用于持续生理机械应激下活细胞成像的通用压力加载装置

Summary

本文所述的压力加载装置支持对培养细胞的延时光学成像，并兼容标准细胞培养皿和倒置显微镜。利用该设备，肿瘤静水压微环境被证实能增强钙信号传导，为研究肿瘤微环境中的机械信号传导提供了可行的平台。

Abstract

该方案描述了一种静水压力加压装置，能够在持续静水压力刺激下实时观察粘附细胞，并兼容3.5厘米的商业细胞培养皿。该装置由一个由铝基底制成的密封培养室、一个光学透明的聚（甲基丙烯酸甲酯）盖、集成在盖子内的气体进出口口以及一个密封的观察窗组成。通过连接到调节气体源，设备保持稳定的静水压力（0–200 kPa，可调节），同时实现连续的相位对比或荧光成像。利用该压力加载装置，可以记录压力诱导的剂量依赖性对细胞表型和行为的影响，如形态、增殖和迁移。此外，荧光信号也可以实时记录。本研究通过倒置荧光显微镜及延时成像观察并定量乳腺癌MDA-MB-231细胞和宫颈癌HeLa细胞中压力触发的Ca^2⁺ 信号异质性及动态。该平台将机械载荷与活细胞成像相结合，克服了传统终点系统的限制，为机械生物学研究提供了通用工具。

Introduction

许多细胞、组织和器官在其^{生理结构中}经历持续或间歇的压缩力。例如，肺泡细胞在呼吸时承受周期性加^压2，而膀胱上皮细胞在尿液潴留时承受机械负^荷3。在病理环境中，如实体肿瘤，癌细胞持续暴露于源自空间限制和间质^液压力升高的压缩力下。同样，在半月板退变和肺纤维化等其他疾病中，半月板细胞⁵ 和肺泡上皮细胞⁶ 也承受由张力和基质刚度产生的持续机械应力。

越来越多的证据证实机械压力是细胞表型和行为的强有力调节者 ^7,8。在非恶性细胞中，压缩应激促进牙周干细胞的增殖，并通过侵入性突起诱导破骨细胞融合^9。相反，在癌症模型中，压缩表现出Janus效应：它抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移，同时激活促进化疗耐药的转录组重编程^10,11。此外，高渗透压引起的体积压缩可诱发细胞内拥挤，并通过液相分离（LLPS）刺激蛋白质浓度和离子强度的重新分布，从而深刻改变细胞行为和命运。这种物理扰动通过激活的Wnt/β-catenin信号增强肠道类器官的扩增，并增强肠道干细胞的自我更新能力¹²。此外，在细胞核中，由体积变化诱导的LLPS通过协调转录启动、延长和终止参与基因转录调控^13,14。

为了定量研究这些压力引起的生物效应，必须建立能够施加明确且均匀压缩刺激的实验系统。对于体 外培养的细胞，这些细胞被水培养基包围，静水压是施加此类压缩力的主要且生理学上重要的手段，已被广泛用于细胞机械转导的研究^。静水压力可以在不补充骨诱导因子的情况下，提高碱性磷酸酶活性并加速人类脂肪来源间充质干细胞的成骨¹⁶。在非酒精性脂肪肝病中，静水压等机械力可以促进门静脉高压，但不会显著纤维化，强调其在组织多样性中的作用¹⁷。尽管静水压力在病理生理调控中起着重要作用，但静水压力的机制性研究面临一个关键限制：传统压力舱无法在刺激过程中实时观察活细胞。大多数实验系统仅支持终点分析，掩盖了机械转导事件的空间和时间动态，如压电1机械活化、Ca²⁺通量异质性和细胞骨架重组。这一空白限制了对静水压力如何驱动肿瘤或其他组织表型多样性的理解。

为弥补这一技术空白，开发了一种新型实验平台，能够通过光学成像实时观察细胞对精确控制静水压的反应。该系统集成了三项关键功能：（1）通过可调气体压力控制器施加0–100 kPa的持续静水压（压力表范围为0–200 kPa，可根据生理参数选择施加压力）。例如，基于不同细胞类型报告的压缩应力：人类骨髓间质细胞为8-16 kPa，^血管平滑肌细胞为12–24 kPa，19，人类乳腺上皮细胞为0–15 kPa，20.）;（2）在静水压力施加时具有高时间分辨率的连续活细胞成像;以及（3）在长时间实验中维持生理培养条件。该方法能够直接可视化动态过程，包括压电1通道的招募与激活、钙信号波以及在机械刺激下发生的细胞骨架重塑。此外，该设备兼容大多数市售培养皿和倒置显微镜，极为便利于实验室使用。实时监测这些细胞内生化事件的能力，为细胞如何感知和适应静水压力提供了前所未有的见解。通过捕捉机械转导事件的时间序列，包括最初的力感测、下游信号传导和表型变化，该平台为探究静水压力在生理和病理环境中影响细胞行为的基本机制提供了有力工具。

Protocol

1. 材料

1. 器件规格（见 图1）
   1. 根据以下规格准备组件：
      底座：铝制（Ø 56 mm，高 15 mm），中央窗户 Ø 40 毫米。
      盖子：PMMA（Ø 56 mm），6× M3 螺纹孔，Luer-lock 气孔，硅胶垫圈（内径 25 mm，外径 32 mm，厚度 0.8 mm）
      压力调节器：（0–200 kPa范围）
2. 细胞与试剂
   1. 本研究中使用MDA-MB-231和HeLa细胞。使用L-15培养基、RPMI 1640培养基、新生儿小牛血清（NCS）、1%抗生素-抗真菌溶液，以及钙成像探针进行细胞培养和Ca²⁺标记。

2. 器件制备

1. 制造
   1. 定制设计是本研究的核心部分。根据规格对铝制底座和PMMA罩进行精密加工（见 图1 及 补充图1）。
   2. 剪开硅胶垫片，处理到所需尺寸。
      注意：PMMA材料的光学透射率足以用于标准透射光成像。所有组分均可灭菌且具备后续细胞培养实验的生物相容性。该腔室的制造公差没有特殊要求（本研究采用了±0.1毫米的公差）。
2. 绝育
   1. 要消毒铝底，先在121°C高压灭菌20分钟。
   2. 要消毒保护套（PMMA），用75%乙醇擦拭，然后用紫外线消毒30分钟。
   3. 用121°C高压灭菌消毒硅胶垫片20分钟。

3. 细胞处理

1. 细胞培养
   1. 种子细胞置于35毫米盘中，汇聚度为30%–70%。在_CO2 培养箱中，以RPMI-1640或L15培养基（补充10% NCS）培养细胞24小时，温度为37°C，含5% CO₂。
   2. 细胞传代时，用0.25%胰蛋白酶解离细胞，并用完全培养基终止消化。当细胞达到70%–80%的汇合度时，用于重新播种。
2. Ca²⁺ 染色
   1. 取出培养基，然后用预热的汉克平衡盐溶液（HBSS）在生物安全柜中清洗细胞两次。
   2. 用5微米钙成像探针在无血清培养基中染色细胞间Ca²⁺ 。在光保护环境下，37°C下孵育20分钟。
   3. 去除染料，用HBSS洗涤细胞三次，然后在无血清培养基中去酯化30分钟。

4. 器件组装（图2）

1. 将培养皿转移到加压室中央窗户，然后取出培养基。
2. 将消毒过的密封圈放入培养皿中。
3. 将盖子对齐在碟垫排上。
4. 先用手拧紧螺丝，直到感受到阻力，然后用扭矩控制的驱动器再加1.5圈。
5. 将硅胶气体管连接到Luer-lock接口，并向设备注入混合气体以检查泄漏情况。
6. 断开硅胶气体管，使用5毫升无菌注射器通过Luer-lock端口将新鲜培养基注入细胞培养皿。

5. 压力加载与成像

1. 将直径内径4毫米的硅油气管从硅胶垫圈的Luer-lock接口连接到数字压力表和油箱。
2. 将组装好的设备安装在显微镜台上。
3. 校准压力。
   1. 使用该规范验证0–200 kPa范围的稳定性。
      注：HeLa细胞培养使用含75%氮、20%氧气和5%二氧化碳的混合气体。MDA-MB-231细胞培养使用含80%氮和20%氧气的混合气体。压力加载实验中使用的气体类型可根据电池类型、介质类型或具体实验需求进行更换。没有任何组件是型号特定的，压力检测模块及其入口管的尺寸可根据需要选择。
4. 通过数字压力调节器设定目标压力（例如100 kPa）。
5. 达到目标压力后开始成像。
6. 成像
   1. 调整舞台，确认成像区域，并确保细胞对焦。
   2. 使用配备20×物镜的倒置荧光显微镜获取染色细胞的荧光图像，参数如下：400毫秒曝光时间，5秒的延时摄影间隔，总成像时长10分钟（FITC滤镜：Ex/Em = 490/525 nm，截止 = 515 nm）。
   3. 在非加压条件下拍摄10分钟图像，以确保系统正常运行并获得基线信号数据。
   4. 打开气阀至负载压力后，重新调整级高以确保电池对焦，然后开始成像动态钙信号。
   5. 根据培养皿底部厚度和物镜的工作距离选择物镜。选择用于监测钙信号振荡的曝光时间，同时避免过度的光漂白和光损伤。
   6. 在观察其他动态信号时，根据探针类型和实验需求调整参数。

6. 排查

1. 请参考 表1 获取故障排除建议。

7. 统计分析

1. 所有数据均值±标准差（SD）表示。GraphPad Prism软件（美国）用于比较未配对学生t检验两组之间的结果。当 **p < 0.01、***p < 0.001 或 ****p < 0.0001 时，差异被视为统计学显著。

Results

为验证该静水压加重设备的实时成像功能，观察了施加静水压力后肿瘤细胞钙信号的动态变化。将融合的MDA-MB-231、HeLa和A549细胞播种到35毫米培养皿中，供后续使用。在用钙成像探针染色后，无血清培养细胞接受40 kPa的静水压。经过10分钟的静水压力负荷后，癌细胞中的总钙水平上升（见图3A、B及补充图2A、B）。为触发钙振荡，在无血清培养基中加入10%的NCS。研究表明，40 kPa的静水压增强了MDA-MB-231和HeLa细胞的钙振荡，振荡细胞比例较高（图3C，视频1、视频2、视频3和视频4）。热图显示，单细胞在静水压负荷后钙振荡增强（见图4A、4B及...

Discussion

该方案展示了一种通用可适应的压力加荷装置，能够实时观察可调性静水压力下的机械转导动力学。通过将光学透明PMMA罩与精密加工铝底座集成，系统克服了传统腔室只能进行终点分析的关键限制。这种压力加载装置配合标准倒置显微镜，可以通过延时成像提供动态信息。设备与标准35毫米培养碟的兼容性及其简单的组装工艺促进了其广泛应用。

使用该设备实时观察钙信号动力学在机械压力下的响应，为研究机械力与肿瘤病理生物学之间的分子联系提供了宝贵工具。机械压力是肿瘤微环境中固体应力的关键组成部分，且越来越被认可为恶性进展的关键调节因子。例如，实体肿瘤中的机械性拥挤可能触发异常钙信号，通过CamK-A-PNCK轴激活NF-κB通路，从而推动乳腺肿瘤生长²¹。近期关于膀胱癌的研究表明，乳头状和原位癌的生长模式可能源于由上皮过度生长引发的明显机械屈曲不稳定性，具体形态亚型由黏膜层间的刚度比决定²²。此外，机械约束已被证明可以通过乙酰化微管-LINC复合体-H...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗生素-抗真菌药（100倍）	美国，Thermo Fisher Scientific公司	15140122	全培养基中1%浓度
高压灭菌器	松下，日本	MLS-3751-PC	用于消毒铝制底座和硅胶垫片
生物安全柜	美国，Thermo Fisher Scientific公司	1300系列A2 II类，A2型生物安全柜	为细胞处理提供无菌环境
Cal-520 AM，细胞恒定钙指示剂	AAT Bioquest，美国	21131	用于动态检测活细胞中钙离子浓度
细胞培养皿（35毫米）	中国BIOFIL	TCD010035	用于播种细胞的标准35毫米盘子
膛室底座（铝制）	全义，中国	/	定制设计 & Oslash;56毫米，高15毫米，中央窗和斜角;40毫米
膛室盖（PMMA）	全义，nbsp;中国	/	定制设计 & Oslash;56毫米，带有6&拍子;M3螺纹孔，Luer-lock气孔
CO2 孵化器	美国，Thermo Fisher Scientific公司	赫拉基尔3111	保持培养条件为37度;C有没有5%二氧化碳的含<>2
HBSS（汉克斯平衡盐溶液）	碧昂泰姆，中国	C0219	用于染色前后清洗细胞
HeLa细胞系	中国基础医学科学研究所细胞资源中心，中美医学科学与医学院（CAMS/PUMC）	CRM-CCL-2	人类宫颈癌细胞
倒置荧光显微镜	尼康，日本	日蚀Ti2	用于荧光成像
莱博维茨的L-15中型	美国，Thermo Fisher Scientific公司	41300039	用于MDA-MB-231细胞培养
MDA-MB-231细胞系	中国基础医学科学研究所细胞资源中心，中美医学科学与医学院（CAMS/PUMC）	CRM-HTB-26	人类乳腺癌细胞
新生儿小牛血清（NCS）	美国，Thermo Fisher Scientific公司	16010142	全培养基中10%浓度
压力调节器	洪润，中国	DP20	范围：0-200 kPa
RPMI 1640 中型	美国，Thermo Fisher Scientific公司	31800022	用于MDA-MB-231细胞培养
无菌注射器（5毫升）	KDL，中国	1101010198	通过Luer-lock端口注入培养基或试剂
胰蛋白酶（0.25%）	美国，Thermo Fisher Scientific公司	2520056	用于解离粘附细胞以实现传代