TSC的体积（每孔14,400个细胞）。如果需要进一步浓缩，就用离心机。
      注意： 优化其他TSC品系（每微孔建议10–15个细胞）。
   8. 每孔滴加500微升电池悬浮液。离心机在100 ×克 下离心3分钟。确认分布，并在缺氧条件下培养24小时。
   9. 根据需要通过剩余的TSC（第1.3节）。
5. 爆球体准备，第一天——诱导
   1. 加入TSC约24小时后，每孔加入20微升5 mM 8Br-cAMP和1微升1 μg/mL DOX。在缺氧条件下潜伏48–72小时。
6. 胚球体准备，第3天——固定
   1. 使用切割的1000微升移液器尖端重新吊起聚集体。转移到2毫升管内，沉降5分钟。
   2. 去除上清液，加入250微升4%对甲醛（PFA）。轻柔地重新暂停。
      注意： 在排风柜内使用适当的个人防护装备处理PFA。
   3. 孵化15分钟，每5分钟弹一次。
   4. 去除PFA，加入300微升PBST（PBS+0.1% Tween-20）。轻轻搅拌。在染色前，保存在4°C下<1周。
7. 胚球的免疫荧光
   1. 每个样品将150微升液体转移到96孔U底板。
   2. 加入100微升渗透缓冲液，培养20分钟。更换为原级抗体溶液，并在4°C下培养一夜。
   3. 用PBST洗3×（每次5分钟）。添加二级抗体。
   4. 在室温下、黑暗中孵化2小时。
   5. 洗涤3次×然后转移到成像碟中。
   6. 利用共聚焦显微镜拍摄的图像（≥25×物镜，NA ≥0.8）。

3. 使用iGATA4-爆胚模型的高通量筛选

1. iGATA4-质棒胚制备与环境因素测试
   1. 按照 第2.1节 描述制备微孔聚集板，并在 第2.2–2.4节生成iGATA4爆裂体。准备足够的井，包括适当的控制措施。包括空白对照（按照标准方案制备的爆裂体）、载流子对照，以及一个或多个实验条件。
   2. 在缺氧条件下孵育胚球过夜。TSC播种后约24小时，准备TX培养基，补充8Br-cAMP、多西环素（DOX）及目标化合物（或载体控制）。以下条件已测试：
      1. 咖啡因：3.5 mg/L，稀释自超纯水库存。
      2. 尼古丁：330 ng/L，稀释自100%乙醇（EtOH）库存。
      3. 乙醇：17 mM，稀释自绝对乙醇。
      4. 高支链氨基酸（BCAA）：相对于基线浓度（0.45 mM L-白氨酸，0.45 mM L-纈氨酸，0.42 mM L-异亮氨酸），均由超纯水中浓缩存制备。
      5. 低蛋氨酸和亮氨酸：相对于基线浓度（0.12 mM L-蛋氨酸，0.45 mM L-白氨酸）为−5%、−25%、−50%、−100%，使用Met-/Leu-无DMEM/F12制备。无甲酰/无甲酰/无甲酰亚-甲基苯甲酰胺（LM-DMEM）在使用前会补充1份火腿F-12营养混合液。
         注意： 在排气柜中准备并处理浓缩咖啡因和尼古丁库存，使用适当的个人防护装备（PPE;手套、实验室外套、护目镜）。乙醇易燃，必须远离热源。
   3. 从每个孔中抽取培养基，加入1毫升含化合物TX培养基。一次只处理一个，避免干燥。将平板放回缺氧培养箱，培养至第3天。
   4. 在第3天使用透射式光学显微镜捕捉具有代表性的明场图像。固定结构并按照第2.6和2.7节描述进行免疫荧光。
      注意： 根据实验目标调整处理窗口。治疗可以在早期聚集阶段（第1天）或晚期阶段（如腔体扩张）施用。示例窗口包括第1–3天、第1–2天（随后为媒体替换）和第2–3天。
2. 多参数iGATA4-胚胎分析
   1. 利用明场图像量化含有空化结构（即具有明确中央空腔的结构）的井的比例，并测量爆裂体直径。
      1. 在图像分析软件中打开图像。
      2. 使用直线工具在每个结构上画一条线。
      3. 使用 Analyze > Measure来测量直径。
   2. 选择具有代表性的免疫染色样本（每个生物复制品20–40个结构，每种条件至少有三个生物复制品）及图像，详见 第2.7节。
   3. 使用免疫荧光标记物定量总细胞数和谱系组成：TE（CDX2阳性）、EPI（SOX2阳性和SOX17阴性）和PE（SOX17阳性）。
   4. 通过确定PE细胞是否在内细胞团（ICM）内与EPI细胞空间隔离（二元分类：是/否）来评估结构组织和形态。
   5. 将形态分类为良好（清晰的囊胚状结构，具有明确的腔体，TE、EPI和PE区室组织良好）、中等（轻微异常，如形状不规则或部分形成的腔体），或差（重大异常，如缺洞或谱系紊乱/未分类）。
   6. 量化额外参数，如适用的腔体大小或体积。使用生物信息学工具或其他工具进行绘图和统计分析，以及用于细胞计数和/或显示图像准备的3D图像分析软件。

Results

在适当的培养条件下维持ESCs和iGATA4-ESCs（正常氧）和TSCs（缺氧）对于成功生成质胚胎至关重要。如描述培养时，ESCs和iGATA4-ESC应基本无异，3天后形成中等大小、圆形且分明的菌落。扁平菌落或突出边缘的表现表明分化初期，此类培养物不应用于胞菌形成。TSC应形成平坦的上皮菌落，边缘略微隆起，中心较平坦。TSC菌落过度生长或合并（通常在培养>3天后）常导致不良的质泡体结果（见图1）。

在iGATA4-质泡体组装过程中，有若干早期迹象表明协议成功（图2A，B）。ESC和iGATA4-ESC聚合约6小时后，微孔底部应可见紧密的细胞聚集体。松散聚集体表明细胞解离试剂暴露过多，从而减少细胞间粘附。下一步进阶（TSC添加;第2.4节）仅在观察到紧密聚集体时才会发生（图2B，D0.5时间点）。此阶段的免疫染色应显示均匀的SOX2⁺和GATA4⁻聚集体（图2B，D0.5时间点）。

加入TSC并过夜孵育后，应可见一个被CDX2⁺细胞包围的单一凝聚体（见图2B）。聚集体表面存在大型未聚集细胞通常表明存在残留MEF。MEF污染会降低爆裂体形成效率;因此，在聚集前，充分的MEF枯竭对于获得以TSC为主的种群至关重要。可用40微米的细胞滤器去除残留的MEF，尽管这可能会降低TSC产量。CDX2⁺覆盖不完整或过多可通过调整每微孔添加的TSC数量（推荐范围：10–15）来纠正。

添加DOX和8Br-cAMP后，蛀牙通常在第2天出现，并可能持续到第3天。在明视显微镜下，空腔在爆裂体内部呈现为清晰、空旷的空间（图2B，C;白色虚线）。GATA4⁺细胞在DOX诱导后不久出现，并逐步分选到ICM样腔室表面（见图2B）。成功的爆裂体形成特征是高空化效率（通常每个微孔聚集板约80%的空化效率;图2D），一个单层的CDX2⁺样外上皮，一个囊胚样腔体，以及一个圆形ICM样腔室，内含SOX2⁺类肾上腺素细胞，覆盖着GATA4⁺类PE细胞（图2C–E）。

常见的次优结果包括无空化结构、形状不规则的爆裂体具有多个腔体或类似ICM的隔间，以及结构或细胞碎片较少的孔。虽然预计约20%的异常结构（见图2C），但较高的发生率可能表明诸如TX培养基制备不正确、起始细胞质量差、第一天未添加DOX或8Br-cAMP，或培养基变换时结构位移等问题。

对于高通量筛选应用，未处理和车辆控制井应产出与正对照条件相当的爆裂体（图3A，B）。实验处理可能影响多种质量指标，包括胚球大小（图3C）、空化效率、总细胞数和谱系特异性细胞数（图3D）、PE分选以及整体形态（图3E）。例如，在爆裂体形成过程中用咖啡因、尼古丁或乙醇处理，导致结构变小，空化效率降低，细胞总数或ICM细胞数减少，PE分选受损，形态变差。相比之下，分支链氨基酸浓度的增加会产生更大、更高度空化的胚球，细胞数量增加，形态也更为改善（见图3C–E）。实验间存在生物学变异性，凸显了在每个实验中同时包含空白和载流子对照的重要性。

图1：优质和劣质WT电控器、iGATA4电静止器和TSC的示例。 WT ESC、iGATA4-ESC和TSC的明视场显微照片显示，在N2B27/2i/LIF（ESCs）或TSF4H培养基中培养2–3天后，预期的菌落形态。题为“WT ESCs – 质量差”的面板展示了形态不理想的细胞，包括扁平的菌落并突出边缘（红色箭头）。面板“TSC过度生长”展示了经过4天培养后合并并扩大的TSC菌落。比例条：所有面板均为100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：iGATA4类胚胎的示意图及预期形态。 转载自 《发育细胞》，第61卷，Jorgensen V、Bao M、Junyent S 等，《 高效干细胞衍生小鼠胚胎模型用于环境研究》，第193–207页第6页，版权所有（2025）³，获爱思唯尔许可。（A）自然小鼠囊胚发育的示意图（顶部）及基于干细胞的胚泡建模，使用WT ESCs、iGATA4-ESCs和TSCs。
（B）显微照片显示协议不同阶段预期的形态和标记表达。最大强度投影（MIP）;虚线划定空腔。比例条：20微米。（C）iGATA4-胚泡在第3天的明场图像。比例杆：100微米。
（D）利用在常氧或缺氧条件下预培养的TSC产生的iGATA4-囊泡体腔化速率;骨团在缺氧条件下培养。n ≥ 4;误差条代表均值的标准误。（E） 对E4.5囊泡和第3天iGATA4类囊胚进行免疫染色，以检测谱系标记（CDX2，青色;10月4日，红色;GATA4，绿色）。最大强度投影（MIP）;标注处显示单Z平面。比例尺：25微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。环境因素对胞体形成和质量的影响。（A）iGATA4-胚泡体在环境因素（咖啡因、尼古丁、乙醇及模拟高蛋白和低蛋白饮食条件下）处理的代表性免疫荧光三维图像（上方）和IMARIS表面重建（下方）。比例条：所有图像均为25微米。（B）实验工作流程示意图。（C）不同处理条件下的胚胎直径。该区间代表第10至90百分位;方框表示四分位数范围;该线表示中位数。统计分析采用单向方差分析并进行多重比较。（D） 对照组胚和处理胚胎的总（灰色）、营养体胚层（青色）、表胚层（红色）和原始内胚层（绿色）细胞数的定量。条形代表平均值;误差条表示标准差。统计分析采用单向方差分析并进行多重比较。（E）在对照和治疗条件下，量化被归类为“良好”（谱系分类正确且形态异常极少）、“中等”（形态大致正确但有轻微异常，包括EPI-PE分选不完全）或“差”（形态严重异常且谱系组织紊乱）的胚泡体比例。统计分析采用相对于对照条件的双因子方差分析。所有面板，n≥3。统计显著性表示为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

媒体	试剂	最终集中
FC
	DMEM	国家航空局。
	热灭活FBS（iFBS）	15%
	谷氨酸极限	2 mM
	2-巰基乙醇（2-ME）	0.1 毫米
	非必需氨基酸（NEAA）	1次
	纳丙酮酸	1次
	青霉素-链霉素	1次
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	神经基底A型	50%
	B27补充剂	1次
	N2补充剂	0.5倍
	2-ME	100 微米
	青霉素-链霉素	1%
	谷氨酸极限	2 mM
	PD0325901	1微米
	CHIR99021	3微米
	小鼠重组LIF	10 ng/mL
TSF4H
	巨型单元RPMI-1640介质	国家航空局。
	iFBS	20%
	谷氨酸极限	2 mM
	纳丙酮酸	1次
	青霉素-链霉素	1次
	FGF4	25 ng/mL
	肝素	1 μg/mL

表1：FC、N2B27/2i/LIF 和 TSF4H 的培养基配方。 制备FC培养基、N2B27/2i/LIF培养基和TSF4H培养基的配方，含最终浓度。

组成部分	最终集中	种群集中度	溶剂与储存	体积可至~20毫升
8Br-cAMP	25微米	5 毫米	PBS，储存温度为-20°C	100微升
CHIR99021	3微米	10 mM	DMSO，储存在-20°C	6微升
DMEM/F12	无	无	储存在4°C	20毫升
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	PBS中0.1%的BSA，储存在-20°C	5 μL
L-异丙酰-左-谷氨酰胺补充剂	2 mM	200毫米	储存在4°C	200微升
肝素	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS，储存温度为-20°C	20微升
全息转铁蛋白	10.7 μg/mL	10.7 mg/mL	去离子水，保存在-20°C	20微升
人类TGF-β1	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0.1% BSA，储存在-20°C	15微升
伊尔-11	30 ng/mL	25 μg/mL	PBS中0.1%的BSA，储存在-20°C	24微升
胰岛素	19.4 μg/mL	9.5 - 11.5 mg/mL	浓度取决于批次，储存在4°C	33.7–40.8微升，根据库存浓度调整体积。
L-抗坏血酸-2-磷酸，镁	64 μg/mL	32 mg/mL	去离子水，保存在-20°C	40微升
小鼠重组LIF	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0.1% BSA，储存温度为-20°C	20微升
NaHCO3	543 μg/mL	45.25 mg/mL	去离子水，保存在-20°C	240微升
青霉素/链霉素	1次	100倍	在-20°C下储存	200微升
苏德亚硒矿	14 ng/mL	14 μg/mL	去离子水，保存在-20°C	20微升
Y27632	20微米	20毫米	DMSO，储存在-20°C	20微升

表2：TX的培养基配方。 TX培养基的制备配方，包含如何制备和储存小分子及其他试剂的详细信息，以及最终浓度。

Discussion

iGATA4-胚泡通过自组织三种体外培养细胞类型——ESCs、诱导GATA4-ESCs（iGATA4-ESCs）和缺氧培养TSCs，提供了高效、类似胚胎、干细胞的鼠胚囊模型。这些结构重现了E4.5囊胚的关键特征，包括适当的谱系比例和转录身份，并可用于多参数环境筛查，可靠地反映囊胚发育缺陷³。一项最新研究进一步表明，基础胚胎培养基中ESCs、iGATA4-ESCs和TSCs的聚集也能实现高效质胚体形成，凸显该方法在实验室和培养条件下的稳健性和适应性³⁹。此前，iGATA4-ESC已被证明能在植入后基于干细胞的胚胎模型28,29,30,31中重现VE细胞的功能。这些结果共同展示了iGATA4-ESC如何作为PE/VE细胞在干细胞胚胎建模中跨发育阶段的灵活可靠替代。

该方案中的若干步骤对于实现高质量的胚胎至关重要。这些包括起始细胞群体的质量，特别是缺氧培养的TSCs（见图1）;TX培养基的制备，应在第0天新鲜制备（表2; 第2.3节）;以及在聚合后对盘子的谨慎处理。方案成功的关键指标包括空化效率（通常为~80%）、适当的形态特征（~直径100微米的结构，具有类似爆胚腔的腔体、CDX2⁺样的外层，以及经过分选的SOX2⁺和GATA4⁺内细胞质量，PER比约为3 TE：1 EPI：1），以及是否存在正确分选的GATA4⁺样PE层。这些指标在^{1、2、4、5}中常用。在空化爆裂体中，约75%的结构表现出所有这些特征。这些指标可以作为初步的故障排查指标。细胞质量不理想通常反映在菌落形态异常上，导致结构聚集不良或非空化。培养基制备不当可能导致聚集不完全或系谱缺陷，粗暴操作可能导致每个微孔或空井产生多个骨料。

进一步优化可能包括调整播种细胞数量（推荐起始范围：每微孔4–7个ESC和iGATA4-ESCs，以及10–15个TSC）、完善MEF耗尽方法（例如通过40微米电池过滤），以及修改TX培养基的组成。例如，去除FGF4和肝素仍可支持高效的胚胎形成，同时促进更接近壁垒TE的特征。iGATA4类胚体可在培养中维持长达6天;然而，第4至第6天的结构通常会增大，同时保留类胚泡比例。该方案在生物复制中结果一致，但每个实验中应包含适当的对照。

与其他小鼠囊胚系统相比，后者在起始细胞种群和培养条件上有所不同，分别为6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 iGATA4-质胚体既实现了高地层形成效率，也实现了谱系的准确表示。虽然许多现有方案产生空化结构，并对特定生物学应用具有价值，但它们常表现出PE形成不完整、细胞身份不均一或未定义，或谱系比例错误。通过逐步组合三种谱系导向干细胞群体，iGATA4型囊胚克服了这些局限，提供了可重复、模块化且实验上可访问的系统。

尽管有这些优势，但仍存在若干限制。在TX培养基中进行延长的 体外 培养超过4–6天会导致过度生长，即使谱系比例仍保持囊胚状。约12.5%的iGATA4类胚胎体 在体外转变为类着床期形态，其特征为杯状、伪分层的上胚层包围前羊膜腔，近端上胚层旁有扩展的胚外外胚层样腔室，以及外层内脏内胚层状层。然而，iGATA4类胚泡在转移到宿主小鼠后未能着床并继续发育。因此，iGATA4类胚胎及更广泛的类胚胎不适合研究着床或胚胎-母体相互作用。

胞胎未能着床的分子基础尚不明确，尽管现有证据表明营养层建模不完整可能是促成因素之一。iGATA4类胚胎中的TE样细胞表现出过于极性的分子身份。未来将有工程化出更接近壁垒TE细胞的TSCs，或引入更能复现着床适应TE的替代细胞系，这些都是克服这些局限性的有希望方向。iGATA4-类胚胎的模块化特性，使得TE特异性修饰可以独立于EPI和PE的形成实现，这使得该系统特别适合此类开发。

综合来看，iGATA4-胚胎实验方案为研究哺乳动物胚胎的谱系指定和早期发育过程提供了一个稳健且可扩展的平台。其可重复性和适应性使其非常适合高通量的环境、药理学和遗传筛查应用。因此，iGATA4类胚泡构成了一个强大的系统，用于研究早期发育机制并评估多种干扰如何影响着床前发育。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-巯基乙醇	Thermo Fisher Scientific	31350010	用于一般培养基配制
8-溴-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	用于TX培养基配制和胚体腔化
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	微孔聚集板；用于胚体制备
抗粘附冲洗液	STEMCELL Technologies	7010	用于胚体制备
ART宽口过滤移液器吸头	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	用于免疫染色过程中胚体移动的宽口移液器。
B27补充剂	Thermo Fisher Scientific	17504044	用于培养基配制
咖啡因	Sigma	58-08-2	用于在iGATA4-胚体中测试的环境因子
CDX2抗体，小鼠	Biogenex	MU392A5UC	用于免疫荧光，使用稀释比为1:200
CellXpert（常氧培养箱）	Eppendorf	6731010015	其他品牌/型号也可能适用。
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	用于培养基配制
Countess细胞计数室幻灯片	Invitrogen	C10228	用于一般组织培养目的
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	用于免疫荧光，使用稀释比为1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	用于FC培养基配制
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	用于N2B27和TX培养基配制
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	将Ham's F-12营养混合粉末补充到DMEM-LM中，最终浓度为1x，以获得无甲硫氨酸和白氨酸的DMEM/F12
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附次级抗体，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	用于免疫荧光，使用稀释比为1:500-1:1,000
山羊抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附次级抗体，Alexa Fluor® 647	Invitrogen	A-31571	用于免疫荧光，使用稀释比为1:500-1:1,000
山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附次级抗体，Alexa Fluor® 568	Invitrogen	A10042	用于免疫荧光，使用稀释比为1:500-1:1,000
山羊抗大鼠IgG（H+L）高度交叉吸附次级抗体，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	用于免疫荧光，使用稀释比为1:500-1:1,000
山羊血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	用于免疫荧光。在4°C下解冻，并在-20°C下分装存储。
多西环素	Sigma	D9891-5G	用于胚体制备过程中的iGATA4诱导
Eppendorf离心机5702	Eppendorf	5702	用于我们的实验室，其他也可以使用。需要管子和板适配器。
Falcon 96孔透明圆底无处理微板，带盖，单独包装	Corning	351177	用于免疫荧光
FGF4	R&D Systems	5846-F4	用于培养基配制
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	用于图像分析
GATA4抗体，兔	Cell Signalling	36966S	用于免疫荧光，使用稀释比为1:500
明胶溶液，2%	Sigma	G1393	用于一般组织培养目的
玻璃底35毫米菜盘	Ibidi	81218-200	用于免疫荧光和成像
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-丙氨酰-L-谷氨酰补充剂；用于培养基配制
Ham's F-12营养混合粉末	Thermo Fisher Scientific	21700075	用作DMEM-LM的补充，用于低蛋白饮食条件。
肝素	Sigma	H3149	用于培养基配制
Heracell VIOS 160i（缺氧培养箱）	Thermo Fisher Scientific	51030400	其他品牌/型号也可能适用。
全转铁蛋白	Sigma	T4132	用于TX培养基配制。
人重组TGF-β1	PeproTech	100-21	用于TX培养基配制。
IL-11	PeproTech	200-11	用于TX培养基配制。
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	用于图像分析和图像准备。
失活胎牛血清	Corning	35-010-CV	用于培养基配制
可诱导GATA4 ESCs（tetO-GATA4-ESCs）	Amadei et al., 2021	NA	细胞系可在Zernicka-Goetz实验室要求时获得
胰岛素	Sigma	I9278	用于TX培养基配制。
照射过的C57bl/6小鼠胚胎成纤维细胞	Thermo Fisher Scientific	A34960	用作TSC培养的喂养层。按照�