本研究介绍了一种基于明胶的喂食方法，可实现对成年斑马鱼进行精确、无创且基于体重的口服药物递送。该方案展示了可靠的摄食接受性，并以MK-801的成功递送作为原理验证，产生了预期的行为学效应。
本文内容
摘要
摘要
传统的鱼类给药方法（如烧杯投药、腹腔注射或经口灌胃）耗时、不够精确和/或造成浪费。由于这些方法对动物具有应激性，因此不适用于需要重复或长期给药的实验，也不适用于对操作相关干扰因素敏感的行为学实验，从而限制了鱼类模型在生物医学研究中的应用价值。为克服这些障碍，研究人员开发了一种基于明胶的喂食方法，可实现对鱼类快速、精确的给药，同时将干扰降至最低。该方法包括制备个体化的小块饲料，其成分为明胶、卤虫提取物、螺旋藻以及目标药物。明胶具有热塑性，使得单次均质混合物可被加热液化，根据个体体重精确分装后，再重新固化为定制化的小块饲料。作为原理验证，将NMDA受体拮抗剂MK-801（4 mg kg⁻1）在新型水箱实验前给予成年斑马鱼，结果观察到与焦虑样行为减轻一致的行为学效应。该方法非常适合行为药理学研究，并可轻松推广至其他水生模式生物。
引言
斑马鱼（Danio rerio）在生物医学研究中被广泛用于研究发育、生理、行为和药理学1,2,3。然而，斑马鱼在药理学研究中的应用，特别是在成年个体中，受限于缺乏既精确又对生物体干扰最小的药物递送方法4。
斑马鱼中常用的药物给药技术，如烧杯浸泡给药、腹腔注射和经口灌胃，各自存在显著缺陷。通过烧杯进行全身浸入式暴露给药，对药物吸收的控制能力有限，导致大量化合物浪费，并因吸收速率和化合物稳定性差异而引入实验变异性5,6,7。基于注射的方法和经口灌胃可实现更精确的剂量控制，但需要麻醉、固定和反复操作，这些因素均可能诱发应激反应，同时增加损伤或缺氧的风险，进而干扰行为学和生理学指标的测定8,9,10。这些局限性在涉及重复给药或长期药物干预的实验中尤为突出。
为应对这些挑战，研究人员开发了一种基于明胶的喂养方法，可实现对斑马鱼快速、精确且非侵入性的药物递送11。该方法可将药理学化合物掺入由明胶、卤虫提取物和螺旋藻制成的微小且个体化定制的饲料颗粒中。基于饲料的药物递送是一种非侵入性替代方案，符合伦理动物研究中“3R原则”（替代、减少和优化）的要求。尽管先前的研究已证明基于饲料的药物递送在成年斑马鱼中的可行性12,13,14，但现有方法依赖于成分不均一的饲料基质或固定体积的饲料，无法考虑个体间体重差异。本文所述方法通过实现基于体重的剂量校准，克服了这些局限性。
本方案详细描述了基于明胶的饲料制备及其在成年斑马鱼中的给药步骤。尽管本方法以行为学实验（新颖水箱实验）为例进行演示，但其广泛适用于斑马鱼生物学的其他研究领域，并有望适用于其他水生模式生物。该方案为研究人员提供了一种实用的解决方案，可用于在斑马鱼中实现高效、可重复且低应激的药物递送，尤其适用于需要精确、重复和/或长期药理学干预的研究。
方案
本研究使用了成年雄性和雌性 AB 和 TL 系斑马鱼（4–12 月龄）。所有动物均在韦恩州立大学繁殖并饲养。所有实验程序均经机构动物护理和使用委员会批准，符合韦恩州立大学的指导方针。斑马鱼饲养于高密度鱼架系统中，环境条件为标准条件（温度 27.5 ± 0.5 °C，水体电导率 500 µS ± 10 µS，pH） 7.5 ± 0.2，使用14 h:10 h 光照：黑暗循环（光照开启时间 08:00） h）鱼类每天喂食两次，早上投喂干饲料，下午投喂 freshly hatched brine shrimp。所用试剂和设备列于下文 材料表.
1. 鱼类称重与饲料体积计算
- 取一个 100 mL 玻璃烧杯，加入约 50 mL 系统用水，置于电子天平上，将天平归零。
- 使用细网捞网从养殖缸中轻轻捞出一条鱼，并将网在干燥的纸巾上轻触，以去除多余水分。
- 小心地将鱼转移到烧杯中，确保无水溅出到天平上。
- 记录鱼的重量，并根据每条鱼体重的 1% 体积/体重（V/BW）计算所需的投喂体积。
2. 卤虫提取物的制备
- 将卤虫虾粉悬浮于蒸馏水中，终浓度为 250 mg/mL。室温下搅拌 1 小时。在室温下以 12,500 × g 离心 10 分钟，保留上清液。
- 重复离心一次，再次收集上清液。
- 将卤虫提取物于 −20 °C 保存，可保存长达 6 个月。
3. 明胶饲料的制备
- 在制备前将卤虫虾提取物解冻，并计算明胶（12% w/v）、螺旋藻（4% w/v）以及（如适用）所需药理学化合物在目标体积的明胶饲料中的目标质量。
- 将螺旋藻和明胶粉末（猪源性；Bloom ≈ 300 g）分别称取至不同的1.5 mL微量离心管中，并记录每管中的实际质量。确保所测质量等于或高于目标最终体积所需的质量。
- 向含有螺旋藻的离心管中加入适当体积的卤虫虾提取物、药物化合物和水，使最终浓度达到4% w/v螺旋藻和80 mg/mL卤虫虾提取物。
- 充分涡旋混匀。将上一步所得混合物的所需体积转移至含明胶的离心管中，使明胶的最终浓度为12% w/v。
- 将离心管置于预热至45 °C的加热块上5分钟，期间间歇性涡旋，直至明胶完全溶解。若溶解不完全，可使用无菌的木质或金属搅拌棒轻轻搅拌以促进均质化。
- 将完全均质的混合物分装（每管最多100 µL）至标记好的1.5 mL微量离心管中。
- 将分装样品在−20 °C下保存过夜，以确保完全凝固，便于后续饲喂时操作。
4. 单个饲料颗粒的形成
- 在喂食前，将分装的明胶混合物重新加热至 45 °C，直至完全液化。
- 充分涡旋振荡液化的明胶混合物。
- 用移液器吸取相当于鱼体质量 1% 的体积，滴加到一张石蜡膜上，制成单个食物小块（图 1）。
注意：为便于操作和储存，可在分装前将石蜡膜放入培养皿中，使石蜡膜保持平整，从而更易于将制备好的食物小块转移至 −20 °C 保存。 - 将食物小块置于 −20 °C 下至少 20 分钟，使其重新凝固。
- 喂食前将食物小块保持在冰上。
5. 明胶饲料给药
- 将鱼类从饲养架转移到行为观察室，并让其适应环境1小时。
- 在喂食前，使用透明隔板将每条鱼在水族箱中暂时隔离2–5分钟。
- 使用镊子将相当于鱼体体重1%的个体化明胶饲料块放置于每条隔离鱼前方的水面上。
- 观察每条鱼，确认其在5分钟内完全摄食整个饲料块。
- 鱼类摄食完毕后，移除隔板，将鱼返回其原饲养缸，或继续进行实验操作。
注：饲料制备方法及目标剂量与实际剂量计算的示例详见补充文件1，示例数值同时列于表1中。
结果
明胶饲料的适口性
为了评估饲料的适口性，成年AB品系和TL品系斑马鱼在连续五天内以明胶基饲料替代早晨的常规饲料进行喂养（图2）。所有TL品系斑马鱼在首次接触时均在5分钟内摄食完毕，而AB品系斑马鱼则需要多次接触，在经过连续四天的适应后，16条个体中有15条能够持续摄食该饲料（图2A）。采用三因素方差分析（品系 × 性别 × 天数）对摄食时间进行分析，结果显示品系（F₁,₁₂₅ = 19.4，P < 0.0001）和天数（F₄,₁₂₅ = 5.80，P < 0.001）存在显著的主效应，但性别无显著主效应（F₁,₁₂₅ = 0.24，P = 0.63）。品系与天数之间（F₄,₁₂₅ = 3.35，P = 0.012），以及品系、天数与性别三者之间（F₄,₁₂₅ = 2.55，P = 0.04）均存在显著交互作用。两种性别的TL品系斑马鱼从首次暴露即快速摄食（4–20秒），而AB品系斑马鱼初始摄食时间较长（7–144秒），但随天数增加而逐渐缩短（图2B）。到第四和第五天时，除了一条AB品系雄鱼外，所有鱼均在10秒内完成摄食。根据先前报道，经过2–3天的适应后，约95%的斑马鱼在饲料呈现后30秒内完成摄食15,16。
通过明胶饲料给予MK-801的行为学效应
为验证基于明胶的药物递送方法的有效性，本研究采用明胶饲料给予MK-801（一种N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂），并以斑马鱼在新环境鱼缸探索过程中的底部距离作为行为学指标。已知MK-801可改变成年斑马鱼的运动能力以及类似焦虑或避捕食者行为17。AB品系成年斑马鱼在实验前连续两天接受不含药物的明胶颗粒喂养，以适应喂食程序，确保其熟悉并稳定摄食。第三天，处理组斑马鱼接受单次剂量MK-801（4 mg kg⁻1）混入明胶饲料中给予；对照组斑马鱼则仅接受含溶剂（水）的相同明胶颗粒。在新环境鱼缸行为测试前30分钟进行喂食给药。
类似焦虑或回避捕食者的行为（以距底部距离衡量）采用双因素方差分析（性别 × 药物）进行分析，结果显示MK-801具有显著的主效应 (图3)（F₁,₆₉ = 24.5，P < 0.001）。药物处理组的鱼在水箱上层停留的时间更长，这一模式通常被解释为焦虑样行为或避捕食行为减少。性别无主效应（F1,69=2.52，P=0.12）或药物与性别的交互作用（F1,69=1.0，P=0.32）。经FDR校正的成对t检验证实，MK-801在雌性（P = 0.0076）和雄性（P = 0.023）中均增加了底部距离。
综上所述，这些研究结果表明，基于明胶的饲料能够有效实现药理学化合物的口服递送，在新环境鱼缸实验中产生预期的药物诱导的底栖行为改变。
图1： 明胶饲料的制备。 将明胶饲料用移液器滴加到石蜡膜上，制成个体化小块，每块相当于体重的1%，然后在−20 °C下固化。该图已根据Ochocki等人的研究进行了修改11。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：成年斑马鱼对明胶基饲料的摄食情况。（A）AB 和 TL 品系两性斑马鱼在给料后5分钟内摄食的百分比。（B）AB 和 TL 品系按性别划分的摄食时间。未摄食的个体未纳入摄食时间分析。数据以均值 ± 标准误表示；n = 每品系每性别8条鱼。该图改编自 Ochocki 等人11。请点击此处查看此图的放大版本。
图3： NMDA受体拮抗剂给药对行为的影响。 在成年AB系斑马鱼（两性）进行新水箱实验前30分钟，给予MK-801（4 mg/kg）。以鱼体距水箱底部的距离作为类焦虑/避捕食者行为的指标。数据以箱须图表示，其中中位数为箱内中线，四分位距为箱体范围，±1.5倍四分位距为须部范围。*P < 0.05，基于错误发现率校正的成对t检验。样本量：雌性溶剂对照组，n = 20；雌性MK-801组，n = 19；雄性溶剂对照组，n = 19；雄性MK-801组，n = 15。有五只动物因未摄食明胶饲料而被排除在分析之外。本图改编自Ochocki等人的研究11。 请点击此处查看该图的高清版本。
| 组分 | 储存浓度 | 目标浓度 | 目标质量/体积 | 实际质量/体积 |
| 明胶 | - | 12% (w/v) | 60 mg | 62 mg |
| 螺旋藻 | - | 4% (w/v) | 20 mg | 25 mg |
| 卤虫提取物 | 250 mg/mL | 80 mg/mL | 160 µL | 200 µL |
| 药物 | 10 mg/mL | 0.4 mg/µL（按1%体重计，4 mg/kg） | 20 µL | 25 µL |
| 水 | - | - | 320 µL | 400 µL |
| 液体饲料总体积 | - | - | 500 µL | 625 µL |
| T成品饲料总体积 | - | - | 500 µL | 516.7 µL |
表1：明胶饲料制备示例。 储备液浓度、目标值以及用于制备明胶饲料的假设实际质量或体积，以实现每千克体重4 mg的药物递送剂量，给药量为体重的1%。
补充文件1：多种鱼类明胶饲料的制备示例。本示例详细演示了含药物饲料的配制方法，以及根据个体体重计算个性化给药体积的计算过程。请点击此处下载该文件。
讨论
本文介绍的明胶喂养方法克服了斑马鱼常用药物递送方式的关键局限性，能够实现个体化、基于体重的给药，同时最大限度减少操作。该方法提高了实验的精确性和可重复性。明胶具有热塑性，可将单一均匀制剂加热液化后精确分装，并重新固化为个体化的食物小块，在确保药物分布均匀的同时，适应个体间体型差异。此外，通过明胶饲料进行口服给药可避免注射方法带来的应激反应和潜在损伤，符合3R原则框架下的重要优化4。
该方法的优势取决于操作的准确性。成功实施需注意多个实验因素。精确测量个体体重至关重要，因为即使在年龄、性别和品系匹配的斑马鱼群体中，个体间体型也可能存在显著差异，体重差异可达近三倍11,18,19。同时，将化合物在明胶基质中充分均质化也极为重要，以确保各饲料部分的给药剂量一致。最后，在给药前使斑马鱼适应明胶饲料可减少拒食现象；建议通过视觉确认饲料已被摄食，以保证剂量准确递送。
然而，即使操作得当，基于饲料的药物递送仍存在一些实际挑战。一个潜在问题是饲料颗粒成型不当，导致其入水后迅速解体。这通常是由于制备过程中温度控制和/或混合不充分、加热时间过长，或饲料储备品经历多次冻融循环所致。为避免此问题，应通过适当的加热和混合确保明胶完全溶解，并将制备好的饲料分装为单次使用的小份，仅解冻一次并立即使用。对于敏感性制剂，建议额外制备一份饲料颗粒，将其加入烧杯水中以确认其能够正常成型，再开始正式实验。对于降低饲料适口性的化合物，可通过添加诱食剂（如蛤汁12˒13或市售鱼类诱食剂20）来提高摄食接受度。在本研究中，使用卤虫提取物以增强适口性，效果显著。此外，也可通过给予多次较小剂量的方式，在保证累计暴露量的同时提高摄食量。除上述实际因素外，基于饲料的递送方式还存在固有的药代动力学局限性。与所有口服递送方法一样，胃肠道吸收可能导致生物利用度较注射途径延迟或降低，且化合物在饲料基质中的稳定性可能有所差异。
尽管经过适应，仍可能有少量动物不摄食明胶饲料，这些动物应排除在分析之外，因其可能未接受预期的药物剂量。拒食率通常在2.4%–6.4%之间15,16，因此并不构成主要的方法学障碍。摄食量也可能因品系而异。这种品系效应与先前报道一致，表明遗传背景可影响接近食物的潜伏期20。在实验设计时应考虑这些因素。建议同时报告摄食依从性与品系信息，以提高实验的透明度和可重复性。
本研究的另一个重要局限性在于，该方案仅在成年斑马鱼中开发和验证，因此不能直接应用于幼体阶段。该方法依赖于基于个体体重的给药方式以及对离散明胶颗粒的摄食。这在成年个体中是可行的，但在幼体中则不切实际，原因在于幼体口裂较小、采用悬浮摄食行为，且难以获得可靠的个体体重测量数据。因此，若要将该方法应用于幼体，需要进行重大修改。这些修改可能包括微尺度颗粒的开发以及替代性的递送策略。
与先前描述的饲料给药方法相比，该方法具有更高的给药准确性和操作便捷性。商用明胶饲料需对非均质材料进行分装，限制了剂量的精确性12，而其他方法则向所有动物施用相同剂量，并假设其体重完全一致14,21。通过实现个体化给药，本文所述的明胶喂养方法可避免给药不足或过量，提高实验控制的精确性；同时使成年斑马鱼的药物给药方式与通常基于体重给药的啮齿类动物最佳实践保持一致。该方法也适用于需要精确、重复药理干预的研究，因其引起的应激反应极小，涵盖行为神经科学、神经药理学和衰老研究等应用领域。对于与麻醉剂存在相互作用或在水环境中稳定性较差的化合物，该方法同样具有优势。尽管本研究在成年斑马鱼中进行验证，但该方法可轻松适用于其他水生模式生物。总体而言，该技术提升了给药精度、动物福利和方法学灵活性，进一步拓展了鱼类模型在生物医学研究中的应用价值。
披露
本方案基于此前发表于《实验生物学杂志》的研究工作，Ochocki AJ, Kenney JW, 202311。本文提供了更为详细和扩展的方法学指导，以确保可重复性。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R35GM142566）资助给 J.W.K.。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 氢马来酸盐粉末 | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| 猪皮明胶粉末 | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | 凝胶强度约 300 克勃鲁姆（Bloom），A 型，生物试剂 |
| 微细干燥卤虫卵 | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | 细度 < 400 微米 |
| 螺旋藻粉末 | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% 纯度的蓝绿藻 |
参考文献
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Evolutionary conservation translational relevance and cognitive function the future of zebrafish in behavioral neuroscience. Neurosci Biobehav Rev. 116, 426-435 (2020).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. J Exp Biol. 220 (17), 3007-3016 (2017).
- Levin, E. D., Limpuangthip, J., Rachakonda, T., Peterson, M. Timing of nicotine effects on learning in zebrafish. Psychopharmacology (Berl). 184 (3-4), 547-552 (2006).
- Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J Comp Neurol. 518 (6), 800-814 (2010).
- Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 220 (2), 331-337 (2011).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. Streptococcus zebrafish model of bacterial pathogenesis. Infect Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126 (2010).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), e50691 (2013).
- Ochocki, A. J., Kenney, J. W. A gelatin-based feed for precise and non-invasive drug delivery to adult zebrafish. J Exp Biol. 226 (2), jeb245186 (2023).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish. Lab Anim Sci Prof. 32, 35 (2014).
- Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. 40 (10), 1473-1485 (2017).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Atiratana, T., Goldson, A. R., Samosorn, S., Rajput, N., Praphairaksit, N., et al. The effects of Arabian jasmine on zebrafish behavior depends on strain sex and personality. PLoS One. 20 (9), e0332642 (2025).
- Beigloo, F., Davidson, C. J., Gjonaj, J., Perrine, S. A., Kenney, J. W. Individual differences in the boldness of female zebrafish are associated with alterations in serotonin function. bioRxiv. , (2024).
- Benvenutti, R., Gallas-Lopes, M., Marcon, M., Reschke, C. R., Herrmann, A. P., et al. Glutamate NMDA receptor antagonists with relevance to schizophrenia a review of zebrafish behavioral studies. Curr Neuropharmacol. 20 (3), 494-509 (2022).
- Fowler, L. A., Williams, M. B., Dennis-Cornelius, L. N., Farmer, S., Barry, R. J., et al. Influence of commercial and laboratory diets on growth body composition and reproduction in the zebrafish Danio rerio. Zebrafish. 16 (6), 508-521 (2019).
- Siccardi, A. J., Garris, H. W., Jones, W. T., Moseley, D. B., D’Abramo, L. R., et al. Growth and survival of zebrafish Danio rerio fed different commercial and laboratory diets. Zebrafish. 6 (3), 275-280 (2009).
- Oswald, M., Robison, B. D. Strain-specific alteration of zebrafish feeding behavior in response to aversive stimuli. Can J Zool. 86 (10), 1085-1094 (2008).
- Lu, Y., Patton, E. E. Long-term non-invasive drug treatments in adult zebrafish that lead to melanoma drug resistance. Dis Model Mech. 15 (5), dmm049401 (2022).
重印与许可
