选择性切断肠自主神经的小鼠模型

摘要

本方案旨在利用肠系膜上动脉作为稳定的解剖学标志，对支配小肠的交感神经和副交感神经在小鼠体内进行精确、选择性的横断，从而建立一种聚焦且可重复的研究肠道生理与疾病自主神经调控的模型。

摘要

自主神经包括交感神经和副交感神经系统，二者通常以相互拮抗的方式调节多种生理功能。随着人们对自主神经支配在肠道生理与病理过程中作用的兴趣日益增加，迫切需要能够精确操控肠道交感和副交感神经输入的实验模型。本文介绍了一种选择性切断支配肠道的交感神经和副交感神经的手术方案。该方法以肠系膜上动脉（SMA）作为可重复的解剖标志，可可靠地识别支配肠道的自主神经束，并实现靶向性切断。与神经节切除或膈下迷走神经切断等更广泛的去神经方法相比，该技术旨在实现对肠道支配性自主神经束更局限的解剖学切断，有助于减少对肠道外组织的干扰。该手术造成的损伤可控，通常出血极少，有利于操作的一致性和术后恢复。尽管该手术需要具备适当的显微外科训练背景，但本方案具有可调整性，使用者可根据特定实验目的对关键参数进行优化。重要的是，该模型为研究交感神经和副交感神经在生理及疾病状态下调控肠道功能的作用提供了一个实用的研究平台。本文旨在详细描述该操作流程，以促进新用户在研究中采用该技术。

引言

胃肠道持续受到自主神经系统（ANS）的调控，其中交感神经和副交感神经通路协调肠道生理学的基本方面，包括运动性、分泌功能、上皮屏障功能以及免疫稳态^1,2。在结肠中，外在的交感神经输入可在多个细胞区室中产生区域依赖性效应，表明广泛的ANS干扰可能掩盖特定部位的肠道表型¹。相反，副交感神经回路传统上由迷走神经信号及下游胆碱能机制介导，现越来越被认为在维持肠道免疫平衡和调控黏膜反应中起关键作用，这进一步推动了需要以解剖学精度区分交感与副交感神经贡献的实验策略²。

除了生理调节外，自主神经活动已被证实是肠道疾病生物学的重要调节因素，包括结直肠癌（CRC）。近期关于CRC的研究揭示了一种双向的交感神经-间充质程序，其中β2-肾上腺素能信号通路与表达神经生长因子（NGF）的癌症相关成纤维细胞相互强化，促进神经-基质相互作用并推动肿瘤进展，为交感神经回路可与CRC发病机制功能耦合提供了直接证据³。与此同时，胆碱能信号也被发现与CRC的生长及肿瘤相关的免疫特征相关；在原位小鼠模型中通过毒蕈碱受体3的药理学抑制，以及将胆碱能信号与免疫检查点表达和其他恶性特征相联系的研究均证实了这一点^4,5。重要的是，自主神经对肠道疾病的影响还可能与其他调节因素相互交汇，例如心理应激和肠道微生物群。肠神经系统可将应激信号传递至肠道炎症过程⁶，而微生物信号亦可激活肠-脑回路，进而调节肠外在的交感神经元，共同支持一种多因素框架，即神经调控与免疫反应及微生物生态相互交织^6,7。

这些汇聚的证据突显了对实验方法的需求，这些方法能够以足够的解剖学精度分离出针对肠道的自主神经效应，从而在生理和病理条件下支持因果推断。尽管在神经环路定位和神经调节技术方面已取得快速进展，但许多常用干预手段在器官特异性方面仍存在局限。全身性药物干预、化学性交感神经切除以及膈下迷走神经切断术可能影响广泛的自主神经输出，从而改变肠道以外的免疫和代谢设定点，使结肠特异性神经输入的因果归因变得复杂⁸。例如，迷走神经环路可抑制炎症性细胞因子的产生⁹，而迷走神经刺激可调节胰腺内分泌功能及β细胞动态，表明上游或非选择性干预可能引入肠外效应，干扰对肠道表型的解释¹⁰。这些局限性对于旨在分离生理和病理状态下结肠限制性自主神经机制的研究尤为关键。因此，本方法的总体目标是实现小鼠体内针对肠道的交感和副交感神经纤维的解剖学引导下选择性切断，提供一种实用模型，以在减少脱靶效应的前提下探究肠道自主神经调控机制。

综上所述，本方案报道了一种更为精确的小鼠肠道自主神经去神经方法，该方法对其他腹腔器官的自主神经支配影响最小，从而减少了肠外器官效应可能带来的偏倚，提高了结果的可解释性。

方案

所有动物实验均经首都医科大学北京友谊医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（编号：24-2026）。本研究使用成年雄性野生型 C57BL/6J 小鼠（8–10 周龄，20–30 g）。试剂与仪器的详细信息见材料表。

纳入标准：同一实验中使用相同品系、性别和年龄范围的小鼠，以尽量减少生物学变异。仅纳入在适应期表现出正常活动、理毛行为、摄食和饮水以及排便情况的健康动物。此外，小鼠在手术前需在动物饲养设施中适应至少7天。

排除标准：若小鼠在手术过程中出现无法控制的出血或主要血管损伤、肠穿孔，或存在与存活不相容的显著组织损伤，则予以排除。若动物未能从麻醉中恢复，定义为术后2小时内未恢复自主活动能力，亦予以排除。其他排除标准包括术后并发症，如持续性伤口裂开、严重感染，或在48小时内体重减轻超过15%，或在任何连续72小时期间体重减轻超过20%。若通过事后组织学评估证实神经分支存在手术误判的小鼠，亦从研究中排除。

1. 术前准备

1. 对所有外科手术器械进行灭菌。
2. 手术前30分钟对所有小鼠给予预防性镇痛，以避免疼痛敏感化。给予美洛昔康（5 mg/kg体重） 通过 皮下注射
3. 将加热垫预热至37 °C 并将其置于手术平台下方。
4. 用75%乙醇喷洒手术区域（包括麻醉诱导舱），并用纸巾彻底擦拭。在诱导舱底部放置足够的纸巾。
5. 检查麻醉诱导室和管路，确认无泄漏。补充并确保异氟烷供应充足。使用1 L/min氧气输送3%–3.5%异氟烷进行麻醉诱导。持续监测小鼠，通常在1–2分钟内达到手术麻醉深度。
6. 将小鼠置于仰卧位，四肢充分伸展，并用低致敏性胶带固定。安装并固定鼻罩。将异氟烷浓度降低至1.5%–2.5%以维持麻醉。通过脚底回缩反射消失（趾部夹捏无反应）和规律呼吸（55–65次/分钟）评估麻醉深度。
   注意： 在长时间的显微外科手术过程中，除了初始手术平面外，还需持续监测麻醉深度。除了每5–10分钟评估一次足底回缩反射和呼吸频率外，我们还监测呼吸模式（如节律性和深度）以及心率。 通过 视觉观察或接触胸壁。还需定期检查黏膜颜色（通过足部或嘴唇评估），以确保充分供氧。若小鼠出现麻醉变浅的任何迹象，例如呼吸频率增加（>80次/分钟）、出现自发运动或足底反射恢复时，以0.25%–0.5%为增量逐步提高异氟烷浓度，直至恢复适当的手术麻醉深度。相反，若呼吸变得浅慢或不规则，或心率显著下降，则降低异氟烷浓度0.25%–0.5%，直至心肺功能稳定。通过这种动态调节，可确保小鼠在整个手术过程中维持适当的麻醉深度，同时尽量减少对心肺功能的抑制。
7. 在双眼涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥和损伤。
8. 使用电动剃须刀将腹部从耻骨联合水平至肋缘下方区域的毛发剃除。然后，将手术平台置于体视显微镜下。
9. 使用聚维酮碘棉签以向外同心圆方式（从中心向外围）消毒手术区域，范围包括剑突下方至耻骨联合以及两侧 flank 区域。重复3次。随后以同样方式用70%乙醇擦拭。确保术区无任何松散毛发。
10. 佩戴外科口罩和一次性帽子，穿上无菌手术衣，并戴上无菌手套。
11. 用无菌带孔洞手术巾覆盖小鼠，将孔洞位置调整至约2 × 3 cm，并与腹部正中线对齐，以充分暴露手术视野。固定铺巾的四个角。

2. 剖腹术与暴露

1. 使用无菌镊子轻轻提起耻骨联合 cranial 侧的一小褶皮肤。用无菌尖头剪刀在褶皱顶端做一小的初始切口（约 0.3 cm），然后沿中线向 cranial 方向延伸皮肤切口 1.5–2.0 cm。
   注意：将尖头剪刀插入初始切口后，应将剪刀尖端向上倾斜，并沿皮肤下表面进行可控的“推剪”，以避免切得过深而损伤腹壁肌肉或内脏。使用镊子和剪刀钝性分离皮下疏松结缔组织与下方腹壁肌肉组织。分离范围应略宽于皮肤切口，以便后续充分暴露。
2. 在剑突下方约 0.5 cm 处，小心将无菌精细镊子的尖端插入白线（linea alba），并提起一小片组织形成帐篷状。
3. 使用无菌尖头剪刀，在提起的部位制造一个 2–3 mm 的小开口。此时应可见光滑的腹膜和/或其下方的器官（例如肝叶）。
4. 将无菌钝头剪刀的一侧刀片插入腹膜腔，保持其紧贴腹壁。在直视下，沿白线向 cranial 方向延长切口，直至总长度与皮肤切口一致。
   注意：整个过程中应始终保持剪刀尖端向上倾斜，并仅在直视下操作，以确保剪刀下方无肠袢或血管。

3. 肠系膜上动脉的识别与神经切断

1. 使用无菌胶带条轻轻向外侧牵拉腹壁，以暴露腹腔。
2. 用棉签对腹壁施加适度压力，使肠管外露。轻柔地将小肠、结肠和盲肠移至小鼠左侧。
   注意：用无菌棉垫或纱布覆盖暴露的肠管，纱布需用温热（≈37 °C）无菌生理盐水，以防止组织干燥和热量散失。
3. 用右手轻轻移开胃、十二指肠和结肠 整块 向左上腹 quadrant 用无菌湿润的棉签（或钝头显微镊）轻轻拨动。此时脊柱前方的腹主动脉应清晰可见，有时部分被少量后腹膜脂肪覆盖。
4. 识别左肾静脉和腹腔干。肠系膜上动脉（SMA）作为单一动脉分支起源于腹主动脉前壁，通常位于腹腔干下方约2–4 mm处，且在左肾静脉水平或略高于该水平。
   注意：左肾静脉是一条粗大的深色静脉，水平走行于腹主动脉前方，随后汇入下腔静脉。腹腔干通常是从腹主动脉前壁发出的第一条主要动脉分支，位于左肾静脉头侧（上方），常分为肝动脉、脾动脉和左胃动脉三支。相比之下，肠系膜上动脉为单一主干，无肝支或脾支，进入肠系膜根部后供应空肠、回肠及近端结肠；沿其走向追踪至肠系膜内有助于确认正确辨认。
5. 以肠系膜上动脉（SMA）为参照，辨认与之平行走行的乳白色索状束为待处理的神经纤维。位于SMA上方的神经束为副交感神经纤维，而位于SMA下方的神经束为交感神经纤维（图1A).
6. 使用显微镊子和显微剪刀，极其轻柔地分离围绕肠系膜上动脉（SMA）的脂肪和淋巴组织，以充分暴露神经纤维。用显微镊子轻轻提起交感或副交感神经束，使其与SMA分离，然后迅速而小心地将其切断。图1).
   注意： 解剖过程中，应使镊子和剪刀的尖端朝向动脉的侧壁，避免将器械垂直插入深层组织。若发生大出血（例如肠系膜上动脉或腹主动脉出血，且在使用无菌棉签加压后30秒内无法控制），应立即终止手术。动物在麻醉状态下实施人道安乐死，并排除于所有后续分析之外。该终点已根据IACUC批准的人道终点预先定义，以防止不必要的痛苦。文中还提供了针对常见术中并发症的额外故障排除指导 补充文件 1.

4. 腹腔的关闭

1. 取出腹腔内所有纱布/棉垫。仔细检查腹腔内是否有活动性出血，特别注意肠系膜上动脉（SMA）分离区域、神经切断部位以及腹壁切口边缘。
2. 用少量温热无菌生理盐水（0.5–1.0 mL）轻轻冲洗腹膜腔，然后使用无菌干燥棉签小心吸除多余液体。
3. 进行器械及纱布/棉签清点，确保腹腔内未遗留任何异物。
4. 使用6-0可吸收缝线，从切口一端开始，连续缝合腹膜层和肌肉层。每一针均须包含切口两侧的腹膜及腹壁肌层。
   注意：用镊子提起切口边缘，在直视下进针，避免缝到下方的肠管或大网膜。必要时可用湿润棉签轻轻将肠管推离切口区域。
5. 使用5-0编织不可吸收丝线间断缝合皮肤。缝线间距约为2 mm，打结时施加适中张力，使皮肤边缘对合良好（但不造成绞窄），以防缺血。
   注意：切口对合不良可能导致切口疝。应确保肌层严密闭合，皮肤边缘良好对齐。
6. 再次用聚维酮碘棉签轻轻清洁已闭合的皮肤切口。
7. 在小鼠耳部或尾部标记手术日期。
8. 移除鼻罩，将小鼠转移至置于37 °C加热垫上的清洁柔软恢复笼中（单只饲养）。保持动物侧卧位，以降低误吸风险。
   注意：确认加热垫温度稳定在37 °C，以防低体温。必要时可皮下注射1 mL温热无菌生理盐水以维持体液容量。
9. 持续监测小鼠，直至其完全恢复意识并能自主维持俯卧体位。
   注意：术后镇痛采用美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射，每24小时一次，最多持续48小时），若观察到持续性疼痛或不适症状，需进一步进行兽医评估。

5. 术后监测参数

注意：术后前72小时每天监测两次，之后在整个研究期间每天监测一次。评估的参数包括：

1. 监测动物的一般状态，包括理毛行为、毛发状况、姿势和活动水平。
2. 每日测量体重；若在48小时内体重下降超过术前体重的15%，或在任何72小时内下降超过20%，则定义为人道终点。
3. 检查手术部位是否存在感染、伤口裂开或分泌物等迹象。
4. 观察动物行为，包括自发运动、对抓握的反应以及痛苦表现（如发声、躁动不安）。
5. 对于经镇痛处理后仍持续表现出疼痛或痛苦症状的动物，应由兽医人员进行评估，并在必要时实施安乐死。

结果

以肠系膜上动脉（SMA）作为稳定的解剖标志，肠自主神经束可被识别为沿血管走行的细小、珍珠白色的平行结构。根据其相对于SMA的解剖位置，位于上方的神经束被认定为假定的副交感神经束，下方的神经束则被认定为假定的交感神经束（图1A，D）。术中阳性结果的判定标准为：目标神经束被清晰识别并完全切断，且横断面无残留纤维连接。在横断部位偶尔观察到的乳白色或淡白色液体不被视为神经成功切断的确凿证据，因为类似外观也可能源于周围淋巴组织或结缔组织的损伤。因此，去神经的成功与否需结合术中解剖观察与后续验证共同评估（图1B，C，E）。术中效果不理想的情况包括：难以将神经束与周围结缔组织区分、横断不完全（存在残留纤维连接切口两端）或出血导致手术视野受阻；上述任一情况均可能导致部分去神经，进而引起后续验证结果的不一致。

为了确认肠道定向自主神经投射的功能性中断，使用荧光标记的霍乱毒素B亚单位（CTB）进行逆行示踪。小鼠经麻醉...

讨论

小鼠的肠系膜上动脉（SMA）起源于腹主动脉前壁，位于腹腔干下方，为包括肠道在内的主要腹腔内脏器官提供动脉血供¹⁴。SMA前方为结肠及其系膜，后方则与左肾静脉和腹主动脉关系密切；肠系膜上静脉通常沿其右侧走行。在小鼠中，SMA极为细弱，周围环绕着重要器官和主要血管。值得注意的是，交感和副交感神经纤维同样纤细，紧密贴附并伴行于SMA两侧。因此，切断交感或副交感神经干均需要极高的精确度。

该操作过程中会遇到两个主要挑战。第一个挑战是术中可靠地识别肠系膜上动脉（SMA）以及伴随其走行的交感神经和副交感神经纤维。第二个挑战是，由于神经紧贴血管壁，切断神经时极易造成SMA损伤并引起出血。为尽量降低这一风险，可在切断前使用玻璃探针仔细将神经束与SMA及邻近结缔组织分离约3–5 mm的距离。所有操作均应轻柔进行，以避免对神经造成牵拉损伤，并防止伴行血管撕裂。

在剖腹手术过程中可能会发生腹部器官损伤。一旦发生，应立即使用浸有温盐水的无菌棉签轻轻按压以控制出血。肝叶的小型表浅裂伤通常可通过压迫处理。然...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 编织丝线不可吸收缝合线	Ethicon	W500
6-0 聚乙醇酸（PGA）缝合线	Jinhuan	CR631
麻醉诱导舱	RWD Life Science	V100
动物麻醉机	RWD Life Science	R500IP
抗胆碱乙酰转移酶抗体	Abcam	ab181023
人工泪液润滑性眼用软膏	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J 小鼠	上海模型生物研究中心技术有限公司	SM-001
霍乱毒素亚基 B（CTB），Alexa Fluor™ 555 标记物	Thermo Scientific	C34776
光学显微镜	宇研仪器	512
DAPI 和 Hoechst 核酸染色剂	Invitrogen	D3571
快绿	Thermo Scientific	F7252
精细止血钳	金钟外科器械	JCG020
低致敏性手术胶带	3M Blenderm	70200419342
异氟烷	RWD Life Science	R510-22-10
显微镊（弯头）	金钟外科器械	WCC200
显微镊（直头）	金钟外科器械	WCC190
显微持针器	金钟外科器械	WBA050
显微剪刀	金钟外科器械	Y3F010
微量注射器	Hamilton	7632-01
眼科剪刀（尖头）	金钟外科器械	JC2303
眼科剪刀（钝头）	金钟外科器械	JC2303
聚维酮碘棉签棒	稳健医疗	206
组织与细胞固定液（4% 多聚甲醛，PFA）	MedChemExpress	HY-DY3003
组织 OCT 包埋冷冻介质	Sakura	C2077
酪氨酸羟化酶（E2L6M）兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	58844S