探讨下背痛、髋痛、膝盖疼痛和步态异常之间的双向关系：一项孟德尔随机化研究

摘要

IVW分析显示，下背痛和髋痛可能与步态异常有关，而膝盖疼痛和反向关联尚无定论。

摘要

步态异常与下肢生物力学改变及肌肉骨骼疾病中功能障碍相关。尽管观察性研究显示下背痛、髋痛和膝盖疼痛与步态受损有关，但它们的因果关系尚不明确。我们进行了双向孟德尔随机化（MR）研究，以评估特定部位疼痛与步态异常之间的潜在因果关系。来自大规模全基因组关联研究的独立单核苷酸多态性被用作下背痛、髋部疼痛和膝盖疼痛的遗传工具。步态异常（在来源GWAS中定义为自我报告的行走困难）被用作正向MR分析的结果，以及反向MR分析中的暴露。反方差加权（IVW）方法为主要分析，并辅以异质性、水平多效性和鲁棒性的敏感性分析。在前期分析中，遗传预测的下背痛（OR = 1.53,95% CI = 1.058–2.219，P = 0.024）和髋部疼痛（OR = 1.55,95% CI = 1.067–2.252，P = 0.021）与步态异常风险增加相关。 然而，这四种额外的MR方法在统计学上并不显著，尽管估计值总体上方向一致。遗传预测的膝盖疼痛无显著关联（OR = 2.15,95% CI = 0.234–19.789，P = 0.498 ），宽置信区间反映出显著不确定性。反向磁共振分析未发现遗传性对步态异常增加下背、髋部或膝盖疼痛风险的证据，尽管仅有四项步态异常SNP可用。未检测到显著异质性或水平多效性。总体而言，本研究提供的基于IVW的遗传证据有限，表明腰痛和髋痛可能与步态异常有关。研究结果应谨慎解读，并利用更大规模的GWAS数据集和精细表型进行验证。

引言

步态异常可能源于运动或感觉功能障碍，其临床特征取决于潜在病理的位置和性质。特定的异常步态模式可能为特定疾病提供重要的诊断线索。值得注意的是，在肌肉骨骼疾病中，步态异常常表现出独特的生物力学特征，且与疼痛、关节功能障碍及活动能力减退密切相关 ^1,2,3。研究表明，长期的步态异常会加重骨关节炎患者的^病情。此外，持续的异常步态可能加剧运动关节的不稳定性并改变关节负荷;在异常力学下重复性关节活动可能进一步加重关节损伤，从而引发疼痛，促进肌肉逐渐萎缩，并导致更明显的肌肉力量流失。这些因素可能相互作用形成恶性循环，导致肌肉骨骼疾病患者的疼痛和功能障碍逐渐恶化^5.因此，澄清特定部位肌肉骨骼疼痛与步态异常之间关联的方向及潜在因果关系，有助于解释观察性疼痛-步态关系，并为未来步态功能障碍和康复研究提供参考。

然而，尽管有大量观察性证据将特定部位疼痛（如腰痛、髋痛和膝盖疼痛）与步态表现受损联系起来，传统的观察性研究仍易受到混杂、测量误差和反向因果关系的影响，难以确定这些关联的方向和因果关系。此外，疼痛与步态的关系可能涉及中枢神经系统的适应和对外周接收的伤害感受信息的调节，这进一步复杂化了对观察到的疼痛与步态关联的解释。孟德尔随机化（MR）是一种流行病学方法，旨在克服观察性研究的关键局限性，已被广泛应用于因果推断研究中。MR使用独立单核苷酸多态性（SNP）作为工具变量，推断暴露与结局之间潜在的因果关系^6.例如，MR可以不直接分配个体是否发展下背痛，而是在大型全基因组关联研究（GWAS）数据集中，检验对下背痛的遗传易感性是否与步态相关结局相关。由于遗传变异在受孕时（即胚胎形成时）随机分配，MR可以减少年龄、体质指数、体力活动及共病肌肉骨骼疾病等混杂因素带来的偏见。当有强大的GWAS数据和有效的遗传工具时，这种方法适合探索群体层面的因果关系。然而，本研究使用的表型为广泛自报的GWAS特征，可能无法完全反映疼痛的严重程度、症状持续时间、临床医生确认的诊断或客观步态参数。通过利用受孕时遗传变异的随机分配，磁共振可以有效减少混杂因素带来的偏倚并逆转因果关系，从而产生更合理的因果证据。

本研究的目标是利用来自IEU开放GWAS数据库中步态异常的GWAS总结数据，进行双向MR分析。在该研究中，疼痛表型代表广泛的自我报告的部位特定疼痛特征，步态异常则代表自我报告的行走困难，而非临床医生确诊的诊断、实验室测量的步态参数或标准化功能评分。该双向设计旨在利用GWAS总结统计评估特定部位肌肉骨骼疼痛与步态异常之间潜在因果关系的方向^7.

方案

本研究使用了来自IEU OpenGAS数据库和GWAS目录的公开全基因组关联研究（GWAS）摘要级数据。未访问个体级别参与者数据，也未招募新的人类参与者。在最初贡献的GWAS研究中，已获得伦理批准和书面知情同意。因此，当前公开摘要统计的二级分析无需额外的机构审查委员会批准。

研究原理与设计

MR研究的基本步骤包括获取GWAS摘要数据、筛选和评估SNP、进行统计分析以及实施质量控制措施。如 图1所示，MR分析的准确性基于三个关键假设的满足：（1）相关性假设：静脉注射（IV）需与暴露表型相关，即腰痛、髋痛和^膝盖疼痛8;（2）独立性假设：IV与影响“暴露-结果”的混杂因素无关;（3）排他性假设：静脉注射仅通过暴露影响结果，而非通过其他途径影响⁹.每次分析中将交换暴露因素和结果变量，以确定两者之间是否存在反向因果关系。

为提高可重复性，提供了用于本地GWAS汇总统计量导入、SNP提取、LD聚集、结果SNP提取、等位基因协调、MR分析、敏感性分析、诊断绘图和输出保存的完整计算流程，作为补充代码1。正文描述了关键的协议步骤，而 补充文件1 则提供了对应的命令级和函数级R实现。

数据来源

与下背痛、髋痛和膝盖疼痛相关的数据来自IEU openGAS数据库，网站为：https://gwas.mrcieu.ac.uk/。用于定义这些条件的具体问题可在 补充文件2中找到。下背痛、髋部疼痛和膝盖疼痛均根据原始GWAS数据集中自我报告的部位特定疼痛项目定义。下背痛数据集的GWAS ID编号为：ebi-a-GCST90018797，样本量为468269，包括22,413名下背痛患者和445,856名对照组，SNP总数为24174741。髋关节疼痛数据集的GWAS ID编号为：ebi-a-GCST90013968，样本量为407746，总SNP计数为11039206。膝盖疼痛数据集的GWAS ID编号为ukb-b-16254，样本量为461857，包括98704名膝盖疼痛患者及363153对照组，SNP总数为9851867。步态异常的GWAS数据也来自IEU openGWAS数据库，步态异常数据集的GWAS ID编号为finn-b-R18 _ABNORMALITI_GAIT_MOBIL，样本量为210717，包括1348例步态异常病例及209369对照组，共识别出1638044个SNP位点。详细信息见 表1。

为了实现可重复的数据获取，研究人员应在IEU OpenGWAS数据库中搜索上述每个GWAS ID，下载相应的GWAS摘要统计文件（如有），并将文件保存为本地文本或逗号分隔文件后再导入R。在本研究中使用的计算流程中，本地 GWAS 汇总统计数据文件通过 read.table（） 或 read.csv（） 导入 R，具体取决于源文件格式。采用本地文件的工作流程，确保相同的下载 GWAS 摘要统计文件可以通过固定列映射和相同的分析命令反复处理。用于导入和处理本地文件的具体 R 命令见 补充文件 1。

SNP的筛选与参赛

从GWAS总结数据集中，采用全基因组显著性阈值 P <5 × 10⁻⁸提取了与每种暴露表型显著相关的SNP。如果该阈值上可用的独立SNP少于三个，阈值会放宽至 P <5 ×10⁻⁶ ，以获得足够的遗传仪器进行MR分析。在10,000 kb窗口内，利用r² <0.001评估连锁不平衡，以确保工具变量的独立性。

在脚本层面，首先将暴露GWAS汇总统计数据导入R，并根据预设的P值阈值进行过滤。选定的曝光SNP随后被保存为曝光文件，并根据TwoSampleMR包的要求进行格式化。所需的列映射包括SNP标识符、效应估计、标准误、效应等位基因、其他等位基因和P值。在可重复的R工作流程中，曝光数据通过read_exposure_data（）导入，LD聚团通过设置clump = TRUE来实现。对应的R命令结构为：read_exposure_data（文件名=“exposure.csv”，sep = “，”，snp_col = “rsids”，beta_col = “beta”，se_col = “sebeta”，effect_allele_col = “alt”，other_allele_col = “ref”，pval_col = “pval”，clump = TRUE）。列名根据实际下载的 GWAS 文件进行调整。

仪器强度通过F统计量评估：

F = [（N − k − 1）/k] × [R²/（1 − R²）]，

其中N表示样本量，k表示工具变量数量，^R2 表示SNP解释的暴露方差比例。R² 的计算方式为

Σ[2 × MAF × （1 − MAF） × β²/（SE² × N）]，

其中MAF是次要等位基因频率，β是等位基因效应估计，SE是标准误。

F统计量>10的SNP被保留。使用PhenoScanner V2检测并去除了与潜在混杂因素相关的SNP，包括先天解剖异常和身体质量指数。

通过将聚集暴露SNP与相应的局部结局GWAS总结统计文件合并，根据SNP标识符提取结果SNP。如果结果 GWAS 报告为 −log10（P），则使用 P = 10^（−LP）转换 P 值。提取出的SNP随后通过read_outcome_data（）导入。使用harmonise_data（）协调暴露和结局数据集，以对齐效应等位基因并剔除不适合MR分析的SNP。排除等位基因方向模糊的回文SNP，保留mr_keep=TRUE的SNP进行后续MR分析¹¹。关于结果SNP提取、P值转换和协调的详细脚本已在补充文件1中提供。

统计分析

本研究采用五种方法估算暴露变量与结局变量之间的因果效应：IVW法、MR-Egger回归法、加权中位数法、加权模式法和简单法¹²。IVW方法被认为是MR分析的标准方法，该方法假设所有工具变量均有效，基于Wald比率估计的组合原则，存在异质性时使用随机效应模型，若无异质性则使用固定效应模型。MR-Egger回归方法检测潜在的多重共线性，并考虑回归^中截距项的存在。加权中位数方法要求超过50%的工具变量是有效的SNP。加权模式方法需要比其他方法更小的样本量，并确保更小的偏差和更低的第一类错误率。简单模式方法允许根据估计的因果效应是否相似对SNP进行分^组。

在功能层面，MR分析使用TwoSampleMR软件包中的mr（）函数进行。分析中使用的方法列表被指定为 c（“mr_ivw”、“mr_egger_regression”、“mr_weighted_median”、“mr_simple_mode”、“mr_weighted_mode”）。使用generate_odds_ratios（）生成了比值比和95%置信区间。完整的R实现，包括精确的方法列表和保存输出命令，均见 补充文件1。

质量控制 与敏感性分析

为了检验MR结果的稳定性和可靠性，首先使用Cochran Q检验评估SNPs的异质性，如果Cochran Q检验具有统计学显著性，则表明分析结果存在显著异质性¹⁵。其次，使用MR-Egger截距检验评估潜在水平多效性。具有统计学显著性的MR-Egger截距表明MR分析中存在方向性水平多效性。第三，采用孟德尔随机化多效性残差和离群值（MR-PRESSO）方法搜索结果中的异常SNP，若存在，则剔除并重新分析¹⁶。第四，采用“排除一”方法检验结果的稳健性，并通过逐个排除SNP计算剩余SNP的综合效应，以评估单个SNP对暴露与结局变量关联的影响¹⁷。

在功能层面，异质性用mr_heterogeneity（）评估，方向多效性用mr_pleiotropy_test（）评估，单SNP效应用mr_singlesnp（）评估，去一分析用mr_leaveoneout（）。诊断图使用mr_scatter_plot（）、mr_funnel_plot（）和mr_leaveoneout_plot（）生成。当可用仪器变量数量充足时，进行MR-PRESSO;如果由于SNP数量不足无法进行MR-PRESSO，则会记录并报告。MR分析和质量控制程序使用R版本4.3.2和TwoSampleMR包版本0.5.8进行，显著水平为α=0.05。完整的指令载于 补充文件1。

输出保存、质量检查与报告

所有中间和最终输出均被保存以便复现。这些包括选定的暴露SNP、聚团暴露工具、提取的结果SNP、协调数据集、保留SNP列表、MR估计值、比值比、异质性结果、MR-Egger截断结果、MR-PRESSO结果、单SNP结果、省略一结果、诊断图和R会话信息。在报告前，保留的SNPs会被检查其全基因组显著性、LD独立性、等位基因协调状态、回文变异模糊性、仪器强度、异质性、方向性水平多效性及异常SNP。主要MR结果以比值比形式报告，置信区间为95%置信区间和P值。敏感性分析结果和诊断图已在补充表格和图表中报告。输出保存和文件检查命令在 补充文件1中提供了。

结果

本研究分析了三种部位特异性肌肉骨骼疼痛表型的GWAS数据，包括腰痛、髋痛和膝盖疼痛，以及一种步态异常表型。关于每种暴露因子的静脉注射（IV）详细信息可见 补充文件3。

步态异常对特定部位肌肉骨骼疼痛的MR分析

本研究排除了具有连锁不平衡和回文结构的SNP，并剔除了与混杂因素相关的SNP，最终纳入的SNP将作为MR分析的工具变量进行分析。所有SNP的F统计量均大于10（20.86–91.68），表明弱工具偏倚的可能性较低。在主要IVW分析中，遗传预测的下背痛和髋部疼痛与步态异常风险增加相关。具体来说，IVW估计对下背痛（OR = 1.53,95% CI = 1.058–2.219，P = 0.024） 和髋部疼痛（OR = 1.55,95% CI = 1.067–2.252，P = 0.021）均显著 。在主要IVW分析中，遗传预测的下背痛和髋部疼痛与步态...

讨论

步态异常可能改变下肢关节的负荷和运动策略，可能加速821+_osteoarthritic过程，并导致功能限制，显著影响生活质量。这一临床相关性引起了人们对步态功能障碍与肌肉骨骼疼痛相互作用的关注。观察性研究表明，特定部位的肌肉骨骼疼痛可能与步态受损有关;例如，一项针对65岁及以上社区老年人的横断面研究报告称，多部位疼痛与步速变慢相关（n = 176）¹⁸。然而，疼痛与步态关系的方向性和因果关系仍难以确定，因为随机对照试验（RCT）往往不可行，且观察性结果易受混淆和反向因果影响，这可能阻碍循证疼痛管理和康复。

多项近期研究利用MR探讨特定部位肌肉骨骼疼痛的风险或保护因素，如19,20,21。当随机对照试验不可行或不道德时，MR通过使用遗传变异作为工具变量，提供了一种有用的方法来加强因果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IEU OpenGWAS 数据库	布里斯托大学MRC综合流行病学单元	无	暴露和结局表型的GWAS总结统计来源。
MR-PRESSO R 套件	Marie Verbanck / R package	无	用于异常值检测和水平多效性评估。
表型扫描器 V2	剑桥大学	V2	用于识别与潜在混杂因素相关的单核细胞核（SNP）的网络资源。
R	R统计计算基金会	版本 4.3.2	用于MR分析和质量控制的统计计算环境。
TwoSampleMR R 封装	布里斯托大学MRC综合流行病学单元	版本 0.5.8	用于IVW、MR-Egger、加权中位数、加权模式和简单模式MR分析。