在HEK293细胞中利用分裂型发光标记技术测量活细胞 mRNA 翻译动态

摘要

本文介绍一种灵活且适用于高通量的检测方法，利用分裂型发光标记技术在HEK293细胞中测量活细胞内mRNA的翻译动态。该多功能检测方法可区分结构效应，支持体外转录优化，并加速mRNA治疗药物的开发。

摘要

快速开发出用于对抗 COVID-19 的疫苗，展示了信使 RNA（mRNA）疗法在变革药物研发方面的潜力。与成熟 mRNA 相似， 体外 转录出的mRNA具有相同的元件，包括5’端帽子结构、非翻译区（UTRs）、编码序列和多聚腺苷酸尾（poly(A) tail）。以往研究这些元件对mRNA翻译影响的工作主要依赖高度设计的报告蛋白，这类蛋白具有高效的翻译能力和蛋白质稳定性。由于各mRNA的结构元件对其翻译效率存在差异性影响，因此必须确定与目标治疗蛋白（POI）相关的最优设计。为实现对POI翻译的表征，本研究采用了分裂型荧光素酶互补系统。该系统中，一个短肽标签（HiBiT）可融合至POI的任一末端，其能与互补的异源二聚体（LgBiT）结合，并在细胞可渗透底物存在下恢复酶活性。迄今为止，分裂型发光标记技术主要用于高通量蛋白质周转率研究。我们先前已证明，分裂型发光标记可用于实现mRNA翻译过程的高通量、时间分辨定量分析 细胞内 在稳定表达互补异源二聚体的HEK293细胞中。在此，我们进一步展示了该检测方法的多功能性，并详细说明了如何利用该检测方法进行优化 体外 转录以降低成本。该检测系统能够独特地区分结构组分的改变，同时突出显示使用非工程化基因进行编码序列优化的效果。此外，我们证明了将5’帽浓度减少4倍后对 体外 转录结果导致等效翻译 细胞内这些发现表明，分裂型发光标记可轻松整合到mRNA治疗工作流程中，从而实现对mRNA驱动的蛋白质表达动态的实时监测 细胞内 从而为mRNA药物的研发提供了一种多功能的方法。

引言

信使RNA（mRNA）治疗及研究应用近年来迅速扩展，这得益于mRNA疫苗的成功^1,2以及RNA作为一种可编程生物分子的多功能性日益受到认可。该领域的一个核心挑战在于能够在多种背景下对mRNA翻译效率进行定量和动态评估。本文所述方法利用一种分裂型发光标记系统，为在活细胞中研究mRNA翻译提供了一个灵活且可扩展的平台in cellulo³。该方法的总体目标是使研究人员能够测量序列特征、化学修饰和结构元件如何影响翻译动力学以及后续的蛋白质降解，从而为优化用于治疗和基础科学研究的mRNA构建体提供有力工具。

体外转录的 mRNA 模拟了成熟转录本的核心结构，包含 5′ 帽结构、非翻译区（UTRs）、编码序列和 poly(A) 尾，通常还含有修饰核苷酸以降低免疫原性^4,5。大量研究表明，这些元件中的每一个——单独或组合使用——均可被工程化改造，从而显著影响翻译效率和蛋白产量^6,7。然而，大多数先前的研究依赖于高度优化的报告蛋白，例如绿色荧光蛋白（GFP）⁷、NanoLuc⁸ 或 SARS-CoV-2 刺突蛋白^8,9，这些蛋白被设计为高效翻译并产生极为稳定的产物，因此无法反映治疗性应用中所面临的实际挑战。由于治疗性 mRNA 编码多种多样的目的蛋白（POI），每种蛋白均受到独特的结构限制和细胞类型特异性调控，因此，适用于某一构建体的最优翻译设计原则可能并不适用于其他构建体，这一点已有文献报道³。因此，确定特定治疗性目的蛋白的最佳构型至关重要，且需要具备能够灵敏而系统地评估转录本各个特征如何影响蛋白表达水平的方法。

核糖体靶向方法（如多聚核糖体分析）通过梯度离心区分翻译组分¹⁰，而核糖体谱分析（Ribo-seq）则可在核苷酸水平上解析核糖体占据情况、起始位点及暂停现象¹¹。与Ribo-seq类似，其他基于测序的方法，如交联免疫沉淀分离RNA的高通量测序（HITS-CLIP）和翻译核糖体亲和纯化（TRAP），可进一步表征与RNA结合蛋白或核糖体相关的RNA的翻译过程¹²。尽管这些技术功能强大，但其需要复杂的制备流程、专用设备和计算分析专业知识，因此不适用于高通量治疗性mRNA的开发。新生肽链免疫沉淀技术¹³通过从核糖体中免疫沉淀FLAG标签蛋白，并利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）进行定量，从而测量翻译效率。虽然该方法可适用于治疗性mRNA，但其实验操作繁琐、时间分辨率低，且不适合高通量应用。SunTag系统¹⁴可通过单个mRNA分子实现活细胞中蛋白质合成输出及翻译调控的实时检测，其原理依赖于与GFP融合的单链可变区片段（scFv）与多串联重复的肽表位之间的相互作用。该系统能够以单mRNA分辨率动态监测翻译过程和定位，因此已被用于开发多种新生肽链追踪系统^15,16。然而，该方法通量较低，且需要使用高倍显微镜。

尽管新生蛋白的标记不可避免，但已发现可利用源自NanoLuc荧光素酶的一个小肽标签，用于在活细胞中报告mRNA的翻译情况。NanoLuc荧光素酶经过工程化改造，可分割为一个11个氨基酸的小亚基（HiBiT）和一个158个氨基酸的大亚基（LgBiT），二者能够快速二聚化，并在底物存在下重组为具有功能的荧光素酶^17,18该分裂型发光标记系统在mRNA动态研究中具有多项关键优势。首先，与目标蛋白融合的小型亚基体积极小，使得所编码的构建体尽可能接近天然目标蛋白。由于编码序列长度可直接影响翻译效率¹⁹，最小化标签长度可提高我们对合成mRNA翻译动态的预测能力。关键的是，这种最小化标记策略能够检测由同义编码序列变异所驱动的翻译差异，从而在不依赖蛋白质序列或稳定性的前提下独立研究翻译效率³因此，使用较大的标签（如荧光蛋白或全长荧光素酶）效果并不理想。其次，本研究采用的分裂型发光标记系统可实现信号的即时生成，具有快速且高效的特点 细胞内 互补反应据报道具有高亲和力（K_D = 700 pM）的灵敏度，且可用于检测蛋白质转换调节，最短每30秒即可获得一次读数¹⁸. 尽管最初的分裂型发光标记系统主要以其他分裂荧光素酶系统为基准进行比较^17,18在此背景下，关键优势在于信号生成不受蛋白质成熟过程的限制。相比之下，荧光蛋白需要发色团成熟，这一过程可能耗时数分钟至数小时²⁰ 从而限制了时间分辨率。最后，本研究采用的已建立的分裂发光标记系统克服了分裂荧光蛋白系统的局限性，后者通常需要在互补后形成发色团²¹，引入了额外的延迟，限制了其在捕捉快速动态过程中的适用性。先前的研究已证明分裂发光标记在蛋白质周转检测和降解研究中的应用价值^22,23,24将这一成熟技术拓展至翻译动力学研究代表了一项重要的方法学进展。例如，尽管核糖体谱型分析能够揭示核糖体在转录本上的分布密度，却难以有效捕捉在不同条件下翻译起始或延伸速率的动态变化。如先前所述³该分裂型发光标记系统能够检测改变帽结构、5′非翻译区（UTR）组成、密码子优化、核苷酸修饰以及poly(A)尾长度时的差异，而这些因素均为翻译效率的关键决定因素。其广泛的应用性使该方法在解析单个mRNA特征对整体蛋白表达贡献方面具有独特优势。值得注意的是，根据所用仪器的不同，该技术可同时获取单细胞和整孔数据。具备采集基于发光信号图像能力的成像平台可使该技术适用于单细胞翻译动态的研究。本文重点介绍基于酶标仪的孔板检测应用，因其具备中高通量特性且对数据分析的要求较低。

考虑采用该方法的研究人员应根据其特定的实验目标评估该方法的适用性。该检测方法在需要对合成mRNA构建体进行高通量筛选的情境下尤为有价值，例如基于mRNA的治疗设计流程中。该方法适用于对合成mRNA序列特征（包括非翻译区、密码子使用情况或核苷酸修饰）进行比较分析，能够检测到翻译效率上的细微差异³。由于该系统可兼容无细胞翻译平台、活细胞检测以及特定时间点的裂解检测，因此为希望将实验设计针对机制研究或应用研究进行优化的研究者提供了灵活性。同时，也必须认识到该技术的局限性。关键在于，分裂型发光标记检测无法提供核糖体占据情况的分辨率，这一能力仍为核糖体足迹分析方法所独有；此外，它也不能直接测量RNA的稳定性或降解情况，这些参数可能需要通过互补的方法进行评估。然而，由于现有以核糖体为中心的技术存在局限性，研究人员仍需依赖基于标签的检测方法（如分裂发光系统），通过蛋白质表达的动态变化来间接研究mRNA驱动的翻译动态。因此，尽管该系统是监测合成mRNA驱动蛋白表达的有力工具，但其适用性取决于研究问题是否聚焦于动态的蛋白质产出，而非精细的核糖体定位或RNA降解过程。

综上所述，分裂型发光标记系统是一种强大且多功能的方法，可用于研究mRNA的翻译过程。该方法的总体目标是为研究人员提供一个灵活、可系统扩展、高通量的平台，能够检测由具有不同结构和序列元件的合成mRNA所导致的蛋白质表达水平差异³。该技术的开发 rationale 在于克服现有方法的局限性，在灵敏度、可扩展性和时间分辨率方面具有优势。在RNA生物学与RNA治疗领域的广泛文献背景下，该方法为实验手段提供了有价值的补充，既有助于获得基础性科学认知，也推动了转化医学的发展。通过仔细评估该检测方法的优势与局限性，研究人员可判断其在特定应用场景中的适用性，从而在快速发展的RNA科学领域中最大化其应用价值。

方案

整个实验方案的图示见图1。

1. 模板制备 体外 体外转录（IVT）

注意：为制备体外转录（IVT）所需的DNA模板，应确保质粒DNA包含RNA聚合酶启动子（通常为T7或SP6）、5’和3’非翻译区（UTR）以及目的蛋白（POI）的开放阅读框（图1）。

1. 使用位于3’非翻译区（3’ UTR）之后的单一酶切位点的限制性内切酶线性化质粒DNA，并按照制造商说明书配制反应体系。孵育后，采用基于离心柱的DNA纯化试剂盒对酶切反应产物进行纯化。使用分光光度计对DNA进行定量。
2. 为验证线性化效果，配制含0.1 µg/mL溴化乙锭DNA染料的1%琼脂糖TAE凝胶。将150 ng酶切后的DNA与水及上样染料混合。将样品、未酶切质粒及DNA分子量标记物上样至琼脂糖凝胶中，在1× Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中以100 V电压电泳40分钟。使用凝胶成像系统观察结果。
   注意：溴化乙锭溶液为强效诱变剂，操作时需佩戴适当个人防护装备（PPE），谨慎处理。
3. 若质粒DNA在3’ UTR之后无poly(A)尾，可通过PCR引入。使用高保真DNA聚合酶及合理设计的引物，按照制造商说明书完成PCR反应。确保扩增产物包含T7启动子、开放阅读框及poly(A)尾。
   备注：加帽技术对T7启动子区域的序列可能有特定要求，可通过合理设计正向引物满足该要求。反向引物应结合于3’ UTR末端并引入poly(A)尾（建议长度至少为80个T）。对于高GC含量的构建体，建议采用递增式PCR和/或添加3% DMSO。
4. 为验证PCR成功，配制含溴化乙锭的琼脂糖TAE凝胶（参见步骤1.2）。若构建体长度≥1 kb或<1 kb，分别配制1%或2%的凝胶。取5 µL PCR产物与水及上样染料混合。将样品和DNA分子量标记物上样至琼脂糖凝胶，在TAE缓冲液中以100 V电压电泳40分钟。使用凝胶成像系统观察结果。
5. PCR产物经大小验证后，使用基于离心柱的DNA纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化。用15–20 µL洗脱缓冲液（通常随DNA纯化试剂盒提供）或无核酸酶水洗脱，以浓缩用于体外转录（IVT）的DNA模板。使用分光光度计对DNA进行定量。

2. 体外 转录

1. 开始前，使用RNase去污染溶液喷洒并擦拭工作台面、手套和移液器。为提高产量和质量，应在无菌操作台环境中进行此操作。
2. 根据制造商说明书，解冻并组装基于T7的体外转录（IVT）试剂盒的组分。
   注意：某些制造商建议使用二硫苏糖醇（DTT，0.1 M）以限制反应氧化并提高效率。当与试剂盒兼容时，建议执行此步骤。若使用修饰的dNTP，应以等量的修饰核苷酸替换相应的未修饰核苷酸。可评估半量反应的产量，因全量反应未观察到产量的显著提升。当合成多种mRNA时，建议配制主混合液，以减少移液误差和实验变异。
3. 用移液器充分混匀后短暂混合，在37 °C孵育5小时，使用加热盖以防止冷凝。如有需要，可将孵育时间延长至过夜，这对mRNA产量或完整性影响极小。
4. 加入1 µL DNase I，用移液器充分混匀。37 °C孵育30分钟。
5. 纯化 体外 体外转录（IVT）RNA
   1. 使用基于离心柱的RNA纯化试剂盒，按照制造商说明书对体外转录（IVT）反应产物进行纯化（不同试剂盒可能导致回收效率和结合容量存在差异）。洗脱时，加入60 µL无核酸酶水，室温孵育5分钟，随后离心。
   2. 或者，采用氯化锂沉淀法，这是一种成本更低且更灵活的方法。
      1. 加入等体积的7.5 M氯化锂至反应体系中，混匀后于-20 °C孵育过夜。
      2. 在 4 °C 条件下以 18,300 × g 离心 20 分钟，然后小心移除上清液，避免扰动 RNA 沉淀。
      3. 用950 µL 70%乙醇洗涤，在4 °C下以18,300 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在室温下晾干约5分钟，然后重悬于无核酸酶水中（通常使用60 µL；可根据沉淀大小适当减少体积以提高浓度）。
         警告：若未正确使用个人防护装备，氯化锂可能导致皮肤或眼部刺激。操作时应佩戴手套和眼部防护用具。乙醇为高度易燃液体，可引起眼部刺激。应远离明火，并穿戴适当的个人防护装备，包括眼部防护用具。
6. 使用分光光度计定量 mRNA。确保 mRNA 的 A260/A280 比值约为 2.0，并确认 A260/A230 比值在 1.8 至 2.2 之间。
7. 为确认体外转录（IVT）成功，制备含溴化乙锭的1%琼脂糖TAE（非变性）凝胶。将500 ng mRNA与水及上样染料混合，按照试剂盒说明书进行RNA ladder的配制及变性处理。将样品加入琼脂糖凝胶，在TAE缓冲液中以80 V电压电泳40分钟，随后使用凝胶成像系统进行观察。
8. 为进一步确认mRNA大小的准确性，将样品在Bioanalyser上进行检测。
9. 为避免反复冻融，将mRNA分装成实验所需体积的 aliquot。例如，在96孔板中每孔使用1.2 pmol mRNA。因此，按1.2 pmol × n个重复计算所需体积并分装，随后于-80 °C保存。

3. HEK293 逆转录转染

注意：为实现时间分辨测量，需要使用稳定表达互补荧光素酶片段的细胞系。可通过转染表达所需荧光素酶片段的质粒并进行克隆筛选，从而建立稳定细胞系。此方法允许研究者在任意选定的细胞背景下动态监测mRNA翻译过程的时间变化。此外，也可直接购买表达所需互补荧光素酶片段的细胞系。本实验采用的是稳定表达互补异源二聚体的HEK293细胞。

1. 开始前，将 mRNA 置于冰上解冻，以避免降解。
2. 制备转染复合物。对于 96 孔板，每孔需要 1.2 pmol mRNA。若设置重复，建议制备 2.5 份重复量，以补偿移液误差。因此，将 3 pmol mRNA 与 Opti-MEM 低血清培养基混合，终体积为 50 µL（20 µL/孔）。
3. 加入 0.5 µL 阳离子脂质转染试剂（0.2 µL/孔），通过反复吹打混匀，室温孵育。孵育 5 分钟后，再次吹打混匀，然后每孔加入 20 µL 至 96 孔白色平底微孔板中。建议将转染孔置于板中央，边缘孔留空。
4. 通过移除培养基并用 2 mL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，制备 HEK293 细胞。去除洗涤液后加入 500 µL 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 孵育 3 分钟。
5. 在细胞解离过程中，向 96 孔板的边缘孔加入 PBS，以减少细胞培养期间的培养基蒸发。若所有孔均需使用，可在孔间区域加满 PBS。
6. 加入 4.5 mL 添加了 1× L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以收集细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
7. 将所需数量的细胞（足够每孔接种 1 × 10⁵ 个细胞）加上额外 3 孔的量（用于补偿移液误差）转移至新离心管中，500 × g 离心 2 分钟。
8. 弃去上清液，用含 10% FBS 和 Endurazine 活细胞底物（1:200）的 Leibovitz L-15 培养基（无酚红）重悬细胞，确保终浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL。使用移液管充分混匀，确保 Endurazine 均匀分布。每孔加入 100 µL 重悬细胞（含 1 × 10⁵ 个细胞）。
   注意：若进行持续 72 小时的时间进程实验，应将体积增加至 200 µL，以避免蒸发。
9. 转染后立即将细胞放入设定为 37 °C 的酶标仪（化学发光检测仪）中。以 1 秒积分时间定期采集数据。由于系统具有高效的互补能力，信号可在数分钟内检测到。因此，为获得准确的基线读数，此步骤必须迅速执行。采集间隔取决于具体实验和仪器；然而，在本实验中发现，18 小时时间进程实验每 12 分钟测量一次，72 小时实验每 48 分钟测量一次效果最佳。化学发光检测无需滤光片；但使用 530–540 nm 滤光片可获得更高的信噪比。
   注意：分裂荧光素酶标记的 eGFP 会产生生物发光共振能量转移（BRET）信号，因此 530–540 nm 滤光片会同时捕获化学发光和荧光信号。为避免捕获 BRET 信号，可使用 460–480 nm 滤光片，或选用非荧光蛋白（如 MYL3）作为对照。

4. 数据分析

1. 通过将每种条件的信号归一化至其第一个时间点（t0，归一化为技术重复的平均值）来计算相对发光单位（RLUs）的倍数变化，因为实验开始时的信号代表背景水平。
2. 通过归一化至对照条件，降低生物学重复之间的变异性。
3. 根据所提出的问题选择实验的统计分析方法，可选择单个时间点或曲线下面积（AUC）。
   1. 对于单个时间点，使用目标蛋白（POI）表达达到峰值的时间点（依赖于目标蛋白）以及实验终点时间。绘制第4.1步计算出的特定时间点（例如240分钟）的RLU值，并采用适当的统计检验方法进行分析。
   2. 通过计算特定时间段（例如t0至240分钟）或整个实验时长（例如t0至终点）的曲线下面积（AUC），以评估蛋白质翻译与降解的动力学。将每个生物学重复的AUC值归一化至参考mRNA的平均值，从而获得AUC倍数变化的度量值，并可使用适当的统计检验方法进行分析。

结果

有多种方法可以优化本方案的成本效益。例如，体外转录（IVT）反应体系被缩小至厂家推荐体积的一半，结果发现其产量仍能满足细胞内实验所需的用量。in cellulo 实验表明，序列长度和复杂性会影响 IVT 产量，因此成功的方案优化应至少每轮 IVT 反应产生 50 µg 的 mRNA。与 IVT 反应试剂盒类似，加帽试剂的成本通常也较高。考虑到每个 mRNA 分子仅需一个帽子结构，我们推测 IVT 反应体系中帽子分子的数量远超过最终生成的 mRNA 分子数。因此，我们进一步探究了通过滴定加入 IVT 反应的加帽试剂用量是否可进一步优化该方案，结果如图2所示。在 10 µL IVT 反应体系中分别加入 100%（终浓度 10 mM 帽子）、50%、25% 或 0%（无帽）的加帽试剂，所得 eGFP mRNA 被转染至稳定表达互补异源二聚体的 HEK293 细胞中。作为归一化对照，同时转染了 MYL3（100% 加帽），该内源基因编码一种富集于肌肉的结构蛋白，其翻译动力学与 eGFP 相似，但信号强度更接近其他内源基因³。与先前数据一致³，未加帽的 eGFP mRNA 几乎无法翻译，与阴性对照组（mock control）相当（图2A）。使用推荐量 25% 或 50% 加帽试剂合成的 eGFP mRNA，其表达水平与 100% 加帽组相当（图2A），在 18 小时的时间过程中，曲线下面积（AUC）值无显著差异（图2B）。这些结果表明，在本实验条件下，加帽试剂存在过量，降低其浓度并不会影响翻译产出，说明帽子结构的掺入已足够充分。图2 中的结果仅适用于所使用的特定品牌加帽试剂，若更换不同试剂，应重新进行优化。

尽管帽结构技术的进步和修饰核苷酸的引入已提高了mRNA的表达水平，但mRNA设计算法的开发进一步改善了表达效果。这些算法分别通过优化最小自由能（MFE）和密码子适应指数（CAI）来增强mRNA的稳定性和密码子使用效率。为测试优化对mRNA表达的影响，采用了LinearDesign⁹算法。该算法依赖于输入一个λ值，该值是优化公式中用于确定算法对MFE或CAI偏好程度的缩放参数。相同的优化设置（即相同的λ值）被应用于四种转录因子——HAND2、GATA4、MEF2C和TBX5。图3探讨了优化对翻译速率的影响。优化后，所有转录因子的MFE和CAI值均得到改善，其中MEF2C在两个参数上的变化最为显著（图3A）。在每种构建体的C末端融合了一个分裂发光标签，其前方包含一个GS连接肽，并合成了四种转录因子的未优化和优化形式的mRNA。为确保每种mRNA均可被翻译并产生预期分子量的蛋白质，采用了兔网织红细胞裂解液无细胞翻译系统³。通过使用分裂荧光素酶蛋白的酶亚基及相应底物进行Western blot检测分裂发光标签，结果显示优化后的蛋白质仍能产生与预期分子量相符的条带（图3B）。将未优化或优化形式的各转录因子转染至HEK293细胞，并持续进行18小时的活细胞记录。所有18小时实验均包含三个生物学重复，每个重复实验中每样本使用三个技术重复。HAND2（图3C）和GATA4（图3D）的优化对表达无显著影响（通过非配对双样本t检验确定），相较于未优化版本，其表达量分别增加了1.07倍和减少了1.25倍。相比之下，MEF2C（图3E）和TBX5（图3F）的优化导致表达量显著上升，其曲线下面积（AUC）分别比未优化版本提高了2.25倍（P = 0.0486，n = 3，非配对双样本t检验）和1.72倍（P = 0.0379，n = 3，非配对双样本t检验）。与此一致的是，不仅终点表达量存在差异，表达曲线的形态和速率也有所不同，表明该检测方法能够分辨随时间变化的翻译动态改变。为确定表达量的提升是否能在更长时间内维持，将MEF2C mRNA转染至HEK293细胞，并持续记录72小时（图3G）。与18小时实验相同，该实验也包含三个生物学重复，每个重复中每样本使用三个技术重复。与18小时结果类似，优化后的MEF2C显著提高了表达水平，其AUC相较于未优化版本提升了2.5倍（P = 0.0061，n = 3，非配对双样本t检验）。尽管优化带来了显著的表达提升，但这些结果表明在此情况下，优化并不能阻止72小时内表达的衰减，两种MEF2C形式自24小时起均表现出相似的下降斜率。这种衰减可能归因于线性mRNA的降解和/或细胞分裂。综上所述，这些结果展示了mRNA设计算法在提升mRNA表达方面的潜力；但同时也强调，优化效果具有目标蛋白依赖性，需根据具体目标蛋白进行优化。

图1：在HEK293细胞中进行mRNA合成及分裂型发光标签检测的工作流程。 为开展用于分裂型发光标签检测的体外转录（IVT），需确保质粒包含RNA聚合酶启动子（T7或SP6）、5’和3’非翻译区（UTR），以及目的蛋白与短链荧光素酶亚基HB（HiBiT）融合的编码序列。该质粒使用单一酶切位点的限制性内切酶进行线性化，作为Poly T PCR的模板，PCR产物随后用作IVT的模板。合成的mRNA与脂质体复合后，反向转染至稳定表达大荧光素酶亚基（LB）的HEK293细胞中，并可立即放入酶标仪进行活细胞信号实时检测。实验完成后，对数据进行归一化处理及后续统计学分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：帽化试剂浓度降低四倍后，eGFP的表达水平与全浓度相当。（A）在转染了含不同浓度帽化试剂、MYL3或阴性对照（Mock）的eGFP mRNA的HEK293细胞中进行的活细胞动力学检测；数据已归一化至t₀时间点，每个时间点的圆点代表至少三个生物学重复的均值。（B）通过将至少三个生物学重复的18小时时间过程曲线的曲线下面积（AUC）相对于参考样本MYL3进行归一化，计算其倍数变化，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行比较。数据以均值±均值标准误（SEM）表示，每个圆点代表一个生物学重复的均值。***P < 0.001。（eGFP – 增强型绿色荧光蛋白；AUC – 曲线下面积；RLU – 相对发光单位） 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：序列优化以POI依赖性方式增强mRNA翻译效率。（A）LinearDesign对mRNA序列的优化导致每个转录因子的最小自由能（MFE）降低，密码子适应指数（CAI）值升高。（B）使用编码未优化或已优化的HAND2、GATA4、MEF2C、TBX5的mRNA或无RNA，在兔网织红细胞裂解液（RRL）体系中进行120分钟的体外翻译反应。所得蛋白经Western印迹检测，通过将膜与分裂荧光素酶系统中的酶亚基及相应底物孵育后，采用化学发光法显影。在转染了未优化或已优化的HAND2（C）、GATA4（D）、MEF2C（E）、TBX5（F）以及MYL3和Mock的HEK293细胞中进行活细胞动力学检测。数据归一化至t₀，每个时间点的圆点代表三个生物学重复的均值。通过将18小时时间过程的三条生物学重复曲线的曲线下面积（AUC）归一化至参考样本MYL3，并采用Welch校正的非配对t检验进行比较，计算AUC的倍数变化。数据以均值±标准误（SEM）表示，每个圆点代表一个生物学重复的均值。*P < 0.05。（G）在转染了未优化或已优化的MEF2C、MYL3及Mock的HEK293细胞中进行活细胞动力学检测，数据归一化至t₀，每个时间点的圆点代表三个生物学重复的均值。通过将72小时时间过程的三条生物学重复曲线的AUC归一化至参考样本MYL3，并采用Welch校正的非配对t检验进行比较，计算AUC的倍数变化。数据以均值±SEM 表示，每个圆点代表一个生物学重复的均值。**P < 0.01。（MFE – 最小自由能；CAI – 密码子适应指数；RRL – 兔网织红细胞裂解液；AUC – 曲线下面积；RLU – 相对发光单位） 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

近年来，mRNA 治疗领域发展迅速，凸显了序列设计与优化在研发流程中的关键作用。研究者已投入大量努力，致力于开发用于预测最有效 RNA 结构与组成的计算工具，其中序列优化尤为受到关注^8,9尽管这些工具功能强大，但这些设计的实验验证仍是整个流程中不可或缺的一部分。然而，这种验证在很大程度上依赖于报告蛋白，包括GFP⁷，NanoLuc⁸，以及 SARS-CoV-2 刺突蛋白⁹ 这些蛋白质本身已具有极高的稳定性且翻译效率极高。为克服这一局限性，研究中将分裂荧光素酶系统整合到一个流程中，以研究翻译动态过程 体外 HEK293细胞中转录的mRNA，实现时间分辨率³，并展示了在mRNA工程中利用报告蛋白检测翻译变化的局限性。本文详细描述了执行该检测所需的操作步骤，证明了体外转录（IVT）反应可实现微型化，且在不影响翻译效率的前提下降低5’帽结构的浓度，从而减少成本。基于我们先前的观察结果，我们强调必须采用依赖目标蛋白（POI）的mRNA序列优化策略，才能实现表达量的提升。

如本文所述，分裂型发光标签检测是一种相对简便的流程，可实现中等通量的mRNA翻译水平测量，使用户能够实时研究其目的基因（POI）的时间表达模式。然而，要获得可靠的结果，需注意多个关键步骤和要点。首先，所有下游结果均依赖于mRNA的质量，而mRNA质量始于体外转录（IVT）过程以及所用设备的去污染处理。合成后，mRNA的储存至关重要：洗脱后应始终置于冰上；在确认mRNA大小后，应将其分装为工作体积，以避免反复冻融，并于-80°C长期保存。其次，所用96孔板极为重要，且实验间必须保持一致。本方案中，务必使用全白色96孔板。若需监测细胞形态，可选用透明底、白色壁的孔板；但此类孔板信号显著较低，因此两种类型的孔板不可互换使用。实验观察发现，在透明底、白色壁孔板中检测相同mRNA的翻译时，所得发光信号比全白色壁孔板低5倍。在评估翻译动力学效率较低的基因时，这一技术差异可能产生显著影响。除导致数据不一致外，信号降低还可能掩盖由mRNA序列或结构扰动引起的细微差异。第三，本检测中使用L-15培养基至关重要，因其可在无需CO₂补充的环境中维持细胞活力²⁵，从而提高所用发光仪的使用灵活性。此外，使用无酚红的L-15培养基可在检测发光信号时降低背景信号。最后，细胞培养及发光信号检测均应在37°C（或根据目标细胞类型的适宜培养条件）下进行。若在室温下操作，将显著改变实验结果，因为此时翻译延伸速率降低²⁶，无法观察到正常的动力学特征。

多功能性 体外 转录的mRNA设计可直接应用于合成过程，从而实现多种修饰。实验结果表明，5’帽结构的浓度可降低至原来的四分之一，仍能获得相当的表达水平，有助于研究人员降低成本。尽管在体外转录（IVT）后未直接测定加帽效率，但若IVT产物中未加帽mRNA的比例增加，则信号强度应会下降，正如未加帽mRNA所表现出的情况；而本实验中未观察到此类信号下降。此外，考虑到eGFP是一种相对较小的蛋白质（仅27 kDa），这种对帽结构浓度的调控应更易于适用于更大的基因，因为在IVT后需要加帽的转录本数量将更少。目前已有多种具有不同甲基化修饰的帽类似物，这些修饰会影响mRNA的免疫原性。³ 和蛋白质表达²⁷此外，加帽过程可以共转录进行（如此处所示），也可以使用痘苗病毒在转录后进行，后者可实现100%的加帽效率。²⁸ 但需要额外的纯化步骤。对于实验室规模的mRNA制备，通常使用纯化柱，因其快速高效，但成本较高。一种更经济且适用性更广的方法是氯化锂沉淀法，该方法虽然耗时较长，但可实现mRNA的浓缩，且产量不受纯化柱结合容量的限制，因此适用于放大生产。与纯化柱类似，该方法无法完全去除双链RNA和截短的RNA片段，而这些杂质会引发免疫反应。²⁹与5’帽子结构类似，poly(A)尾的引入也可通过其他方法实现，而不局限于此处所述方式。类似于通过PCR引入poly(A)尾，质粒DNA可被设计为包含poly(A)尾；然而，这些长序列容易发生重组，导致poly(A)序列出现异质性和缩短。但通过poly(A)分段技术——即插入异源核苷酸间隔序列——已显著减轻了这些影响^30,31或者，可以使用无需模板的poly(A)聚合酶来生成poly(A)尾，该方法能够产生更长的poly(A)尾³² 但存在异质性影响监管要求的风险³³.

尽管上述描述的分裂发光标签检测法在测量外源递送mRNA的蛋白表达方面极为有效，但根据具体的研究问题，仍需考虑一些局限性。首先，需要构建一种稳定表达分裂荧光素酶一半片段的细胞系。虽然可直接购买现成的此类细胞系，但目前仅限于HEK293细胞。如果在目标细胞类型中构建稳定细胞系存在困难，则可采用一种裂解法检测，我们发现该方法在HEK293细胞、人胚胎干细胞以及分化的心肌细胞中均能呈现相同的结果³。然而，该先前发表研究³中裂解法检测所选的时间点是依据活细胞HEK293的数据确定的。其次，该检测法可提供活细胞的时间分辨率，但无法提供活细胞的空间分辨率，而后一点可能对部分研究人员具有重要意义。不过，目前已有一种可高效用于荧光免疫细胞化学的特异性一抗，可用于检测本实验中所用的短荧光素酶肽标签，从而实现对目标蛋白（POI）翻译产物的空间定位分析。此外，若配备能够进行发光成像的显微镜，则可获得单细胞分辨率的数据。另一种可提供时空信息的方法是SunTag系统，该方法通过GFP标记的scFv与肽表位之间的相互作用，利用活细胞成像来检测活跃的翻译过程及其定位^14,34。然而，该方法需要24个串联重复的表位序列，可能因此干扰正常的翻译过程，且其实验流程通量相对较低。第三，分裂发光标签法可用于检测mRNA丰度，但无法在活细胞中实现。在我们之前的研究³中，采用针对外源递送转录本的特异性引物对提取的RNA进行qRT-PCR，以确认不同构建体间的转染效率以及不同时间点之间的mRNA降解情况。另一种方法则采用Northern blot检测mRNA稳定性³⁵。然而，这两种方法均较为耗时，且无法实现连续测量。目前尚无任何方法能够在活细胞中同时检测mRNA的翻译活性与丰度，这为该领域检测技术的进一步发展提供了潜在方向。

分裂荧光素酶系统最初被用于研究蛋白质动态，但显而易见的是，该检测方法在其他研究领域也具有重要意义。随着mRNA治疗技术成为新型基因治疗策略的前沿方向，该检测方法非常适用于帮助研究人员表征其潜在治疗性分子的表达情况，并优化其表达水平。如前所述，随着多种工具的开发，密码子优化已成为mRNA设计中一项强大的新技术^8,9,36。当对四种转录因子采用统一的序列优化策略时，所有基因的MFE和CAI均得到改善，但仅有MEF2C和TBX5表现出表达量的提升。值得注意的是，该方法能够检测仅由同义编码序列变异引起的表达差异，从而为在活细胞中以高时间分辨率研究翻译效率提供了一个独特的平台。这些发现表明，为了实现更高的表达水平，序列优化必须以目标蛋白（POI）依赖的方式综合考虑起始GC含量、密码子使用偏好以及RNA二级结构。尽管可能需要测试更多构建体，分裂发光标签检测法具备高通量分析的潜力，可用于鉴定针对特定POI的最佳候选序列。此外，如先前研究所示³，该检测方法还可用于测量干扰mRNA任意序列或结构元件所产生的影响，进一步拓展其应用范围。除了用于mRNA序列的改造研究外，分裂发光标签检测法还可应用于递送系统与制剂研发。即使在5’帽结构改进和修饰核苷酸使用的情况下，外源递送的mRNA仍需依赖包装系统以防止降解并促进细胞摄取³⁷。尽管脂质纳米颗粒³⁸、细胞外囊泡³⁹和仿生材料⁴⁰目前处于mRNA递送技术的前沿，但仍需进一步优化。将分裂发光标签标记的mRNA包封于上述任一载体中，可实现对递送效率的表征，并使研究人员能够以中高通量方式测试改良后的递送载体。除翻译相关研究外，分裂发光标签检测法也可直接应用于基础生物学研究。无论是评估序列和结构元件扰动对mRNA翻译的影响，干扰翻译机制的功能，还是探究蛋白酶体活性，分裂发光标签系统均提供了一种极具吸引力的选择。

总体而言，本文所述的分裂型发光标签系统提供了一种灵活且稳健的检测方法，可通过监测合成mRNA驱动的蛋白质表达随时间的变化，来反映翻译动态。活细胞检测方法的实施克服了以往mRNA翻译研究领域的诸多局限性，揭示了蛋白质合成及目标蛋白（POI）降解动态的关键信息。由于不同转录本具有不同的调控机制和表达特征，对治疗性目标蛋白（POI）进行表征至关重要，这将推动mRNA治疗药物的持续优化并顺利向临床转化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283	TAE 缓冲液组分
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539	用于凝胶电泳
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	用于 mRNA 质量控制的生物分析仪
CLARIOstar Plus 发光检测仪	BMG Labtech	430-501S-F	用于检测发光信号的酶标仪/发光检测仪
CleanCap AG	Trilink Biotechnologies	N-7113	用于体外转录（IVT）的 5' 帽结构
DMEM 高糖含丙酮酸钠培养基	Thermo Fisher Scientific	41966029	用于培养 HEK293-LgBiT 细胞的培养基
DNase I	New England Biolabs	M0303	体外转录（IVT）反应后降解 DNA 模板
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537	用于细胞洗涤及添加至孔板中防止蒸发
EDTA，pH 8.0，无 RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9260	TAE 缓冲液组分
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E1510	凝胶电泳染色剂
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F7524	添加至 DMEM 中的补充物
HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒	New England Biolabs	E2040	体外转录（IVT）试剂盒
Leibovitz L-15 培养基，无酚红	Thermo Fisher Scientific	21083027	在发光检测期间用于 HEK293-LgBiT 细胞培养的培养基
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030-024	添加至 DMEM 中的补充物
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150	基于脂质的转染试剂
氯化锂沉淀溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9480	体外转录（IVT）后 mRNA 纯化的替代方法
Monarch Spin PCR & DNA 纯化试剂盒	New England Biolabs	T1130	质粒线性化后的纯化试剂盒
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	用于定量 DNA 和 mRNA 浓度的分光光度计
Nano-Glo Endurazine 活细胞底物	Promega	N2570	添加至 L-15 培养基中用于发光检测的底物
NucleoSpin RNA 纯化试剂盒	Macherey-Nagel	12708612	体外转录（IVT）反应后纯化 mRNA
Nunc MicroWell 96 孔 Nunclon Delta 处理平底微孔板	Thermo Fisher Scientific	136101	用于 HEK293-LgBiT 细胞铺板及后续检测的孔板
Opti-MEM 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985062	用于转染反应的培养基
Phusion 高保真 PCR 试剂盒	New England Biolabs	E0553	PCR 试剂盒
RiboRuler 高分子量 RNA Marker	Thermo Fisher Scientific	11883993	用于凝胶电泳的 RNA 分子量标准
RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	R2020	RNase 去污染喷雾剂
TRIZMA Base	Sigma-Aldrich	T6066	TAE 缓冲液组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4174	细胞解离试剂
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	10977035	用于模板制备和体外转录（IVT）