用于活细胞成像的通用压力加载装置，在持续生理机械应力条件下

摘要

本文所述的压力加载装置可实现对培养细胞的延时光学成像，并与标准细胞培养皿和倒置显微镜兼容。利用该装置，已证实肿瘤组织的静水压微环境可增强钙信号转导，为研究肿瘤微环境中机械信号转导提供了可行的实验平台。

摘要

本方案描述了一种可实现对贴壁细胞在持续静水压刺激过程中进行实时显微观察的静水压加载装置，该装置兼容市售的3.5 cm细胞培养皿。该设备由铝制底座、光学透明的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖板、集成于盖板上的气体进出端口以及一个密封的观察窗口构成，形成一个密闭的培养腔室。通过连接受控气源，该装置可在维持稳定静水压（0–200 kPa，可调）的同时，支持连续的相差或荧光成像。利用该静水压加载装置，可记录压力诱导的细胞表型及行为变化（如形态、增殖和迁移）的剂量依赖性效应。此外，还可实时记录荧光信号。本文中，通过倒置荧光显微镜结合延时成像技术，观察并量化了乳腺癌MDA-MB-231细胞和宫颈癌HeLa细胞中由压力触发的Ca^2⁺信号异质性与动态变化。该平台将力学加载与活细胞成像相结合，克服了传统终点检测系统的局限性，为力生物学研究提供了一种通用工具。

引言

许多细胞、组织和器官在其生理过程中会经历持续或间歇性的压缩力¹。例如，肺泡细胞在呼吸过程中会受到周期性加压²，而膀胱上皮细胞在储尿过程中则承受机械负荷³。在实体瘤等病理条件下，癌细胞会持续暴露于空间受限和间质流体压力升高所产生的压缩力中⁴。类似地，在半月板退变和肺纤维化等其他疾病中，半月板细胞⁵和肺泡上皮细胞⁶也会因张力和基质刚度衍生的压力而经历持续的机械应力。

越来越多的证据表明，机械压力是细胞表型和行为的强有力调控因子^7,8。在非恶性细胞中，压缩应力可促进牙周干细胞的增殖，并通过侵袭性突起诱导破骨细胞融合⁹。相反，在癌症模型中，压缩作用表现出双重效应：它抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移，同时激活转录组重编程，从而促进化疗耐药性^10,11。此外，由高渗压力引起的体积压缩可导致细胞内拥挤，并通过液-液相分离（LLPS）....

方案

1. 材料

1. 设备规格（见图1）
   1. 根据下述规格准备组件：
      底座：铝材（Ø 56 mm，高 15 mm），中央窗口 Ø 40 mm。
      盖子：聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，Ø 56 mm），含：6 × M3 螺纹孔、鲁尔锁气体接口、硅胶垫圈（内径 25 mm，外径 32 mm，厚度 0.8 mm）
      ​压力调节器：（0–200 kPa 范围）
2. 细胞与试剂
   1. 本研究中使用 MDA-MB-231 和 HeLa 细胞。使用 L-15 培养基、RPMI 1640 培养基、新生牛血清（NCS）、1% 抗生素-抗真菌溶液以及钙离子成像探针用于细胞培养和 Ca²⁺ 标记。

2. 设备准备

1. 制造
   1. 定制本研究的核心部件。根据规格精密加工铝制底座和PMMA盖板（见图1和补充图1）。
   2. 裁剪硅胶垫圈，并加工至所需尺寸。
      ​注意：PMMA材料的光学透....

结果

为验证该静水压加载装置的实时成像功能，观察了施加静水压后肿瘤细胞内钙信号的动力学变化。将融合生长的 MDA-MB-231、HeLa 和 A549 细胞接种于 35 mm 培养皿中备用。经钙离子成像探针染色后，将无血清培养的细胞暴露于 40 kPa 的静水压下。施加静水压 10 分钟后，癌细胞内的总钙水平升高（图3A,B, 和 补充图 2A,B）。为诱导钙振荡，向无血清培养基中加入10% NCS。结果显示，40 kPa的静水压力增强了MDA-MB-231和HeLa细胞的钙振荡，表现为振荡细胞的比例更高（图3C, 视频 1, 视频 2, 视频 3，以及 视频 4）。热图显示，在静水压加载后，单个细胞的钙振荡增强（图4A,4B，以及 .......

讨论

本方案展示了一种具有广泛适用性的加压装置，可实现对可调静水压下力传导动态过程的实时观察。该系统通过将光学透明的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖板与精密加工的铝制底座相结合，克服了传统培养腔室只能进行终点分析的关键局限性。该加压装置与标准倒置显微镜配合使用，可通过延时成像提供动态信息。该装置兼容标准的35 mm培养皿，且组装过程简便，有利于其广泛推广和应用。

利用该设备实时观察机械压力下钙信号动态变化，为研究机械力与肿瘤病理生物学之间的分子关联提供了有力工具。机械压力是肿瘤微环境中实体应力的关键组成部分，正日益被视为调控恶性进展的重要因素。例如，实体瘤中的机械拥挤可触发异常的钙信号，通过CamK-A-PNCK轴激活NF-κB通路，从而促进乳腺肿瘤的生长²¹最近关于膀胱癌的研究表明，乳头状和原位癌的生长模式可能源于上皮过度生长所引发的不同力学屈曲失稳，其特定的形态学亚型由黏膜各层之间的刚度比决定。²²此外，机械限制已被证明可重塑染色质 通过 乙酰化微管-LINC复合物-HMG.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122	在完全培养基中配制成1%浓度
高压灭菌器	Panasonic, Japan	MLS-3751-PC	用于铝制底座和硅胶垫圈的灭菌
生物安全柜	Thermo Fisher Scientific, USA	1300 Series A2 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinets	为细胞操作提供无菌环境
Cal-520 AM，细胞渗透性钙离子荧光探针	AAT Bioquest, USA	21131	用于活细胞内钙离子浓度的动态检测
细胞培养皿（35 mm）	BIOFIL, China	TCD010035	标准35 mm培养皿，用于细胞接种
腔室底座（铝制）	Quanyi, China	/	定制设计，Ø 56 mm，高15 mm，中心窗口 Ø 40 mm
腔室盖（PMMA）	Quanyi,  China	/	定制设计，Ø 56 mm，带6× M3螺纹孔，Luer-lock气体接口
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific, USA	HERAcell 3111	维持37°C培养环境，可选含或不含5% CO2
HBSS（Hanks平衡盐溶液）	Beyotime, China	C0219	用于染色前后的细胞洗涤
HeLa细胞系	中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所细胞资源中心	CRM-CCL-2	人宫颈癌细胞
倒置荧光显微镜	Nikon, Japan	Eclipse Ti2	用于荧光成像
Leibovitz L-15培养基	Thermo Fisher Scientific, USA	41300039	用于MDA-MB-231细胞培养
MDA-MB-231细胞系	中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所细胞资源中心	CRM-HTB-26	人乳腺癌细胞
新生牛血清（NCS）	Thermo Fisher Scientific, USA	16010142	在完全培养基中配制成10%浓度
压力调节器	Hongrun, China	DP20	量程：0–200 kPa
RPMI 1640培养基	Thermo Fisher Scientific, USA	31800022	用于MDA-MB-231细胞培养
无菌注射器（5 mL）	KDL, China	1101010198	通过Luer-lock接口注入培养基或试剂
胰蛋白酶（0.25%）	Thermo Fisher Scientific, USA	2520056	用于贴壁细胞传代时的消化解离