需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

在HEK293细胞中利用分裂型发光标记技术测量活细胞 mRNA 翻译动态

67 次观看

⸱

DOI：

10.3791/70840

⸱

2026年8月14日

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种灵活且适用于高通量的检测方法，利用分裂型发光标记技术在HEK293细胞中测量活细胞内mRNA的翻译动态。该多功能检测方法可区分结构效应，支持体外转录优化，并加速mRNA治疗药物的开发。

摘要

快速开发出用于对抗 COVID-19 的疫苗，展示了信使 RNA（mRNA）疗法在变革药物研发方面的潜力。与成熟 mRNA 相似， 体外 转录出的mRNA具有相同的元件，包括5’端帽子结构、非翻译区（UTRs）、编码序列和多聚腺苷酸尾（poly(A) tail）。以往研究这些元件对mRNA翻译影响的工作主要依赖高度设计的报告蛋白，这类蛋白具有高效的翻译能力和蛋白质稳定性。由于各mRNA的结构元件对其翻译效率存在差异性影响，因此必须确定与目标治疗蛋白（POI）相关的最优设计。为实现对POI翻译的表征，本研究采用了分裂型荧光素酶互补系统。该系统中，一个短肽标签（HiBiT）可融合至POI的任一末端，其能与互补的异源二聚体（LgBiT）结合，并在细胞可渗透底物存在下恢复酶活性。迄今为止，分裂型发光标记技术主要用于高通量蛋白质周转率研究。我们先前已证明，分裂型发光标记可用于实现mRNA翻译过程的高通量、时间分辨定量分析 细胞内 在稳定表达互补异源二聚体的HEK293细胞中。在此，我们进一步展示了该检测方法的多功能性，并详细说明了如何利用该检测方法进行优化 体外 转录以降低成本。该检测系统能够独特地区分结构组分的改变，同时突出显示使用非工程化基因进行编码序列优化的效果。此外，我们证明了将5’帽浓度减少4倍后对 体外 转录结果导致等效翻译 细胞内这些发现表明，分裂型发光标记可轻松整合到mRNA治疗工作流程中，从而实现对mRNA驱动的蛋白质表达动态的实时监测 细胞内 从而为mRNA药物的研发提供了一种多功能的方法。

引言

信使RNA（mRNA）治疗及研究应用近年来迅速扩展，这得益于mRNA疫苗的成功1,2以及RNA作为一种可编程生物分子的多功能性日益受到认可。该领域的一个核心挑战在于能够在多种背景下对mRNA翻译效率进行定量和动态评估。本文所述方法利用一种分裂型发光标记系统，为在活细胞中研究mRNA翻译提供了一个灵活且可扩展的平台in cellulo3。该方法的总体目标是使研究人员能够测量序列特征、化学修饰和结构元件如何影响翻译动力学以及后续的蛋白质降解，从而为优化用于治疗和基础科学研究的mRNA构建体提供有力工具。

体外转录的 mRNA 模拟了成熟转录本的核心结构，包含 5′ 帽结构、非翻译区（UTRs）、编码序列和 poly(A) 尾，通常还含有修饰核苷酸以降低免疫原性4,5。大量研究表明，这些元件中的每一个——单独或组合使用——均可被工程化改造，从而显著影响翻译效率和蛋白产量6,7。然而，大多数先前的研究依赖于高度优化的报告蛋白，例如绿色荧光蛋白（GFP）7、NanoLuc8 或 SARS-CoV-2 刺突蛋白8,9，这些蛋白被设计为高效翻译并产生极为稳定的产物，因此无法反映治疗性应用中所面临的实际挑战。由于治疗性 mRNA 编码多种多样的目的蛋白（POI），每种蛋白均受到独特的结构限制和细胞类型特异性调控，因此，适用于某一构建体的最优翻译设计原则可能并不适用于其他构建体，这一点已有文献报道3。因此，确定特定治疗性目的蛋白的最佳构型至关重要，且需要具备能够灵敏而系统地评估转录本各个特征如何影响蛋白表达水平的方法。

核糖体靶向方法（如多聚核糖体分析）通过梯度离心区分翻译组分10，而核糖体谱分析（Ribo-seq）则可在核苷酸水平上解析核糖体占据情况、起始位点及暂停现象11。与Ribo-seq类似，其他基于测序的方法，如交联免疫沉淀分离RNA的高通量测序（HITS-CLIP）和翻译核糖体亲和纯化（TRAP），可进一步表征与RNA结合蛋白或核糖体相关的RNA的翻译过程12。尽管这些技术功能强大，但其需要复杂的制备流程、专用设备和计算分析专业知识，因此不适用于高通量治疗性mRNA的开发。新生肽链免疫沉淀技术13通过从核糖体中免疫沉淀FLAG标签蛋白，并利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）进行定量，从而测量翻译效率。虽然该方法可适用于治疗性mRNA，但其实验操作繁琐、时间分辨率低，且不适合高通量应用。SunTag系统14可通过单个mRNA分子实现活细胞中蛋白质合成输出及翻译调控的实时检测，其原理依赖于与GFP融合的单链可变区片段（scFv）与多串联重复的肽表位之间的相互作用。该系统能够以单mRNA分辨率动态监测翻译过程和定位，因此已被用于开发多种新生肽链追踪系统15,16。然而，该方法通量较低，且需要使用高倍显微镜。

尽管新生蛋白的标记不可避免，但已发现可利用源自NanoLuc荧光素酶的一个小肽标签，用于在活细胞中报告mRNA的翻译情况。NanoLuc荧光素酶经过工程化改造，可分割为一个11个氨基酸的小亚基（HiBiT）和一个158个氨基酸的大亚基（LgBiT），二者能够快速二聚化，并在底物存在下重组为具有功能的荧光素酶17,18该分裂型发光标记系统在mRNA动态研究中具有多项关键优势。首先，与目标蛋白融合的小型亚基体积极小，使得所编码的构建体尽可能接近天然目标蛋白。由于编码序列长度可直接影响翻译效率19，最小化标签长度可提高我们对合成mRNA翻译动态的预测能力。关键的是，这种最小化标记策略能够检测由同义编码序列变异所驱动的翻译差异，从而在不依赖蛋白质序列或稳定性的前提下独立研究翻译效率3因此，使用较大的标签（如荧光蛋白或全长荧光素酶）效果并不理想。其次，本研究采用的分裂型发光标记系统可实现信号的即时生成，具有快速且高效的特点 细胞内 互补反应据报道具有高亲和力（KD = 700 pM）的灵敏度，且可用于检测蛋白质转换调节，最短每30秒即可获得一次读数18. 尽管最初的分裂型发光标记系统主要以其他分裂荧光素酶系统为基准进行比较17,18在此背景下，关键优势在于信号生成不受蛋白质成熟过程的限制。相比之下，荧光蛋白需要发色团成熟，这一过程可能耗时数分钟至数小时20 从而限制了时间分辨率。最后，本研究采用的已建立的分裂发光标记系统克服了分裂荧光蛋白系统的局限性，后者通常需要在互补后形成发色团21，引入了额外的延迟，限制了其在捕捉快速动态过程中的适用性。先前的研究已证明分裂发光标记在蛋白质周转检测和降解研究中的应用价值22,23,24将这一成熟技术拓展至翻译动力学研究代表了一项重要的方法学进展。例如，尽管核糖体谱型分析能够揭示核糖体在转录本上的分布密度，却难以有效捕捉在不同条件下翻译起始或延伸速率的动态变化。如先前所述3该分裂型发光标记系统能够检测改变帽结构、5′非翻译区（UTR）组成、密码子优化、核苷酸修饰以及poly(A)尾长度时的差异，而这些因素均为翻译效率的关键决定因素。其广泛的应用性使该方法在解析单个mRNA特征对整体蛋白表达贡献方面具有独特优势。值得注意的是，根据所用仪器的不同，该技术可同时获取单细胞和整孔数据。具备采集基于发光信号图像能力的成像平台可使该技术适用于单细胞翻译动态的研究。本文重点介绍基于酶标仪的孔板检测应用，因其具备中高通量特性且对数据分析的要求较低。

考虑采用该方法的研究人员应根据其特定的实验目标评估该方法的适用性。该检测方法在需要对合成mRNA构建体进行高通量筛选的情境下尤为有价值，例如基于mRNA的治疗设计流程中。该方法适用于对合成mRNA序列特征（包括非翻译区、密码子使用情况或核苷酸修饰）进行比较分析，能够检测到翻译效率上的细微差异3。由于该系统可兼容无细胞翻译平台、活细胞检测以及特定时间点的裂解检测，因此为希望将实验设计针对机制研究或应用研究进行优化的研究者提供了灵活性。同时，也必须认识到该技术的局限性。关键在于，分裂型发光标记检测无法提供核糖体占据情况的分辨率，这一能力仍为核糖体足迹分析方法所独有；此外，它也不能直接测量RNA的稳定性或降解情况，这些参数可能需要通过互补的方法进行评估。然而，由于现有以核糖体为中心的技术存在局限性，研究人员仍需依赖基于标签的检测方法（如分裂发光系统），通过蛋白质表达的动态变化来间接研究mRNA驱动的翻译动态。因此，尽管该系统是监测合成mRNA驱动蛋白表达的有力工具，但其适用性取决于研究问题是否聚焦于动态的蛋白质产出，而非精细的核糖体定位或RNA降解过程。

综上所述，分裂型发光标记系统是一种强大且多功能的方法，可用于研究mRNA的翻译过程。该方法的总体目标是为研究人员提供一个灵活、可系统扩展、高通量的平台，能够检测由具有不同结构和序列元件的合成mRNA所导致的蛋白质表达水平差异3。该技术的开发 rationale 在于克服现有方法的局限性，在灵敏度、可扩展性和时间分辨率方面具有优势。在RNA生物学与RNA治疗领域的广泛文献背景下，该方法为实验手段提供了有价值的补充，既有助于获得基础性科学认知，也推动了转化医学的发展。通过仔细评估该检测方法的优势与局限性，研究人员可判断其在特定应用场景中的适用性，从而在快速发展的RNA科学领域中最大化其应用价值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

整个实验方案的图示见图1。

1. 模板制备 体外 体外转录（IVT）

注意：为制备体外转录（IVT）所需的DNA模板，应确保质粒DNA包含RNA聚合酶启动子（通常为T7或SP6）、5’和3’非翻译区（UTR）以及目的蛋白（POI）的开放阅读框（图1）。

  1. 使用位于3’非翻译区（3’ UTR）之后的单一酶切位点的限制性内切酶线性化质粒DNA，并按照制造商说明书配制反应体系。孵育后，采用基于离心柱的DNA纯化试剂盒对酶切反应产物进行纯化。使用分光光度计对DNA进行定量。
  2. 为验证线性化效果，配制含0.1 µg/mL溴化乙锭DNA染料的1%琼脂糖TAE凝胶。将150 ng酶切后的DNA与水及上样染料混合。将样品、未酶切质粒及DNA分子量标记物上样至琼脂糖凝胶中，在1× Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中以100 V电压电泳40分钟。使用凝胶成像系统观察结果。
    注意：溴化乙锭溶液为强效诱变剂，操作时需佩戴适当个人防护装备（PPE），谨慎处理。
  3. 若质粒DNA在3’ UTR之后无poly(A)尾，可通过PCR引入。使用高保真DNA聚合酶及合理设计的引物，按照制造商说明书完成PCR反应。确保扩增产物包含T7启动子、开放阅读框及poly(A)尾。
    备注：加帽技术对T7启动子区域的序列可能有特定要求，可通过合理设计正向引物满足该要求。反向引物应结合于3’ UTR末端并引入poly(A)尾（建议长度至少为80个T）。对于高GC含量的构建体，建议采用递增式PCR和/或添加3% DMSO。
  4. 为验证PCR成功，配制含溴化乙锭的琼脂糖TAE凝胶（参见步骤1.2）。若构建体长度≥1 kb或<1 kb，分别配制1%或2%的凝胶。取5 µL PCR产物与水及上样染料混合。将样品和DNA分子量标记物上样至琼脂糖凝胶，在TAE缓冲液中以100 V电压电泳40分钟。使用凝胶成像系统观察结果。
  5. PCR产物经大小验证后，使用基于离心柱的DNA纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化。用15–20 µL洗脱缓冲液（通常随DNA纯化试剂盒提供）或无核酸酶水洗脱，以浓缩用于体外转录（IVT）的DNA模板。使用分光光度计对DNA进行定量。

2. 体外 转录

  1. 开始前，使用RNase去污染溶液喷洒并擦拭工作台面、手套和移液器。为提高产量和质量，应在无菌操作台环境中进行此操作。
  2. 根据制造商说明书，解冻并组装基于T7的体外转录（IVT）试剂盒的组分。
    注意：某些制造商建议使用二硫苏糖醇（DTT，0.1 M）以限制反应氧化并提高效率。当与试剂盒兼容时，建议执行此步骤。若使用修饰的dNTP，应以等量的修饰核苷酸替换相应的未修饰核苷酸。可评估半量反应的产量，因全量反应未观察到产量的显著提升。当合成多种mRNA时，建议配制主混合液，以减少移液误差和实验变异。
  3. 用移液器充分混匀后短暂混合，在37 °C孵育5小时，使用加热盖以防止冷凝。如有需要，可将孵育时间延长至过夜，这对mRNA产量或完整性影响极小。
  4. 加入1 µL DNase I，用移液器充分混匀。37 °C孵育30分钟。
  5. 纯化 体外 体外转录（IVT）RNA
    1. 使用基于离心柱的RNA纯化试剂盒，按照制造商说明书对体外转录（IVT）反应产物进行纯化（不同试剂盒可能导致回收效率和结合容量存在差异）。洗脱时，加入60 µL无核酸酶水，室温孵育5分钟，随后离心。
    2. 或者，采用氯化锂沉淀法，这是一种成本更低且更灵活的方法。
      1. 加入等体积的7.5 M氯化锂至反应体系中，混匀后于-20 °C孵育过夜。
      2. 在 4 °C 条件下以 18,300 × g 离心 20 分钟，然后小心移除上清液，避免扰动 RNA 沉淀。
      3. 用950 µL 70%乙醇洗涤，在4 °C下以18,300 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在室温下晾干约5分钟，然后重悬于无核酸酶水中（通常使用60 µL；可根据沉淀大小适当减少体积以提高浓度）。
        警告：若未正确使用个人防护装备，氯化锂可能导致皮肤或眼部刺激。操作时应佩戴手套和眼部防护用具。乙醇为高度易燃液体，可引起眼部刺激。应远离明火，并穿戴适当的个人防护装备，包括眼部防护用具。
  6. 使用分光光度计定量 mRNA。确保 mRNA 的 A260/A280 比值约为 2.0，并确认 A260/A230 比值在 1.8 至 2.2 之间。
  7. 为确认体外转录（IVT）成功，制备含溴化乙锭的1%琼脂糖TAE（非变性）凝胶。将500 ng mRNA与水及上样染料混合，按照试剂盒说明书进行RNA ladder的配制及变性处理。将样品加入琼脂糖凝胶，在TAE缓冲液中以80 V电压电泳40分钟，随后使用凝胶成像系统进行观察。
  8. 为进一步确认mRNA大小的准确性，将样品在Bioanalyser上进行检测。
  9. 为避免反复冻融，将mRNA分装成实验所需体积的 aliquot。例如，在96孔板中每孔使用1.2 pmol mRNA。因此，按1.2 pmol × n个重复计算所需体积并分装，随后于-80 °C保存。

3. HEK293 逆转录转染

注意：为实现时间分辨测量，需要使用稳定表达互补荧光素酶片段的细胞系。可通过转染表达所需荧光素酶片段的质粒并进行克隆筛选，从而建立稳定细胞系。此方法允许研究者在任意选定的细胞背景下动态监测mRNA翻译过程的时间变化。此外，也可直接购买表达所需互补荧光素酶片段的细胞系。本实验采用的是稳定表达互补异源二聚体的HEK293细胞。

  1. 开始前，将 mRNA 置于冰上解冻，以避免降解。
  2. 制备转染复合物。对于 96 孔板，每孔需要 1.2 pmol mRNA。若设置重复，建议制备 2.5 份重复量，以补偿移液误差。因此，将 3 pmol mRNA 与 Opti-MEM 低血清培养基混合，终体积为 50 µL（20 µL/孔）。
  3. 加入 0.5 µL 阳离子脂质转染试剂（0.2 µL/孔），通过反复吹打混匀，室温孵育。孵育 5 分钟后，再次吹打混匀，然后每孔加入 20 µL 至 96 孔白色平底微孔板中。建议将转染孔置于板中央，边缘孔留空。
  4. 通过移除培养基并用 2 mL 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，制备 HEK293 细胞。去除洗涤液后加入 500 µL 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 孵育 3 分钟。
  5. 在细胞解离过程中，向 96 孔板的边缘孔加入 PBS，以减少细胞培养期间的培养基蒸发。若所有孔均需使用，可在孔间区域加满 PBS。
  6. 加入 4.5 mL 添加了 1× L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）以收集细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
  7. 将所需数量的细胞（足够每孔接种 1 × 105 个细胞）加上额外 3 孔的量（用于补偿移液误差）转移至新离心管中，500 × g 离心 2 分钟。
  8. 弃去上清液，用含 10% FBS 和 Endurazine 活细胞底物（1:200）的 Leibovitz L-15 培养基（无酚红）重悬细胞，确保终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。使用移液管充分混匀，确保 Endurazine 均匀分布。每孔加入 100 µL 重悬细胞（含 1 × 105 个细胞）。
    注意：若进行持续 72 小时的时间进程实验，应将体积增加至 200 µL，以避免蒸发。
  9. 转染后立即将细胞放入设定为 37 °C 的酶标仪（化学发光检测仪）中。以 1 秒积分时间定期采集数据。由于系统具有高效的互补能力，信号可在数分钟内检测到。因此，为获得准确的基线读数，此步骤必须迅速执行。采集间隔取决于具体实验和仪器；然而，在本实验中发现，18 小时时间进程实验每 12 分钟测量一次，72 小时实验每 48 分钟测量一次效果最佳。化学发光检测无需滤光片；但使用 530–540 nm 滤光片可获得更高的信噪比。
    注意：分裂荧光素酶标记的 eGFP 会产生生物发光共振能量转移（BRET）信号，因此 530–540 nm 滤光片会同时捕获化学发光和荧光信号。为避免捕获 BRET 信号，可使用 460–480 nm 滤光片，或选用非荧光蛋白（如 MYL3）作为对照。

4. 数据分析

  1. 通过将每种条件的信号归一化至其第一个时间点（t0，归一化为技术重复的平均值）来计算相对发光单位（RLUs）的倍数变化，因为实验开始时的信号代表背景水平。
  2. 通过归一化至对照条件，降低生物学重复之间的变异性。
  3. 根据所提出的问题选择实验的统计分析方法，可选择单个时间点或曲线下面积（AUC）。
    1. 对于单个时间点，使用目标蛋白（POI）表达达到峰值的时间点（依赖于目标蛋白）以及实验终点时间。绘制第4.1步计算出的特定时间点（例如240分钟）的RLU值，并采用适当的统计检验方法进行分析。
    2. 通过计算特定时间段（例如t0至240分钟）或整个实验时长（例如t0至终点）的曲线下面积（AUC），以评估蛋白质翻译与降解的动力学。将每个生物学重复的AUC值归一化至参考mRNA的平均值，从而获得AUC倍数变化的度量值，并可使用适当的统计检验方法进行分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

有多种方法可以优化本方案的成本效益。例如，将体外转录（IVT）反应体积缩小至厂家推荐体积的一半，结果发现其产量已满足细胞内实验所需的用量。in cellulo 实验需注意，序列长度和复杂性会影响 IVT 产量，因此成功的方案优化应至少每轮 IVT 反应产生 50 µg 的 mRNA。与 IVT 反应试剂盒类似，加帽试剂的成本通常也较高。考虑到每个 mRNA 分子仅需一个帽子结构，我们推测 IVT 反应体系中帽分子的数量远超过最终生成的 mRNA 分子数。因此，我们进一步探究了通过滴定加入 IVT 反应的加帽试剂用量是否可进一步优化该方案，结果如图2所示。在 10 µL IVT 反应体系中分别加入 100%（终浓度 10 mM 帽结构）、50%、25% 或 0%（无帽结构）的加帽试剂，所得 eGFP mRNA 被转染至稳定表达互补异源二聚体的 HEK293 细胞中。作为归一化对照，同时转染 MYL3（100% 加帽），该内源基因编码一种富集于肌肉的结构蛋白，其翻译动力学与 eGFP 相似，但信号强度更接近其他内源基因3

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

近年来，mRNA 治疗领域发展迅速，凸显了序列设计与优化在研发流程中的关键作用。研究者已投入大量努力，致力于开发用于预测最有效 RNA 结构与组成的计算工具，其中序列优化尤为受到关注8,9尽管这些工具功能强大，但这些设计的实验验证仍是整个流程中不可或缺的一部分。然而，这种验证在很大程度上依赖于报告蛋白，包括GFP7，NanoLuc8，以及 SARS-CoV-2 刺突蛋白9 这些蛋白质本身已具有极高的稳定性且翻译效率极高。为克服这一局限性，研究中将分裂荧光素酶系统整合到一个流程中，以研究翻译动态过程 体外 HEK293细胞中转录的mRNA，实现时间分辨率3，并展示了在mRNA工程中利用报告蛋白检测翻译变化的局限性。本文详细描述了执行该检测所需的操作步骤，证明了体外转录（IVT）反应可实现微型化，且在不影响翻...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Laura Itzhaki 提供的 HEK293 LgBiT 细胞系。本研究由英国心脏基金会项目资助和转化奖（G114642 和 G919651，授予 CHW）以及 GenScript 生命科学研究基金（CAPB）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Sigma-AldrichA6283TAE 缓冲液组分
琼脂糖Sigma-AldrichA9539用于凝胶电泳
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939B用于 mRNA 质量控制的生物分析仪
CLARIOstar Plus 发光检测仪BMG Labtech430-501S-F用于检测发光信号的酶标仪/发光检测仪
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113用于体外转录（IVT）的 5' 帽结构
DMEM 高糖含丙酮酸钠培养基Thermo Fisher Scientific41966029用于培养 HEK293-LgBiT 细胞的培养基
DNase INew England BiolabsM0303体外转录（IVT）反应后降解 DNA 模板
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537用于细胞洗涤及添加至孔板中防止蒸发
EDTA，pH 8.0，无 RNaseThermo Fisher ScientificAM9260TAE 缓冲液组分
溴化乙锭Sigma-AldrichE1510凝胶电泳染色剂
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524添加至 DMEM 中的补充物
HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒New England BiolabsE2040体外转录（IVT）试剂盒
Leibovitz L-15 培养基，无酚红Thermo Fisher Scientific21083027在发光检测期间用于 HEK293-LgBiT 细胞培养的培养基
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-024添加至 DMEM 中的补充物
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150基于脂质的转染试剂
氯化锂沉淀溶液Thermo Fisher ScientificAM9480体外转录（IVT）后 mRNA 纯化的替代方法
Monarch Spin PCR & DNA 纯化试剂盒New England BiolabsT1130质粒线性化后的纯化试剂盒
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计Thermo Fisher ScientificND-ONE-W用于定量 DNA 和 mRNA 浓度的分光光度计
Nano-Glo Endurazine 活细胞底物PromegaN2570添加至 L-15 培养基中用于发光检测的底物 
NucleoSpin RNA 纯化试剂盒Macherey-Nagel12708612体外转录（IVT）反应后纯化 mRNA
Nunc MicroWell 96 孔 Nunclon Delta 处理平底微孔板Thermo Fisher Scientific136101用于 HEK293-LgBiT 细胞铺板及后续检测的孔板
Opti-MEM 低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985062用于转染反应的培养基
Phusion 高保真 PCR 试剂盒New England BiolabsE0553PCR 试剂盒
RiboRuler 高分子量 RNA MarkerThermo Fisher Scientific11883993用于凝胶电泳的 RNA 分子量标准
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020RNase 去污染喷雾剂
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066TAE 缓冲液组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma-AldrichT4174细胞解离试剂
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水Thermo Fisher Scientific10977035用于模板制备和体外转录（IVT）

参考文献

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

mRNA 5 mRNA
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。