利用CRISPR/Cas9介导的内源性荧光标记技术标记生殖系特异性基因 秀丽隐杆线虫

摘要

一种通过CRISPR/Cas9显微注射流程在Caenorhabditis elegans生殖系中实现内源性荧光标记的方法，用于获得纯合敲入品系，以进行体内 蛋白质定位分析。

摘要

蛋白质在细胞内的定位 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫生殖系在解读基因在配子发生过程中的功能方面至关重要，然而传统的转基因方法往往导致表达水平不稳定，且在生殖细胞中可能发生沉默。本文介绍了一种实用的CRISPR/Cas9操作流程，通过将荧光标签插入内源性基因位点，实现稳定敲入等位基因的构建，从而在天然调控条件下报告目标蛋白的分布情况。该方案涵盖了实验的关键步骤：选择适用于目标蛋白的标记策略、通过性腺显微注射将CRISPR试剂递送至年轻成虫期的雌雄同体线虫、回收注射后的个体并进行筛选。通过两代的PCR基因型鉴定，识别出敲入候选株系，分离纯合子线虫并验证编辑后的等位基因。最后，利用共聚焦显微镜确认生殖系中的荧光信号，并评估蛋白的亚细胞定位。 在体内 该实验流程设计为可重复且广泛适用于生殖系富集基因，为建立纯合标记品系以进行发育和细胞生物学分析提供了简便途径。

引言

秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究生殖发育和配子发生的成熟模型，因其生命周期短、身体透明以及遗传操作性强而被广泛应用¹. 秀丽隐杆线虫 主要以自体受精的雌雄同体形式存在，其生殖腺先进行精子发生，随后转变为卵子发生。这种繁殖方式简化了品系的维持，也便于获得纯合品系。²近期的空间转录组学研究显著扩展了在性腺中富集的基因列表，并揭示了在整个生殖系统中明显的性别特异性表达模式 秀丽隐杆线虫³近年来，单细胞RNA测序技术已能够重建生殖细胞的发育轨迹，并推断调控精子发生过程的基因调控网络⁴这些数据集共同生成了丰富的候选基因列表，但功能解读通常需要观察蛋白质的行为 体内——具体而言，是定义相应蛋白质在何时何地定位于细胞内，以及它们的分布模式在生殖系发育过程中如何变化。

在线虫 C. elegans 中，传统的转基因技术通常依赖于将质粒 DNA 显微注射到性腺中，这种方法容易产生多拷贝的染色体外阵列⁵。然而，在生殖系中，这些阵列常常被强烈沉默，这种机制被认为有助于通过限制重复 DNA 的表达来维持生殖系的完整性，从而保持生殖系功能以及遗传信息在世代间的稳定性^6,7。因此，在体细胞组织中易于表达的转基因表达构建体在生殖系中可能表达微弱或不稳定。即使能够检测到表达，拷贝数效应和人工设计的调控元件也可能改变蛋白的剂量和表达时序，从而可能干扰对天然定位和动态行为的结论。为克服这些局限性，微粒轰击法和 Mos1 介导的单拷贝插入（MosSCI）被广泛用于构建低拷贝或单拷贝整合的转基因品系^8,9,10。这些方法可改善生殖系中的表达，但在成本、通量以及对内源性调控的还原程度方面存在差异。CRISPR/Cas9 基因组编辑技术则提供了一条更直接的途径，通过同源定向修复（via homology-directed repair）将荧光标签插入内源基因位点，从而生成稳定的基因敲入等位基因，可在天然调控条件下报告蛋白的定位与动态行为^11,12,13,14。

此处提供一种利用CRISPR/Cas9介导的内源性荧光标记的实用工作流程 秀丽隐杆线虫 基于已报道的生殖系富集表达模式所筛选的基因，本文描述并应用了一种方法。该方案详细说明了靶点选择、供体质粒与引导RNA设计、性腺显微注射以及后续筛选以获得纯合敲入品系，并通过基因型鉴定进行验证。该方法可广泛适用于不同发育阶段的生殖系表达基因，能够实现对蛋白质定位及动态变化的定量分析 体内 该实验流程为标记生殖系中表达的基因以及分析蛋白质的定位与动态变化提供了切实可行的策略 体内 在天然调控控制下

方案

涉及秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的所有实验均依照北京师范大学关于实验用生物体护理与使用的机构指南进行。

图 1：CRISPR/Cas9 介导的 C. elegans 内源性荧光标记总体流程。 示意图展示了内源性荧光敲入构建与验证的主要步骤。在设计与构建阶段，选择在生殖系中富集表达的目标基因及插入位点，使用 pDD162 作为表达 Cas9 和向导 RNA 的 CRISPR/Cas9 质粒，使用 pPD95.75 作为供体质粒骨架，将荧光标签（如 GFP）以及左右同源臂亚克隆至该骨架中。在显微注射阶段，将 CRISPR/Cas9 注射混合物（包括 gRNA/Cas9 质粒、供体模板和共注射标记）注入年轻成年雌雄同体线虫的生殖腺，随后在涂布细菌的培养板上恢复培养。在验证阶段，筛选携带标记阳性的后代进行后续基因分型，包括通过 PCR 鉴定敲入事件，并通过 DNA 测序确认，最终对成功构建的敲入品系进行荧光显微镜观察，以评估标记蛋白在生殖系中的表达及其亚细胞定位。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 选择一个生殖系富集的目标基因

1. 利用公共数据库和已发表的文献，鉴定在性腺或生殖细胞中优势表达的候选基因。
2. 根据蛋白质特征选择合适的标签插入位点。记录所选的同种型及标签插入位置，用于后续的引导RNA和供体模板设计（图1）。

2. 设计向导RNA和供体质粒模板

1. 在原间隔序列邻近基序（PAM；NGG）上游确定一段20 nt的向导RNA（gRNA）序列，该序列是Cas9识别所必需的，并将其定位在尽可能靠近预期标签插入位点的位置。
2. 使用在线设计工具（例如 IDT CRISPR 设计工具）评估候选 gRNA 秀丽隐杆线虫 基因组已选定。请选择具有高预测靶向切割效率且无高风险预测脱靶位点的向导序列。
3. 将gRNA序列克隆至CRISPR表达质粒骨架中U6启动子与gRNA骨架序列之间的区域。
   注意：设计引物时将gRNA序列作为末端突出序列引入。进行PCR扩增后，采用基于同源重组的连接克隆方法（一种无需连接酶的克隆技术），该方法无需限制性酶切，可实现一步法直接将目标片段克隆至表达载体中¹⁵.
4. 通过Sanger测序确认插入正确性。
5. 使用荧光标签构建供体质粒，该标签两侧分别带有约1,000 bp的左同源臂和1,000 bp的右同源臂，同源臂序列来源于目标基因座。
   注意：使用蛋白酶K消化制备的N2基因组DNA（线虫裂解液）作为模板，扩增同源臂。设计引物时，使其包含15–20 bp与线性化载体及荧光标签的重叠序列。将同源臂与标签片段连接至载体骨架中 通过 单次反应中进行同源重组。若进行N端标记，将荧光标签插入ATG起始密码子之后；若进行C端标记，则插入终止密码子之前。在目标基因与荧光标签之间加入连接序列，以维持蛋白质的正确折叠和功能。利用连接序列减少融合伴侣之间的空间位阻，并确保连接序列和标签均与编码序列保持正确的阅读框。谨慎选择插入位点，避免破坏已知或预测的功能结构域、信号肽或跨膜区域。补充文件 1).
6. 在供体同源模板序列中引入同义突变，以破坏PAM序列或向导RNA结合序列，同时不改变蛋白质序列，从而防止Cas9在整合后再次切割。
   注意：在用于同源臂扩增的引物中引入同义点突变，靶向PAM区域内的密码子。
7. 通过Sanger测序确认供体序列在两个同源臂及标签连接处的完整性。
   注意：验证后的质粒短期保存应置于 −20 °C，长期保存应置于 −80 °C。

3. 准备注射混合液

1. 将CRISPR表达质粒、供体质粒（基于pPD95.75构建）和共注射标记物在无菌ddH₂O中混合，配制成终体积为10 µL的注射混合液，各组分浓度见表1。
   注意：需通过实验优化各组分浓度，以平衡标记物的可读性、候选株的回收率以及注射后的存活率。
2. 将注射混合液在10,000 × g 条件下离心10–20分钟，以沉淀不溶性颗粒物质，防止堵塞显微注射毛细管。

组分	功能	工作浓度 (ng/μL)
pDD162	CRISPR/Cas9 质粒（Cas9 和 gRNA 表达）	50-100
供体质粒（pPD95.75 骨架）	携带荧光标签的 HDR 供体模板，两侧为约 1 kb 的同源臂	50-100
pRF4	共注射标记物（Roller 表型）	50-100
pPD122.11	共注射标记物（GFP 表达）	5-10
无菌 ddH2O	加至终体积	–

表1：注射混合物的组成及质粒功能。 注射混合物包含CRISPR表达质粒、供体质粒、pRF4和pPD122.11，浓度如所示，总体积为10 µL。

4. 加载并准备注射针

1. 使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成显微注射针，调整拉针仪参数以制备具有长锥度和锋利尖端的注射针，适用于性腺注射。
   注意：拉针仪参数需通过实验优化。示例起始参数：加热温度 = 540，拉力 = 20，速度 = 100。
   警告：操作拉制好的针头时需小心，避免刺伤。使用镊子操作针头，并将使用过的针头丢弃至锐器容器中。
2. 加热一根微毛细移液管，将其折断成两段，以制备装载工具。
   注意：也可使用市售的装载尖端作为替代。
3. 将橡胶吸液球连接到截短后的微毛细移液管的宽端。
4. 用该装载工具吸取约 1 µL 澄清的注射混合液上清液。
   注意：精确体积无需严格控制。确保溶液充满针尖部分。
5. 将装载工具插入注射针的尾部，缓慢释放注射混合液。
6. 将装好液体的注射针水平放置 10 分钟，使溶液沉降至针尖，并确认形成连续的液柱。
7. 将注射针安装至显微注射镜下，使用明场光学系统对准针尖并调焦。
8. 在卤代烃油中，轻轻使针尖接触盖玻片边缘以打开针口，并测试液体流动情况。
   注意：调节注射压力（30–80 psi），使在 1 秒内产生的液泡直径约等于性腺直径¹⁶。

5. 准备用于注射的线虫

注意：按照先前所述方法制备线虫生长培养基（NGM）平板和M9缓冲液¹⁷。将线虫饲养在接种了大肠杆菌Escherichia coli OP50（以下简称OP50）的平板上，并在N2遗传背景下进行显微注射。

1. 从健康的培养皿中挑选L4期雌雄同体线虫，于20 °C孵育10小时，以获得生殖腺发育良好的年轻成虫。
2. 将线虫转移至未接种细菌的培养皿，以减少细菌的带入。
3. 在载玻片上制备干燥的2%琼脂糖垫，并滴加一滴卤代烃油。
4. 使用睫毛挑取器将线虫转移至琼脂糖垫上。
5. 固定线虫并调整性腺位置以便注射。
   注意：注射操作应在20–30分钟内完成，以防止样品干燥。

6. 进行性腺显微注射

图2年轻成虫中远端性腺合胞体的显微注射定位 秀丽隐杆线虫 雌雄同体生物 (A低倍明场显微图像显示一只已固定的小成虫雌雄同体。两条性腺臂均可见；其中一条的注射位点以箭头标示作为代表性示例。方框区域标记了B图中高倍放大所显示的部位。B高倍微分干涉差（DIC）显微镜图像，对应于A图方框区域。箭头指示在远端生殖腺合胞体内的注射位置，即注射混合物的注入点。比例尺：100 µm（A）和 20 µm（B). 请点击此处以查看此图的放大版本。

1. 找到一只固定的线虫，并使用低倍物镜识别其生殖腺。
2. 使用显微操作器控制装置调整显微注射针的位置。
3. 将线虫相对于显微注射针倾斜 20–40° 角度。
4. 切换至高倍镜，聚焦于远端生殖系。
5. 推动线虫向显微注射针方向移动，并将针尖置于生殖腺合胞体内部（图 2）。
6. 注入溶液，并通过观察生殖腺是否出现明显肿胀来确认注射成功。
   注意：优化注射压力（30–80 psi）、补偿压力（0.1–0.5 psi）以及注射持续时间（0.1–0.3 s）。
   警告：过高的压力或注射体积可能导致线虫破裂。
7. 退出显微注射针，并为后续注射重新定位。
   注意：可进行单侧注射以提高存活率，或进行双侧注射以提高编辑效率。
8. 加入 M9 缓冲液以释放线虫，并将每只线虫转移至单独的恢复培养板中。
9. 重复上述操作，完成 20–25 只线虫的注射。
   注意：若显微注射针发生堵塞或损坏，应及时更换。
10. 将注射后的线虫在 20 °C 条件下孵育 2–3 天，使其恢复。

7. 筛选F1代候选个体以鉴定敲入阳性品系

1. 筛选F1代子代的共注射标记物，并选择标记阳性的个体。
   注意：不同组织特异性和光谱特性的替代性荧光共注射标记物示例见补充表1。
   注意：为提高可靠性，应选择同时表达两种标记物的个体。优先选择标记物频率高的子代群体（“富集群体”）。
2. 将每条F1代线虫转移至单独的培养板，让其产卵1–2天。
3. 用蛋白酶K缓冲液裂解每条F1代线虫，以制备PCR模板。
   注意：若不能立即进行后续处理，可将裂解液保存于−80 °C。
4. 使用一个位于同源臂外侧的基因组引物和一个内部标签引物进行连接区PCR。
   注意：保留PCR阳性F1个体对应的培养板。

8. 筛选F2代子代以分离纯合敲入品系并验证整合

1. 将PCR阳性F1品系的F2后代分别接种到单独的培养板上。
2. 让F2线虫繁殖后代，裂解成虫进行基因分型。
   注意：如需保存，可将裂解液置于−20 °C。
3. 使用跨越同源臂的引物进行PCR，通过扩增产物大小区分野生型和敲入等位基因。
4. 通过Sanger测序对两个插入位点连接区域进行测序，以确认正确整合。
5. 利用荧光显微镜验证生殖系中荧光蛋白的表达及定位情况。
6. 扩增已确认的纯合品系并保存种质。
   注意：建议将验证后的品系进行冷冻保存，以实现长期储存。

结果

按照实验方案，对年轻成虫期的雌雄同体线虫进行性腺显微注射，注射内容物包括CRISPR/Cas9质粒（pDD162）、编码GFP敲入标签的供体质粒（pPD95.75，其两侧带有约1 kb的同源臂）、以及共注射标记质粒（pRF4和pPD122.11）。以一个在生殖系中富集表达的目标基因为代表性示例，构建稳定且纯合的敲入等位基因，用于在天然调控条件下报告蛋白质的定位情况。

经过两次注射实验，共注射了30只P0雌雄同体线虫，并对20只F1代个体进行了基因分型，最终鉴定出两个连接PCR阳性的品系，随后进一步筛选以分离纯合的敲入线虫。首先将F1代个体单独培养以建立F2代培养板，同时裂解对应的F1代成虫用于基因分型。采用单侧连接PCR检测方法鉴定敲入阳性的品系，该方法使用一个位于所选同源臂外侧的基因组引物和一个位于GFP标签内部的引物。如图3A所示，阳性样本扩增出预期的连接片段（1550 bp），而大多数被基因分型的F1代个体未在预期大小处产生条带，这反映了常见的非理想结果，即注射的DNA被遗传但未实现成功的同源定向修复（HDR）。

讨论

该实验流程旨在构建稳定的纯合敲入品系，将荧光标签插入内源性基因座，以在天然调控条件下报告蛋白的定位^5,6,7,8,9,10。在实际操作中，成功与否应通过一系列逐步验证来判断，而非依赖单一检测结果：首先通过F1代PCR筛选鉴定敲入候选个体，继而通过F2代基因型PCR确定纯合性，再通过DNA测序确认编辑等位基因的准确性，最后利用共聚焦显微镜观察生殖系中的荧光信号。这一分级验证策略为评估内源性标记是否成功提供了清晰的操作框架。与依赖外源启动子的传统转基因方法不同，内源性标记可保留目标基因座自身启动子及其调控环境下的正常表达模式。

前期设计和准备是成功构建可用的基因敲入品系的关键因素。首先，许多生殖...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	北京莱博生物技术有限公司	QZ02	制备NGM琼脂平板的组分
琼脂糖	NOVON	ZZ14011	制备 2% 琼脂糖垫
秀丽隐杆线虫N2品系	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）		注射背景品系
离心	Eppendorf	5425	澄清注射混合物
胆固醇	北京化学试剂公司	57-88-5	制备NGM琼脂平板的组分
共注射标记质粒 rol-6 (su1006) (pRF4)	欧阳广硕实验室		滚轴标记物用于富集候选细胞
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM880 + Airyscan	验证GFP表达/定位
磷酸氢二钾（K₂HPO₄）2HPO4)	国药集团	CAS：7758-11-4	制备NGM琼脂平板的组分
磷酸氢二钠（Na2HPO4)	国药集团	CAS：7558-79-4	制备M9缓冲液的组分
DNA 标准分子量参照物	美5生物技术有限公司	MF288-01	琼脂糖凝胶尺寸参照
供体质粒骨架（pPD95.75）	Addgene	1494	HDR供体质粒骨架
电泳  系统	北京六一生物科技有限公司	112-0630	在琼脂糖凝胶上分离PCR扩增产物用于连接区筛选和纯合性基因分型
大肠杆菌 OP50 菌株	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）		线虫的食物来源
荧光共注射标记质粒（pPD122.11）	消防实验室		GFP共标记以富集候选样本
荧光体视显微镜	SOPTOP	SZX12-HT	筛选表达荧光共注射标记的活体线虫
GelRed 核酸凝胶染料	美5生物技术有限公司	MF079-plus-01	DNA条带的可视化
玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4	与持针器配合使用以制备注射针
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	防止注射过程中干燥
培养箱	武汉瑞华仪器 &安普&设备有限公司	HP400S	在标准温度下培养线虫
硫酸镁（MgSO₄）4)	国药集团	CAS：7487-88-9	制备NGM琼脂平板和M9缓冲液的组分
微毛细移液管	KIMBLE	71900-50	加热并折断以制备加样工具
显微注射仪单元	Eppendorf	FemtoJet 4i	通过显微注射针（脚踏板控制）将注射混合液以可控压力脉冲注入远端性腺
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12545A 22×30-1	制备2%琼脂糖垫以用于显微注射过程中线虫的固定与 immobilization；将注射针尖在盖玻片边缘轻轻打开
显微注射显微镜	ZEISS	Axio Observer.A1	显微注射镜
针头拔除器	Sutter Instrument Company	Model P97	将玻璃毛细管拉制成注射针
PCR扩增仪	伯乐（Bio-Rad）	C1000 Touch 梯度PCR仪	PCR扩增
pDD162（Peft-3::Cas9 + 空白sgRNA）	Addgene	47549	Cas9 + sgRNA 表达
蛋白胨	Gibco	308723	制备NGM琼脂平板的组分
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	国药集团	CAS: 7778-77-0	制备NGM琼脂平板和M9缓冲液的组分
氯化钠（NaCl）	国药集团	CAS: 7647-14-5	制备NGM琼脂平板和M9缓冲液的组分
体视显微镜	Motic	K400L	挑选线虫并将其固定在琼脂糖垫上，进行注射后恢复操作