Rhizoma Drynariae 总黄酮（TFRD）通过抑制 AKT、MAPK 和 NF-κB 信号通路，减少炎症细胞浸润以及 TNF-α、IL-6 和 IL-17A 水平，从而缓解痛风性关节炎（GA），凸显其具有抗炎和免疫调节的治疗潜力。
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Rhizoma Drynariae 总黄酮（TFRD）通过抑制 AKT、MAPK 和 NF-κB 信号通路，减少炎症细胞浸润以及 TNF-α、IL-6 和 IL-17A 水平，从而缓解痛风性关节炎（GA），凸显其具有抗炎和免疫调节的治疗潜力。
痛风性关节炎（GA）是一种由单钠尿酸盐沉积引起的炎症性关节疾病 （MSU） 关节腔及周围组织中的晶体。在传统中医中， 骨碎补 （Gusuibu）长期以来在临床治疗GA中被广泛应用，黄酮类化合物被认为是其关键的生物活性成分。本研究采用网络药理学方法构建了Gusuibu总黄酮的成分-靶点网络 骨碎补 （TFRD）对骨关节炎的作用，从而鉴定出关键成分、核心靶点及相关通路。通过向关节内注射单钠尿酸盐晶体悬液建立大鼠模型，并以TFRD或阳性对照药物秋水仙碱经口灌胃给药进行治疗。在样本采集后，基于网络药理学的预测结果 随后采用大鼠血清代谢组学、酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹分析进行验证。网络药理学分析表明，TFRD抗GA的作用通过IL6、AKT1、TNF、EGFR、JUN和PTGS2等关键靶点介导，主要涉及炎症、免疫及凋亡相关通路，如IL-17、TNF、NF-κB、MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT和T细胞受体信号通路。同样，代谢组学也揭示了炎症反应的关键作用。苏木精-伊红（H&E) 染色证实TFRD减少了炎性细胞的浸润。ELISA检测证实，TFRD组显著抑制了滑膜组织中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-17A的表达。Western blot分析显示，TFRD抑制了GA诱导的大鼠滑膜组织中AKT、MAPK p38和NF-κB p65的过度磷酸化。TFRD可通过直接调控相关炎性因子及信号通路，有效改善GA大鼠由炎症引发的病理改变。
痛风性关节炎（GA）是一种由尿酸钠（MSU）晶体沉积引发的炎症性关节病 关节内及关节周围，可刺激关节区域1,2GA的发病机制涉及遗传易感性、环境因素和代谢紊乱之间的复杂相互作用，其主要特征是高尿酸血症，由尿酸生成过多或肾脏排泄不足所致。3,4这会导致尿酸盐晶体在肾脏组织和关节腔中系统性积聚，进而激活先天免疫系统，引发强烈的炎症级联反应。5,6近年来，一系列研究表明，随着肥胖症和代谢综合征发病率的上升，全球胃食管反流病（GA）的患病率亦呈上升趋势，导致患者功能受损，并对其个人造成显著的社会经济负担7痛风性关节炎的治疗策略主要集中在控制急性期局部关节炎症以及长期管理尿酸水平8,9然而，现有药物疗法的效用常因其不良反应特征和特定禁忌证而受到限制。例如，由于非甾体抗炎药存在诱发或加重急性肾损伤的风险，通常避免用于慢性肾病患者。10,11同样，降尿酸药物别嘌呤醇具有明确记录的严重皮肤不良反应风险，例如史蒂文斯-约翰逊综合征，而苯溴马隆可能引起显著的肝毒性。11,12,13,14,15因此，仍迫切需要开发更安全、适用范围更广且具有机制靶向性的治疗手段，以有效管理地理萎缩（GA）。
在传统中医（TCM）中，痛风性关节炎（GA）属于“历节病”（关节游走性疼痛）、“痛风痹”和“瘀浊痹”等辨证范畴。中医对痛风性关节炎的干预具有多种协同作用，包括抗炎与镇痛作用、调节尿酸代谢、改善微循环以及保护关节功能，因而成为当代研究的重要领域16,17,18,19。Rhizoma Drynariae（骨碎补），来源于水龙骨科多年生蕨类植物Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm.的干燥根茎，临床上常用于治疗痛风性关节炎。Rhizoma Drynariae的生物活性成分主要包括黄酮类、苯丙素类、三萜类、酚酸类及其糖苷类化合物20,21。其中，黄酮类化合物是近年来研究最为广泛的成分类别22,23,24。既往研究表明，黄酮类化合物具有显著的抗炎和抗氧化特性25。
初步研究发现，总黄酮类物质 骨碎补 （TFRD）可有效抑制骨关节炎、类风湿关节炎及其他炎症性关节疾病的炎症反应26,27,28然而，痛风风湿方（TFRD）对抗痛风性关节炎（GA）的潜在作用机制尚未得到充分研究。因此，本研究旨在采用网络药理学、代谢组学与分子生物学实验相结合的综合方法，探索并验证TFRD治疗GA的具体机制及其治疗效果。系统阐明TFRD治疗GA所涉及的多成分、多靶点、多通路作用机制，有望推动新药研发，为GA的临床管理提供创新性选择和切实可行的解决方案。
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本研究经中日友好医院动物伦理委员会审查批准（批准号：zryhyy21-22-08-10），并依照实验室动物伦理护理与使用机构指南进行。
TFRD相关及GA关联靶点的预测与筛选
化学成分 骨碎补 从传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中检索，检索关键词为“骨碎补” 作为搜索词29基于口服生物利用度（OB）≥ 30% 和类药性（DL）≥ 0.18 的标准，对潜在生物活性成分进行筛选。30,31,32从所得化合物库中，根据其化学结构进一步鉴定并筛选出黄酮类成分。这些黄酮类成分在下文中称为总黄酮 骨碎补 （TFRD）被纳入下游分析。从TCMSP数据库中检索与TFRD相关的靶基因后，利用UniProt数据库对其相应的标准化基因符号进行注释。33使用“gout”作为检索词，从GeneCards数据库中获取与疾病相关的靶点，以建立一组候选基因34.
化合物-靶点网络的构建
确定并定义了TFRD相关靶点与GA相关靶点的交集，该交集被视为介导TFRD抗GA作用的关键治疗靶点，并使用维恩图对重叠部分进行可视化展示。此外，利用Cytoscape软件构建并分析了“TFRD-靶点-GA”调控网络35。
蛋白质-蛋白质相互作用网络
将TFRD对抗GA的关键治疗靶点导入在线数据库，以生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，设定最低所需相互作用得分为“高置信度（0.700）”36。使用Cytoscape软件对PPI网络进行优化，并根据度中心性排序选取前30个核心靶点，绘制柱状图37,38。
KEGG通路富集分析
使用 R 软件和 Bioconductor 数据库对这些核心靶点进行 KEGG 通路富集分析38,39. 具有通路的 p值 < P 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。在排除与疾病和代谢相关的通路后，使用 Cytoscape 可视化通路-靶点相互作用网络。在这些通路中，按 P 值升序排列的前 20 条通路以柱状图形式展示。
药物制备
为制备单水合尿酸钠（MSU）晶体悬液，使用分析天平称取500 mg MSU晶体，加入10 mL生理盐水和2 mL吐温-80，边磁力搅拌边加热。随后用生理盐水定容至20 mL，得到浓度为25 mg/mL的悬液。经高压灭菌后，悬液于4 °C保存备用。TFRD的临床常用剂量为70 kg成人每日750 mg，换算为大鼠剂量为每日67.5 mg/kg体重。将TFRD溶于蒸馏水中，配制成6.75 mg/mL的溶液，于4 °C保存备用。根据体表面积归一化法，将临床人用剂量（0.6 mg/60 kg）换算为大鼠等效口服剂量为0.062 mg/kg。将秋水仙碱（阳性药物）溶于蒸馏水中，配制成0.0062 mg/mL的溶液，于4 °C保存备用。
动物
本研究共使用36只六周龄雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠（体重220 ± 10 g）（动物使用许可证号：SCXK [Jing] 2025-0008）。动物饲养于中日友好医院实验动物中心，在温度22–24 °C、湿度50–70%的标准饮食条件下进行饲养。
模型建立与干预
经过一周的适应性饲养后，将大鼠随机分为四组（每组 n = 9）：对照组、模型组、TFRD 组和阳性药物组。随机分组采用随机数字表法进行。数据收集与分析均在盲法条件下进行。所有处理均通过每日一次的灌胃给药。所有干预措施均于每日上午 08:00 以灌胃方式给药，连续给药七天。空白对照组和模型组给予等渗生理盐水（10 mL/kg），TFRD 组和阳性药物组则给予相应药物混悬液，体积相等（10 mL/kg）。在干预的第四天，空白对照组大鼠向关节内注射无菌生理盐水，而模型组、TFRD 组和阳性药物组大鼠则注射单钠尿酸（MSU）晶体混悬液以诱导急性痛风性关节炎。注射前，使用异氟烷麻醉系统对大鼠进行麻醉。模型组、TFRD 组和阳性药物组每只大鼠向左侧踝关节腔内注射 200 µL MSU 混悬液。拔出针头后，用无菌棉签在注射部位轻轻按压数秒，以防止液体渗漏。
样本采集与处理
造模后72小时，将大鼠麻醉并置于仰卧位。腹部消毒后，打开腹腔，轻柔地将肠管移开以暴露腹主动脉。将采血针平行于血管方向插入，采集腹主动脉血液，并立即转移至预先在冰水浴中预冷的肝素抗凝管中。样本于4 °C条件下以3000 × g离心10 min，分离血清，分装后于-80 °C保存，用于后续代谢组学分析。随后通过CO₂窒息法处死动物。剃除左踝关节周围毛发，仔细剥离周围皮肤和肌肉组织，暴露完整的关节结构。滑膜组织呈覆盖于关节囊内壁的薄层白色膜状结构，使用精细镊子从邻近筋膜中轻柔分离。收集的关节组织样本置于4 °C的4%多聚甲醛中固定72 h。随后，部分关节组织置于EDTA脱钙液中进行脱钙处理，每周更换一次脱钙液，持续8 周。通过针刺检测确认脱钙是否完全：若针刺时遇到阻力，则继续脱钙，直至组织可被完全穿透。
脱钙后，踝关节进行矢状面切片，置于包埋盒中，并经过梯度乙醇脱水处理。组织经二甲苯透明化，浸入石蜡并包埋成石蜡块。使用自动切片机切取厚度为6 µm的切片，漂浮于40 °C水浴中，然后贴附于粘附性载玻片上。60 °C烘干30 min后，切片经脱蜡，按标准流程进行苏木精-伊红（H&E）染色，最后用中性树胶封片。全切片图像采用数字切片扫描仪获取。
血清代谢组学分析
模型组和TFRD组的血清样本在处理前于4 °C下解冻。每个样本取100 µL血清转移至微量离心管中，加入400 µL预冷的提取溶剂（甲醇：乙腈，1:1，v/v），其中含有内标。混合物涡旋振荡1分钟，随后在冰水浴中超声处理10分钟。然后在-40 °C下孵育1小时以促进蛋白质沉淀，接着在4 °C下以12,000 × g 离心15分钟。离心后小心收集上清液，转移至自动进样瓶中用于UHPLC–MS分析。此外，将同组内各样本等体积的上清液混合，制备成质量控制（QC）样本。
在对两组血清样本进行代谢物检测后，采用专用软件对原始质谱数据进行处理，以实现自动化的峰检测、提取、对齐和积分，从而生成包含离子谱特征的结构化数据矩阵。将检测到的谱特征与已建立的代谢组学谱图数据库进行比对，以鉴定来自TFRD并进入体循环的代谢物。去除未识别的特征以及含有过多缺失值的特征。经过整理的数据集被重新索引，并整理为标准化格式40。
通过计算倍数变化（FC，表示为组间比值）和统计学显著性（p 值），评估两组间代谢物的差异表达。满足 |log₂FC| ≥ 1 且 P < 0.05 阈值的代谢物被定义为差异表达代谢物（DEMs）。筛选结果通过火山图等方法进行可视化总结。将筛选出的差异代谢物随后导入 PubChem 数据库，以获取其标准化合物标识符（CIDs）41。然后基于 CIDs 获取相应的 KEGG ID。最后，将 KEGG ID 导入代谢组学分析平台，进行代谢通路富集分析，以鉴定与差异表达代谢物显著相关的信号通路。
ELISA
滑膜组织样本在液氮中速冻后研磨成细粉。使用电子精密天平称取约100 mg粉末，加入1 mL预冷的PBS缓冲液，并在冰上用玻璃匀浆器进行匀浆。将匀浆液在4 °C条件下以10,000 × g离心5分钟，收集上清液用于后续ELISA检测。分析前，将ELISA试剂盒平衡至室温30分钟。按照制造商说明书配制所有试剂，包括系列稀释的标准品、洗涤缓冲液、生物素标记抗体工作液和酶结合物溶液。随后，将不同浓度的标准品和样本各100 µL加入已包被的微孔板指定孔中。密封微孔板，在37 °C孵育90分钟。孵育结束后弃去孔内液体，用洗涤液洗板4次。然后每孔加入100 µL生物素化抗体工作液，37 °C孵育60分钟，再次进行洗涤。接着每孔加入100 µL酶结合物工作液，37 °C孵育30分钟，再进行一次洗涤。随后加入显色底物，避光条件下37 °C孵育10分钟。加入100 µL终止液终止反应，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。以标准品的光密度（OD）值对其相应浓度作标准曲线，据此计算样本中目标物质的浓度。
蛋白质印迹（Western blot）
将滑膜组织迅速冷冻后机械研磨成细粉。取定量粉末，加入适量预冷的RIPA裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，体积比1:100），冰上孵育30分钟。随后在4 °C条件下以10,000 × g 离心5分钟，小心收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，并用RIPA缓冲液将所有样品调整至相同浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质，随后转至PVDF膜上。膜经封闭后，依次与一抗（1:1000稀释）和二抗（1:5000稀释）孵育。使用ECL检测试剂系统显影蛋白条带，Image Lab软件（版本5.2.1）分析条带强度，并以β-actin作为内参进行归一化处理，计算相对表达水平。
统计学分析
采用 SPSS 软件（版本 20.0）进行统计学分析。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。当满足方差齐性假设时，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后使用 LSD 检验进行事后两两比较。若不满足方差齐性，则采用 Welch 方差分析，随后使用 Dunnett's T3 检验进行多重比较。 以 p 值 < 0.05 为差异具有统计学意义。
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TFRD 的关键组分
从 TCMSP 数据库中检索到Rhizoma Drynariae的潜在生物活性成分，共获得 71 个候选成分。随后根据口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18）对这 71 个活性成分进行筛选，最终确定 18 个化合物。进一步分析发现，其中 10 个活性化合物为黄酮类，包括：(2R)-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)色原酮-4-酮、金合欢素（Aureusidin）、柚皮素（Eriodyctiol, flavanone）、山奈酚（kaempferol）、柚皮苷元（naringenin）、(+)-儿茶素（(+)-catechin）、圣草酚（eriodictyol）、木犀草素（luteolin）、davallioside A_qt、黄根醇（xanthogalenol）。其化学信息详见表 1。
复方黄柏液治疗痛风性关节炎的“成分-靶点”调控网络
从TCMSP数据库中检索到复方黄柏液中关键成分的潜在基因靶点，共获...
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痛风性关节炎（GA）是一种常见的炎症性关节病。目前临床治疗主要依赖非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素以及降尿酸药物42。然而，这些药物联合使用会对患者产生多种不良反应，并对肝脏和肾脏造成显著的代谢负担43，对于已有肝肾功能损害的患者尤为不利。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的多酚类物质，因其具有抗氧化、抗炎及其他药理活性而受到广泛关注。在安全剂量范围内，这类化合物极少引发副作用，也不会加重肝肾负担。Rhizoma Drynariae来源的天然黄酮提取物TFRD，也因其疗效和安全性逐渐获得认可44。本研究结合网络药理学、代谢组学和分子生物学方法，系统探讨了TFRD治疗GA的作用机制与疗效。网络分析表明，TFRD通过调控多种炎症相关通路发挥治疗作用，而代谢组学结果显示其可影响类固醇激素的生物合成通路。体内实验进一步证实，TFRD显著改善踝关节病理变化，下调炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-17A）的表达，并抑制滑膜组织中关键信号蛋白（AKT、MAPK ...
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作者声明本研究工作中不存在利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| 5X 蛋白上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| AKT 抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 抗体稀释液 | 碧云天生物技术 | P0268 | |
| Bioconductor 数据库 | https://www.bioconductor.org/ | ||
| 秋水仙碱 | 上海源叶生物科技有限公司 | ||
| GeneCards 数据库 | https://www.genecards.org/ | ||
| 苏木精-伊红（H&E）染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | |
| MetaboAnalyst 6.0 在线平台 | https://www.metaboanalyst.ca/ | ||
| 小鼠 IL-17A ELISA 试剂盒 | 4a Biotech Co Ltd | CME0041 | |
| 小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒 | 4a Biotech Co Ltd | CME0006 | |
| 小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 | 4a Biotech Co Ltd | CME0004 | |
| NF-κB p65 抗体 | Cell Signaling Technology | 8242T | |
| 脱脂奶粉 | Solarbio | D8340 | |
| p38 MAPK 抗体 | Abclonal | A14401 | |
| 磷酸酶抑制剂混合液 | 碧云天生物技术 | P1081 | |
| 磷酸化-AKT（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 磷酸化-NF-κB p65 抗体 | Cell Signaling Technology | 3031S | |
| 磷酸化-p38 MAPK 抗体 | Abclonal | AP0526 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Solarbio | R0010 | |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| PubChem 数据库 | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| R 软件 | www.r project.org/ | ||
| RIPA 裂解缓冲液 | Solarbio | R0010 | |
| 无 RNase 水 | Ambion | AM9937 | |
| SD 大鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | ||
| SDS-PAGE 电泳缓冲液 | Servicebio | G2144 | |
| STRING 数据库 | https://string-db.org/ | ||
| TBST 缓冲液（10X） | Solarbio | T1085 | |
| TCMSP | https://old.tcmsp-e.com | ||
| Tris-甘氨酸转移缓冲液 | Servicebio | G2017 | |
| TFRD | 北京岐黄药业有限公司 | ||
| UniProt 数据库 | https://www.uniprot.org/ | ||
| β-肌动蛋白抗体 | 中杉金桥生物技术 | TA-09 |
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