一种基于低成本无标记DeepLabCut的小鼠自由运动自发步态与运动分析工作流程

摘要

我们介绍一种基于DeepLabCut的低成本、无标记物工作流程，用于量化自由活动小鼠的自发步态和运动行为。该方案结合单摄像头视频采集、解剖学标志点的无标记追踪以及时空运动参数的提取，提供了一种无需特殊设备的非侵入性且易于实施的运动行为分析框架。

摘要

步态是一种广泛使用的功能性生物标志物，可用于检测多种疾病和状态下运动功能的改变，因为它能够反映协调性、力量、平衡以及感觉运动整合的变化。然而，传统分析动物模型步态的方法通常需要昂贵的设备、复杂的装置或侵入性操作，这些都可能改变动物的自然行为。本文介绍一种基于DeepLabCut（一种开源姿态估计算法）的低成本、无标记流程，用于对自由活动小鼠的步态和自发运动进行定量分析。该方法依赖单摄像头视频采集、解剖标志点的无标记追踪以及时空运动参数的提取，无需使用物理标记物或专用硬件。为展示该方案的适用性，本研究以阿尔茨海默病三重转基因小鼠模型（3xTg-AD）作为典型应用示例进行了验证。该方法可保持动物自由活动，最大限度减少操作相关应激，实现对运动行为的非侵入性评估。该方案适用于标准的行为学测试环境。总体而言，该方法为临床前研究中步态与运动行为的定量分析提供了一种易于获取且非侵入性的技术框架。

引言

步态是一种复杂的运动过程，源于运动、感觉和认知系统之间的实时相互作用，需要对感觉反馈、姿势控制、运动规划和肌肉激活进行协调处理，以产生稳定且适应性的运动¹。由于其整合特性，步态改变在临床实践和实验研究中 increasingly 被视为神经系统功能障碍的功能性指标。在人类和动物模型中，步态分析能够检测活动能力、跌倒风险、虚弱程度和功能状态的变化，并已被提出作为多种疾病进展和干预效果的生物标志物^2,3,4。

在基础研究中，特别是在小鼠模型中，评估自发步态和运动活动是一种广泛使用的方法，用于表征运动表型，并评价生理干扰和治疗干预的影响。对运动参数进行客观量化，能够检测出仅靠肉眼观察难以可靠识别的细微运动变化，这一局限性在针对早期或轻度表型的临床前研究中尤为突出⁵。在此背景下，步态分析已成为研究运动行为改变、识别不同实验条件下（如神经系统疾病和神经退行性疾病）相关功能变化的重要工具⁶。

对小鼠模型运动行为和步态的分析传统上依赖于专门的技术平台，用于量化空间和时间运动学变量。常用系统包括 illuminated walkways、instrumented platforms 以及商业化的运动追踪软件；然而，这些系统对昂贵硬件和专用基础设施的依赖显著限制了许多实验室的可及性^7,8,9,10。除经济因素外，这些方法还引入了额外的实验限制。一些系统要求动物穿越狭窄的通道或高度照明的路径，导致强制性的运动模式，从而减少自发行为；而另一些系统则依赖于物理标记、颜料斑点或附着在肢体上的粘性标签。此类干预可能引发应激反应，改变步态力学，并干扰对运动结果的生理学解释^11,12,13,14。总体而言，这些局限性凸显了亟需发展能够在自然、自由活动条件下捕捉步态的方法，且无需依赖侵入性操作或昂贵的基础设施。

在无约束运动过程中评估步态能够观察到更为自然的运动模式，避免了人为调节速度、轨迹或姿势的外部限制。该方法有助于在最小约束条件下表征运动行为。DeepLabCut 是一个基于深度学习的开源姿态估计算法框架，利用卷积神经网络追踪用户自定义的解剖学标志点，无需使用物理标记物。通过从标准视频记录中实现解剖点的追踪，DeepLabCut 能够提取运动学参数，同时显著降低实验成本与复杂性^15,16,17,18。重要的是，无标记追踪最大限度地减少了实验干扰，适用于自发行为的研究。这种单摄像头无标记方法最适合在自由活动条件下，对自发运动活动及二维步态相关特征进行简便、非侵入性的量化研究。然而，当需要获取直接的生物力学变量（如地面反作用力、足底压力、关节角度或完整的三维肢体运动学）时，则需使用仪器化步态平台或三维运动捕捉系统。

本文的目的是介绍一种基于 DeepLabCut 的低成本、无需标记物的工作流程，用于对自由活动小鼠的步态和自发运动进行无创量化。该流程整合了单摄像头视频采集、解剖标志点追踪以及时空运动参数提取，操作简便，无需专用硬件或侵入性操作。本方案重点介绍该工作流程的方法学实施过程及典型的输出结果。

方案

所有动物实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行，并经墨西哥国立自治大学神经生物学研究所生物伦理委员会批准，批准编号为117。

1. 研究背景

1. 根据研究所需的实验条件使用小鼠。在本实验方案文章中，我们以三重转基因阿尔茨海默病小鼠模型（3xTg-AD）为例，该模型在PS1M146V基因敲入背景下携带APPSwe和tauP301L转基因，同时使用非转基因小鼠作为对照，以展示工作流程的实施。
2. 在研究开始前对所有动物进行基因型鉴定。
3. 在兽医监督下，将小鼠饲养于受控环境中，自由摄取食物和饮水，环境条件包括12:12小时明暗循环、温度22 °C ± 2 °C、相对湿度60% ± 5%。
4. 在光照阶段进行记录，记录前需经过60分钟的适应期，每只动物仅进行一次开放场地实验，以保持其自发探索行为，并避免因多次进入实验区域而导致活动量下降。
   注意：在本实验方案文章中，所展示的记录数据仅为代表性示例，旨在说明工作流程以及该方法所产生的运动和步态输出类型，而非用于支持组间生物学差异的比较。

2. 材料

1. 我们e 所列材料与设备 材料表 自发运动与步态记录及分析设备。参见 图1 用于实验装置的整体组装。

3. 自发运动的适应与记录

1. 动物准备与适应
   1. 在实验开始前至少60分钟，小心地将小鼠从饲养室转移至行为测试室，以使其适应环境。
   2. 行为测试室应维持受控的环境条件，包括恒定的温度（20 °C–22 °C）、标准化的光照强度（在测试区域水平面测量为120–150 lux）以及持续的白噪音，以尽量减少外界听觉刺激。
   3. 在适应期间，将动物保留在其原代饲养笼中，不引入额外刺激或环境丰富化措施。操作动物时应遵循机构动物福利指南，以尽量减少因应激引起的行为变异性。
   4. 使用洁净手套并以缓慢、有意识的动作操作动物。轻轻抓住小鼠尾根部，并用另一只手托住其身体，随后将其放入开放场测试箱中。
      ​注意：关键步骤：操作不一致或适应时间不足可能增加焦虑相关行为，并导致运动参数的变异性。确保所有动物和实验环节均采用相同的适应程序。
2. 开放场测试箱与摄像机准备
   1. 每次录制前，使用70%（v/v）乙醇彻底清洁丙烯酸开放场测试箱，以去除残留气味和先前的嗅觉线索。使用前确保表面完全干燥。
   2. 在通风良好的区域操作70%乙醇，远离热源或点火源，并在使用前确保测试箱完全干燥。
   3. 将开放场测试箱稳固地放置在木质平台上，确保结构稳定且无振动。
   4. 检查透明丙烯酸壁和哑光地面，确认其无灰尘、湿气或反光残留物，以免干扰视频追踪。
   5. 在测试箱两侧安装外部侧向白光灯，相对于测试箱平面呈约30–45°角，以在整个录制区域提供均匀照明，并尽量减少阴影、反光或过亮现象。每次实验前调整灯具位置，并确认测试箱水平面的照度保持在120–150 lux的目标范围内。
   6. 将摄像机置于测试箱下方，采用底部视角，距离测试箱平面约80 cm的固定距离，确保完整可见整个录制区域。请注意，根据具体摄像机的镜头光圈和视野（FOV），该最佳距离可能需要调整，以保持对整个测试箱的覆盖。
   7. 在引入动物前，将摄像机连接至计算机系统并启动视频采集软件。
   8. 调整摄像机焦距和视野，确保整个测试箱表面清晰可见且成像锐利。
   9. 将已知尺寸的棋盘格或校准图案放置于测试箱平面，采集参考图像用于空间校准。
      注意：关键步骤：准确的摄像机对准、固定的摄像机距离和一致的照明对于可靠的无标记姿态估算是至关重要的。几何或照明条件的偏差可能降低追踪精度，并损害不同实验环节间的数据可比性。
      注意：可使用不锈钢等替代材料作为外部支撑结构，前提是装置保持稳定且录制对准不变。
      注意：也可使用不透明测试箱或替代壁材，特别是在需要进一步控制外部视觉输入时，前提是录制装置保持稳定并尽量减少外部视觉干扰。
      ​注意：本方案中使用的测试箱尺寸对应于记录自由活动小鼠的配置。可根据所用啮齿类动物及采用的开放场方案调整尺寸，前提是保持动物完全可见、空间校准准确以及采集条件一致。
3. 自发运动行为的录制
   1. 在将小鼠放入测试箱前，短暂在视频画面中显示动物编号，以确保录制内容与相应实验环节之间有直接的视觉关联。
   2. 在将小鼠放入开放场测试箱中心前即启动视频录制，以确保从实验开始时即完整捕获初始探索行为。
   3. 轻柔地将小鼠放置于开放场测试箱中心。
   4. 连续录制3分钟的自发运动，期间不引入视觉、听觉或触觉干扰。在本方案中，每只小鼠仅进行一次录制。
   5. 在计算机屏幕上监控实时视频，确认录制连续无中断，并准确捕捉动物的运动。
   6. 在各次实验之间定期检查摄像机对准和照明均匀性，以确保不同动物间的录制条件一致。
   7. 录制结束后，停止视频采集，并按照上述相同操作程序小心地将动物从测试箱中移出。
   8. 将动物放回其原代饲养笼，并允许其在进行任何后续操作前休息。
      ​注意：录制期间避免重新定位动物，因为外部干扰可能改变自发步态模式，影响后续分析。
4. 清洁、数据存储与实验环节结束
   1. 每次实验后，再次使用70%（v/v）乙醇清洁开放场测试箱，并在引入下一只动物前确保其完全干燥。
   2. 在引入下一只动物前，确保测试箱表面无残留乙醇或气味。
   3. 每次录制后立即记录动物编号、实验日期与时间、实验条件及操作者姓名。
   4. 若需测试更多动物，请在相同的环境和实验条件下，从步骤3.1.1开始重复该流程。
   5. 使用标准化命名规则将每个视频文件保存至专用文件夹（例如：AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4）。
   6. 实验日结束时，关闭摄像系统和照明设备，以防止不同实验环节间照明设置发生漂移。
      注意：尽管本方案使用70%乙醇（因其在此类操作中为常用消毒剂），也可使用对丙烯酸兼容的消毒剂以避免表面逐渐劣化，前提是测试箱在下次录制前完全干燥且无残留气味。
      注意：在可行情况下，可准备多个测试箱，以便在不同实验环节间立即切换，促进实验在不同动物间的连续进行。
      参见 图1 了解实验装置的材料与组装，包括木质平台（图1A）、丙烯酸测试箱（图1B）、侧向照明系统（图1C）、底部视角摄像机位置（图1D）以及完整的实验装置（图1E）。

图1： 在开放旷场环境中记录运动行为的实验装置示意图。 （A）旷场装置的支撑结构；（B）放置于平台上的丙烯酸开放旷场装置；（C）侧面照明系统，以确保光照均匀；（D）摄像机从下方记录动物运动的定位方式；（E）完整的实验装置。白色箭头指示了图1C中光源的方向以及图1D中摄像机的朝向。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 视频处理与运动学分析

1. 视频准备与质量控制
   1. 以 .MOV 格式获取原始视频，并将其转换为 .avi 格式以兼容 DeepLabCut，同时保持恒定的帧率和分辨率参数。
   2. B在获取后立即备份所有原始视频文件至分析计算机上的专用文件夹，并采用标准化命名规范（例如：AnimalID_Session_Date）。
   3. 完整查看每段视频，确认录制完整且无中断、丢帧或损坏情况。存在采集错误的视频应排除在分析之外。
   4. 若原始格式不兼容 DeepLabCut，可将视频转换为 MP4（H.264）或未压缩 AVI 格式。
   5. 可选地，对视频进行时间裁剪，以去除实验会话开始和结束时的非实验时间段（例如动物被引入或移出实验区域期间）。
   6. 确认分辨率和帧率与录制时使用的采集参数一致，并在所有会话中保持统一。
   7. 验证视频画面中整个实验区域表面均可见，且动物运动过程中无身体部位持续被遮挡。
   8. P将所有已验证并处理完毕的视频放入指定的 DeepLabCut 分析项目目录。
      ​注意：关键步骤：帧率不一致、实验区域部分不可见或运动模糊将直接降低追踪准确性。不符合质量标准的视频不得用于模型训练或推理。
2. 项目创建与配置
   1. 为项目指定视频库，可使用拟用于分析的相同视频，或用于网络训练的代表性子集。
   2. 启动 Python 环境并导入 DeepLabCut 软件包。
   3. 使用以下命令创建新的 DeepLabCut 项目：
   4. deeplabcut.create_new_project('ProjectName','Author','VideoPath')。
   5. 在 config.yaml 文件中定义感兴趣的解剖标志点（身体部位），确保定义清晰且解剖学上一致。
   6. 身体部位的定义应根据实验问题优化，并在所有动物和会话中保持完全一致。
3. 帧提取与身体部位标注
   1. 根据视频长度和空间布局，在 config.yaml 文件中设置 start、stop、numframes2extract 和 cropping_parameters 参数。
   2. 使用以下命令提取代表性帧：deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automatic', 'kmeans'/'uniform')。
   3. 检查提取的帧，确认其涵盖了记录期间的身体姿势、朝向、肢体位置和步态相位的多样性。若某些特定姿势、肢体构型或运动相位代表性不足，应额外提取帧以更好覆盖这些条件。
   4. 当需要特定步态周期相位时，使用以下命令手动提取帧：deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manual')。
   5. 使用以下命令启动图形化标注界面：deeplabcut.label_frames(config_path)。
   6. 标注 图2 中所示的所有预定义解剖标志点，包括采集期间的代表性视频帧（图2A）、叠加在原始帧上的自动身体点检测结果（图2B），以及用于分析的定义身体标志点和实验区域参考点的示意图（图2C）。遵循一致的解剖学标准（例如：鼻部：吻部前端尖端；尾基部：脊柱与尾巴的连接处）。
   7. 一致地标记四肢，将每个标志点置于脚掌着地时足底垫的中心位置。
   8. 使用以下命令保存并检查标签：deeplabcut.check_labels(config_path)，必要时修正不准确的标注。
   9. 在可行情况下，邀请第二位经过培训的评估者标注部分帧，以评估评分者间一致性。
      注意：关键步骤：不一致或解剖学上不精确的标注是下游追踪错误的主要来源。. 必须确保所有帧中严格遵循标志点定义。
4. 神经网络训练
   1. 对姿态估计算法模型进行 200 轮训练，获得最终平均训练误差（RMSE）为 3.27 像素，平均测试误差为 3.59 像素，表明在所述采集条件下具有稳定的追踪性能。
   2. 使用以下命令创建训练和评估数据集：deeplabcut.create_training_dataset(config_path)。
   3. 在 config.yaml 中调整 Training Fraction 参数，以定义用于训练的图像比例。
   4. 运行 nvidia-smi 命令验证 GPU 可用性。
   5. 使用以下命令启动网络训练：deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200)。
   6. 监控训练损失，当损失值趋于稳定且无进一步改善时停止训练。
   7. 若训练中断，从上次保存的检查点恢复训练。
   8. 使用以下命令评估训练后的模型：deeplabcut.evaluate_network(config_path)，并记录平均像素误差。
   9. 若误差超过实验设置的可接受阈值，则添加更多标注帧或优化标注，并重复训练。
      注意：可接受的像素误差阈值可能因相机分辨率和实验区域大小而异，但在各实验间应保持一致。
5. 视频分析与步态量化
   1. 将似然值低于 0.3 的点视为缺失。
   2. 仅当缺失间隔 ≤3 个连续帧时，对缺失点进行线性插值；更长的间隔应从分析中排除。
   3. 使用身体中心速度阈值 10 cm/s 定义运动片段。
   4. 排除低于该阈值的运动以及持续时间短于 3 帧的瞬时事件。
   5. 使用以下命令对实验视频运行推理：deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=True)。
   6. 使用以下命令生成带标注的视频：deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path])，以视觉确认追踪质量（图2）。
   7. 在 config.yaml 中将 pcutoff 参数设为 0.6，以便在追踪可视化和评估期间应用置信度阈值。
   8. 将输出的 CSV 文件导入 材料表 中列出的统计计算环境，并结合相应的分析包及 补充材料1 中提供的自定义脚本，进行行为量化分析。
   9. 利用原始视频采样率将帧索引转换为时间。
   10. 通过已知实验区域尺寸和追踪到的区域角点标志点，将像素坐标转换为物理单位，完成空间维度校准。
   11. 在提取度量参数前，对追踪坐标进行质量控制。
   12. 将似然值低于 0.3 的点视为缺失，并在适当时用线性插值替代。
   13. 通过视觉检查识别异常轨迹，并在必要时进行修正或排除。
   14. 基于身体中心位移和后肢运动的同步运动学标准定义步态段。
   15. 排除直立、转向和理毛等非运动行为。
   16. 根据实验条件和动物模型手动校准并优化定义阈值，仅保留稳健、连续的运动片段用于分析。
   17. 使用经过筛选的连续运动片段，计算由追踪标志点之间的几何和时间关系导出的步态参数（表1）。这些参数包括步幅长度、步长、步宽、步频、步周期、单步持续时间、支撑时间、摆动时间、同侧振幅以及特定肢体的位移测量值。
   18. 使用相同的追踪数据从完整记录中提取开放场参数（表1）。这些参数包括总移动距离、平均速度、移动时间、移动时间百分比、行走片段的数量和持续时间，以及在中心区、边缘区和角落区覆盖的累积距离。
   19. 将所有输出结果汇编成结构化的主文件，用于后续统计分析。
   20. 使用 材料表 中列出的计算环境及上述绘图脚本，生成可视化表示（例如轨迹图、热图、基于时间的位移图、步态模式图和肢体间协调图）。
   21. 补充视频1 和 补充视频2 提供了点置信度、运动片段检测、探索区域分类和肢体间协调的代表性同步可视化结果，以帮助理解分析流程。
6. 质量控制与数据备份
   1. 随机抽查部分带标注的视频，确认帧间和会话间的解剖学一致性。
   2. 比较预测的标志点位置与标注标签，验证模型的稳定性与泛化能力。
   3. 保存项目的完整副本，包括 config.yaml、原始标签、训练好的网络权重和输出文件。
   4. 记录工作流程中使用的软件版本，包括 DeepLabCut、Python、PyTorch、CUDA 和统计计算环境，以及 GPU 规格和分析日期。
   5. 从 evaluation-results.csv 生成平均误差和处理时间的汇总报告。
   6. 将整个项目备份至本地归档存储以及机构服务器或安全的云存储中。
7. 计算环境与可重复性资源
   1. 以 .MOV 格式采集原始视频，分辨率为 1080 × 1920 像素，帧率约为 60 FPS。
   2. 对视频进行预处理并转码为 .avi 格式。
   3. 在此转换过程中，裁剪感兴趣区域，将其调整为 720 × 720 像素的方形分辨率，并将帧率标准化为恒定的 60 FPS，以确保后续运动学分析中的时间量化准确性。
   4. 在配置为 Python 3.12.12、PyTorch 2.5.1 和 CUDA 11.8 的 Python 环境中，使用 DeepLabCut 版本 3.0.0rc13 实现无标记追踪工作流程。
   5. 对姿态估计算法模型进行 200 轮训练，获得最终平均训练误差（RMSE）为 3.27 像素，平均测试误差为 3.59 像素。
   6. 使用 补充材料1 中提供的统计计算环境和自定义脚本进行追踪后分析，用于步态和开放场量化。
   7. 使用身体中心速度阈值 10 cm/s 识别行走片段。填充运动片段间最多 3 帧的空缺，并排除持续时间短于 3 帧的瞬时运动，以保留连续的步态段用于分析。
   8. 在 补充材料1 中提供相关的 config.yaml 设置、代表性分析脚本、示例视频和追踪文件以及模型权重。
   9. 在 补充材料1 中提供额外的实施细节、模型评估指标、硬件规格和特定案例的分析参数（如适用）。
      注意：应根据各实验所用的采集条件调整这些参数。

图2： 基于视频记录的无标记身体关键点追踪与步态分析的代表性工作流程。 （A）采集期间小鼠在开放场地内自由运动的代表性视频帧。（B）姿态估计后，自动识别的身体关键点叠加于原始视频帧的示例，展示了用于分析的解剖学标志点。（C）用于步态重建、空间校准和定量运动分析的定义身体标志点及场地参考点的示意图。标志点及场地参考点包括：鼻尖（snout）、喉部（throat）、身体中心（body center）、身体中心左侧（bcl）、身体中心右侧（bcr）、左髋（hipl）、右髋（hipr）、尾基部（tail base）、尾中部（tail center）、尾尖（tail tip）、左前爪（lfp）、左后爪（lhp）、右前爪（rfp）、右后爪（rhp）、左上（tl）、右上（tr）、左下（bl）和右下（br）。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在应用追踪与分析工作流程后，自动化处理利用定义的身体中心标志点重建了动物在开放场中的自发运动，并生成了适用于下游分析的定量输出结果。代表性轨迹图展示了该方案如何捕捉动物在整个实验区域内的空间位移、时间分布以及自由探索过程中的速度动态变化。本节所示的开放场变量均基于完整录像记录计算得出，同时提供了代表性录像记录，以说明工作流程及该方案所产生的运动行为和步态输出类型。

在典型的非转基因（Non-Tg）记录中，重建的身体中心轨迹显示在整个实验区域内持续移动（图3A），而时间密度图和速度编码可视化图像则突出了探索过程中长时间停留的区域以及运动速度的波动情况（图3B）。典型的3xTg-AD记录显示出不同的运动模式，其轨迹空间受限更明显，覆盖实验区域的范围较小（图3C），同时伴随更集中的停留分布以及更长时间的低速运动状态（图3D）。

讨论

本研究提出了一种低成本、无标记的方法，通过标准视频采集和基于 DeepLabCut 的姿态估计算法，在可及的工作流程中分析自由活动小鼠的自发运动和步态。该工作流程能够从视频记录中提取运动和步态相关变量，同时保留自然的运动行为并减少实验干扰。因此，该方案为运动行为的临床前研究提供了一种实用且易于实施的替代方法。

本方案以阿尔茨海默病的转基因小鼠模型为例，展示了该工作流程的代表性应用。所生成的结果展示了利用此方法可获得的运动行为和步态参数类型^19,20,21,22。重要的是，本文所述方法强调在无约束条件下进行记录，从而有助于在最小限制下对运动行为进行表征。因此，该方法可作为补充手段，适用于那些不希望进行过度操作、侵入性操作或依赖特殊基础设施的研究。

基于深度学习的姿态估计算法的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇	通用	不适用	实验间隔期间清洁实验区域
可调白光灯	通用	不适用	维持恒定照明（100–150 lx）
黑色窗帘/防眩光装置	通用	不适用	减少外部光线/反射
棋盘格网格模板	通用	不适用	空间校准参考图像
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	开源	不适用	姿态估计算法软件
数字摄像机（高清，16:9；≥60 fps）	通用	不适用	各次实验中保持固定设置
Nvidia GPU 工作站	定制组装	不适用	模型训练与推理所需硬件
照度计	通用	不适用	验证实验区域水平的光照强度
PyTorch	Pytorch 基金会	不适用	DeepLabCut 所需的框架
透明亚克力开放场实验箱（42 × 42 × 42 cm）	自制 / 实验室内部制备	不适用	开放场实验装置
实验箱底部摄像机支架（90°视角）	自制 / 实验室内部制备	不适用	用于底部录像的稳定支架
CUDA	Nvidia 公司	不适用	GPU 加速的并行处理技术
R 编程语言	R 基金会	不适用	用于数据分析的编程语言