甘露糖受体C型2可预测胶质瘤不良预后，并与侵袭性表型及β-连环蛋白/上皮间质转化相关改变相关

摘要

公共队列分析和胶质瘤细胞实验确定 MRC2 是一个与胶质瘤不良预后相关的标志物，其与增殖、迁移、侵袭能力增强以及 β-连环蛋白/上皮-间质转化相关改变有关。

摘要

胶质瘤仍然是中枢神经系统一种致命的恶性肿瘤，目前仍需寻找能够改善预后分层并指导治疗探索的额外生物标志物。本研究通过整合公共转录组队列数据，对甘露糖受体C型2（MRC2/Endo180）进行了评估 体外 验证。肿瘤与正常组织的比较及泛癌筛查所用的表达谱及匹配的临床注释数据来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression, GTEx）项目，预后相关性进一步在中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas, CGGA）队列中进行分析。通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）和免疫印迹法检测胶质瘤细胞系中MRC2的表达，并利用慢病毒短发夹RNA（shRNA）在U87和U251细胞中建立稳定的MRC2敲低模型。采用CCK-8和克隆形成实验评估细胞增殖与克隆形成能力，通过孔膜插入实验检测细胞迁移与侵袭能力。利用免疫印迹法分析CDK4、CDK6以及β-catenin/上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）相关标志物的表达。在多个数据集中，MRC2在胶质瘤中均呈上调，且高表达与较差的总生存期、疾病特异性生存期及无进展间隔期相关。 体外MRC2 缺失会降低细胞增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力，同时伴随 CDK4 和 CDK6 蛋白水平下降以及 β-catenin 和 EMT 相关标志物的变化。综上所述，这些发现支持 MRC2 作为与侵袭性胶质瘤表型相关的潜在预后生物标志物，并提示其值得进一步开展机制研究 体内 研究

引言

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤，在颅内肿瘤中占相当大的比例^1,2。流行病学研究估计其年发病率约为每10万人中数例，且在不同人群中存在地理和性别相关差异^3,4。临床上，胶质瘤的生物学行为表现广泛：低级别胶质瘤病程可能较长，而高级别肿瘤——尤其是胶质母细胞瘤——对大多数患者而言仍进展迅速且致死率高^5,6,7,8。目前世界卫生组织（WHO）的分类系统结合了组织学特征与关键的分子标志物（如IDH突变、TERT启动子改变、MGMT启动子甲基化以及1p/19q共缺失），从而提高了诊断准确性并有助于判断预后^9,10。尽管采用手术、放疗和化疗等多模式综合治疗，肿瘤复发仍十分常见，高级别胶质瘤患者的长期预后依然不佳。因此，寻找新的预后标志物和可靶向的治疗弱点仍是当前亟需解决的重要课题。

MRC2（甘露糖受体C型2，也称为Endo180/CD280/uPARAP）是C型凝集素受体家族的一个跨膜成员¹¹。该分子在间质和免疫区室（如成纤维细胞和巨噬细胞）中富集，参与细胞外基质（ECM）的更新、与纤维化相关的重塑过程以及肿瘤-微环境相互作用^12,13。从结构上看，MRC2包含一个N端富含半胱氨酸的区域、一个可结合胶原的纤维连接蛋白II型结构域、多个C型凝集素样结构域、一个跨膜区段以及一个胞质尾部^14,15。通过介导胶原的内吞与重塑，MRC2可促进细胞运动性和组织侵袭能力；MRC2表达升高已被证实与多种癌症的侵袭性行为相关，包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤^{11,14,16,17,18}。先前的研究还提示MRC2与促侵袭性信号通路（例如TGF-β相关通路）、基质金属蛋白酶活性以及类似上皮-间质转化（EMT）的表型改变之间存在关联，并在癌症相关成纤维细胞和巨噬细胞的功能状态中发挥一定作用^{17,18,19,20,21}。然而，MRC2在胶质瘤中的临床意义及其在胶质瘤细胞中表达失调所导致的功能后果目前仍不明确。

尽管MRC2已被证实参与多种恶性肿瘤的细胞外基质重塑及侵袭性行为，但其在胶质瘤中的临床意义尚未在多个独立的转录组队列中得到系统性验证，且MRC2在胶质瘤细胞中与表型相关的作用也未在整合公共数据集分析与功能验证的框架下进行评估。因此，本研究假设MRC2与胶质瘤的不良临床预后及恶性表型相关。为回答这一问题，本研究整合了泛癌筛查、独立胶质瘤队列验证以及在胶质瘤细胞系中进行的稳定敲低实验，以评估MRC2的预后价值及其与细胞增殖、迁移、侵袭以及β-catenin/EMT相关标志物变化的关联。由于MRC2属于甘露糖受体家族，而胶质瘤的进展也受到肿瘤微环境的影响，本研究额外开展了基于IDH状态的MRC1表达探索性分析，以提供不同胶质瘤亚型间免疫相关差异的背景信息。

本研究的创新之处在于对公共胶质瘤数据集中的 MRC2 进行了综合评估 体外 功能实验，从而为其在胶质瘤中的相关性提供互补的临床和实验依据。与单一队列分析或仅基于细胞的研究相比，这种整合性工作流程具有多项实际优势。整合TCGA、GTEx和CGGA数据可实现跨队列验证，并减少对单一数据集的依赖。此外，将公共队列分析与胶质瘤细胞敲低实验相结合，可将临床关联性与表型水平的证据相联系。最后，通过采用包括RT-qPCR、免疫印迹、CCK-8、克隆形成实验和多孔膜插入实验在内的多种互补性检测方法，能够并行评估转录水平、蛋白水平、增殖能力以及运动相关特性的变化。整体研究设计与分析流程总结于 图1综上所述，该策略相较于仅依赖生物信息学分析或单一实验方法，能够提高研究结果的稳健性和生物学可解释性。

方案

本研究使用了公开可用的去标识化数据集（TCGA、GTEx 和 CGGA）以及已建立的商业细胞系。未涉及新招募的人类受试者、可识别的患者信息或患者来源的样本。所有分析均遵循相关机构和国际关于使用公开可用数据的指南。因此，本研究无需额外的机构伦理批准或知情同意。

1. 生物信息学工作流程与数据预处理

基因表达谱及匹配的临床注释数据来自公开资源，包括癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）、基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression, GTEx）项目以及中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas, CGGA）。表达矩阵和临床元数据被导入R语言环境，并根据样本标识符进行标准化整合。删除重复或无法匹配的条目，并排除缺乏关键生存信息的样本。提取MRC2表达值及其对应的临床病理学变量用于后续分析。在肿瘤与正常组织比较中，当存在配对的正常组织时，仅使用TCGA数据比较不同癌种间的MRC2表达水平；当需要额外的正常对照时，则采用整合后的TCGA–GTEx数据。针对胶质瘤的分析中，根据队列中MRC2表达水平的中位数，将TCGA-LGG和CGGA队列中的患者分为高表达组和低表达组。随后进行Kaplan-Meier生存分析、时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析以及Cox比例风险回归分析，以评估MRC2的预后价值。Cox模型中纳入了各队列数据完整性允许范围内的协变量，如年龄、性别、WHO分级及其他临床病理学变量。在数据可获得的情况下，还根据年龄、组织学亚型、WHO分级、IDH突变状态、1p/19q共缺失状态及治疗相关信息进行亚组分析。图表使用R语言和GraphPad Prism中的标准统计绘图流程生成。

2. 泛癌表达与生存分析

利用TCGA和GTEx数据集，比较了不同癌症类型中肿瘤组织与正常组织之间的MRC2表达水平。通过箱线图展示差异，并使用雷达图进行汇总。对不同癌症类型中MRC2表达与总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）以及无进展间隔期（PFI）之间的关联性进行了Cox比例风险回归分析。风险比及其相应的显著性水平通过森林图和热图进行可视化展示。

3. 胶质瘤队列中的预后验证及亚组分析

在TCGA低级别胶质瘤（TCGA-LGG）队列中，患者根据MRC2表达水平分为高表达组和低表达组。采用Kaplan–Meier生存分析比较两组之间的总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展间隔期（PFI）。生成时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线以评估预测效能。通过单变量和多变量Cox回归分析评估MRC2的独立预后价值。使用CGGA胶质瘤数据集进行外部验证，包括Kaplan–Meier生存分析、ROC分析和Cox回归分析。亚组分析用于评估MRC2表达在不同临床病理学变量中的分布情况，包括年龄、肿瘤分级、组织学亚型、IDH突变状态、1p/19q共缺失状态以及治疗相关变量。

4. IDH突变体中MRC1的表达 与 IDH野生型胶质瘤

使用 GlioVis 网络平台和 TCGA GBMLGG 数据集评估 MRC1 表达与 IDH 突变状态之间的关联。根据注释的 IDH 状态将病例分为 IDH 突变型和 IDH 野生型胶质瘤。在选定的数据集中查询 MRC1 mRNA 的表达水平，并利用平台内置的统计分析功能比较两组之间的表达水平。组间表达分布由平台生成并展示，统计学显著性定义为 P < 0.05。

5. 细胞培养

人胶质瘤细胞系和正常人星形胶质细胞来自已建立的细胞库。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，并在含5% CO₂和约95%相对湿度的湿润培养箱中于37 °C维持培养。选择U87和U251细胞进行功能缺失实验，因为在所测试的胶质瘤细胞系面板中，初步筛选显示这两种细胞系表达相对较高水平的MRC2，因此适用于基于基因敲低的功能分析。

6. MRC2 的慢病毒敲低

将靶向MRC2的短发夹RNA（shRNA）及非靶向对照shRNA克隆至慢病毒载体中。通过标准转染试剂将转移质粒与包装质粒共转染HEK293T细胞，以产生慢病毒颗粒。转染后48小时和72小时收集病毒上清液，于2,100 × g离心5分钟以去除包装细胞及细胞碎片，随后经0.45 µm滤器过滤，可立即使用或储存于−80 °C¹⁹。含病毒的上清液可立即使用，或分装后保存于−80 °C，避免反复冻融。在聚凝胺存在下，用慢病毒颗粒感染胶质瘤细胞。感染后，使用嘌呤霉素筛选细胞，以建立稳定的基因敲低细胞系。所用序列如下：sh-MRC2-1：5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′；sh-MRC2-2：5′-CCGGTATTGCTATAAGGTGTT-3′；sh-NC：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

7. 通过 RT-qPCR 和免疫印迹验证 MRC2 的敲低

使用TRIzol试剂提取总RNA，并根据制造商说明书利用逆转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green法进行定量PCR，扩增条件如下：95 °C预变性30秒，随后进行40个循环（95 °C变性5秒，60 °C退火延伸30秒），扩增结束后进行溶解曲线分析。引物序列如下：MRC2上游引物，5′-GGCAAGGACAAGAAGTGCGTGT-3′；MRC2下游引物，5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCGCTT-3′；GAPDH上游引物，5′-TCCACCCATGGCAAATTCC-3′；GAPDH下游引物，5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。以GAPDH为内参基因，采用比较C_t法（2^-ΔΔCt）计算相对mRNA表达水平²⁰。同时进行免疫印迹实验，以验证MRC2在蛋白水平的敲低效果。RT-qPCR实验共进行三次独立的生物学重复，每个样本均设技术重复三份。

8. 细胞增殖实验

采用CCK-8法检测细胞增殖。将细胞以适当密度接种于96孔板中，并培养指定时间段。在每个时间点，向各孔加入CCK-8试剂，按照制造商说明书进行孵育，随后使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。实验至少重复三次独立的生物学重复。

9. 克隆形成实验

将细胞以低密度接种至六孔板中，培养10–14天。用4%多聚甲醛在室温下固定菌落15分钟，并用0.1%结晶紫染色15分钟。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤菌落，风干后进行手动计数或使用图像分析软件计数²¹。实验至少进行三次独立的生物学重复。

10. 细胞迁移和侵袭实验

采用多孔膜小室实验评估细胞迁移和侵袭能力²²。在侵袭实验中，上层小室预先包被细胞外基质胶；在迁移实验中，则使用未包被的小室。将悬浮于无血清培养基中的细胞加入上室，下室加入含血清的培养基作为趋化因子。孵育后，用棉签轻轻擦去膜上表面未迁移的细胞。穿过膜并迁移或侵袭至下表面的细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%结晶紫染色15分钟，冷的磷酸盐缓冲液冲洗，空气干燥后，在倒置显微镜下以×200倍放大倍数成像。每个小室随机选取五个显微视野进行细胞计数。实验至少进行三次独立的生物学重复。

11. 蛋白质印迹分析

细胞在添加蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解，使用BCA法测定蛋白浓度。取等量总蛋白进行SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4 °C下与一抗孵育过夜。以下一抗及其工作稀释比例用于Western blot：抗MRC2（1:5,000）、抗CDK4（1:1,000）、抗CDK6（1:2,000）、抗β-catenin（1:5,000）、抗E-cadherin（1:10,000）、抗N-cadherin（1:3,000）和抗β-actin（1:5,000）。洗涤后，膜在室温下与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG二抗（1:5,000）孵育1小时。使用化学发光法显影信号，条带强度经β-actin归一化定量。实验至少进行三次独立的生物学重复。

12. 统计分析

统计分析使用 R 和 GraphPad Prism 软件进行。生存曲线的比较采用对数秩检验。单变量和多变量分析采用 Cox 比例风险回归模型。对于基于细胞的实验，数据以均值 ± 标准差（SD）表示。在进行参数检验前，使用 Shapiro–Wilk 检验评估数据的正态性。对于符合正态分布的数据，两组之间的差异采用 Student t 检验进行评估，多组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。若不满足正态性假设，则使用相应的非参数检验方法。P 值通过 Benjamini–Hochberg 错误发现率法对多重检验进行校正^23,24。双侧 P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

MRC2 的泛癌表达与预后图谱
首先进行泛癌分析，以表征 MRC2 在多种人类恶性肿瘤中的表达模式及其预后相关性。基于 TCGA 和 GTEx 数据集的比较显示，MRC2 表达在多种癌症类型的肿瘤组织与正常组织之间存在显著差异（图 2A、2B）。雷达图进一步概括了 MRC2 在不同癌症中表达的广泛变异情况（图 2C）。为评估 MRC2 表达在泛癌水平上的临床相关性，进行了总体生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展间隔期（PFI）的 Cox 回归分析（图 2D、2F）。热图汇总结果进一步可视化了不同肿瘤类型中预后关联的方向与强度（图 2G–2I）。这些结果表明，MRC2 在多种癌症中普遍存在表达失调，并支持进一步聚焦分析其在胶质瘤中的潜在临床意义。<...

讨论

胶质瘤的标准治疗方案依赖于最大程度的安全切除，随后进行放疗和化疗，最常用的化疗药物是替莫唑胺⁴。然而，由于肿瘤常呈弥漫性浸润，往往限制了手术的完全切除，并导致不可避免的复发，尤其是在高级别胶质瘤中尤为明显^3,25。临床上已将多个分子特征——包括MGMT启动子甲基化、IDH突变、1p/19q共缺失以及EGFR改变——用于预后判断和治疗方案制定^26,27,28。然而，这些标志物在实际应用或生物学层面存在一定局限性，在许多情况下单独使用不足以实现准确的风险分层^26,27,28。因此，仍需发现更多能够提高预后分辨...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CDK4抗体	Proteintech Group, Inc., USA	11026-1-AP	用于Western印迹的一抗。RRID:AB_2078702。
抗CDK6抗体	Proteintech Group, Inc., USA	66278-1-Ig	用于Western印迹的一抗。RRID:AB_2881661。
抗E-钙黏蛋白抗体	Proteintech Group, Inc., USA	20874-1-AP	用于Western印迹的一抗。RRID:AB_10697811。
抗MRC2抗体	Proteintech Group, Inc., USA	86028-1-RR	用于Western印迹的一抗。RRID:AB_2879692。
抗N-钙黏蛋白抗体	Proteintech Group, Inc., USA	22018-1-AP	用于Western印迹的一抗。RRID:AB_2813891。
抗β-肌动蛋白抗体	Proteintech Group, Inc., USA	66009-1-Ig	用于Western印迹的上样对照抗体。RRID:AB_2687938。
抗β-连环蛋白抗体	Proteintech Group, Inc., USA	51067-2-AP	用于Western印迹的一抗。RRID:AB_2086128。
BCA蛋白检测试剂盒	碧云天生物技术, 中国	P0012	用于蛋白质浓度测定的BCA蛋白检测试剂盒。
细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories, 日本	CK04-500T	细胞活力/增殖检测。
化学发光成像系统	Uvitec Limited, 法国	Alliance Q9 Advanced Manual	用于Western印迹检测的图像采集系统。
CO2培养箱	通用实验设备	未指定	用于细胞培养的加湿CO2培养箱，培养条件为37 °C和5% CO2。
结晶紫溶液 (0.1%)	碧云天生物技术, 中国	C0121-100 mL	工作浓度为0.1%的结晶紫染色液。
DMEM高糖培养基	Gibco, 赛默飞世尔科技, 美国	C11995500BT	胶质瘤细胞培养的基础培养基。
胎牛血清 (FBS)	启晨生物, 中国	FSP500	细胞培养用血清添加剂。
GlioVis	gliovis.bioinfo.cnio.es	不适用	基于网络的脑肿瘤表达数据集可视化与分析平台，特别适用于胶质瘤。
GraphPad Prism	GraphPad Software, 美国	版本 10.4.0	统计分析与绘图软件。RRID:SCR_002798。
HEK293T细胞	中国科学院细胞库, 上海, 中国	GNHu43	用于慢病毒生产的包装细胞系。RRID:CVCL_0063。
HRP标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)	Proteintech Group, Inc., USA	SA00001-1	用于Western印迹的二抗。RRID:AB_2722565。
HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L)	Proteintech Group, Inc., USA	SA00001-2	用于Western印迹的二抗。RRID:AB_2722564。
人星形胶质细胞	中国科学院细胞库, 上海, 中国	未公开提供	作为非肿瘤对照的正常人星形胶质细胞；目录号未公开。
倒置显微镜	通用实验设备	未指定	用于迁移和侵袭实验图像采集的倒置显微镜。
Matrigel基质	Corning, 美国	354234	用于侵袭实验插件包被的基底膜基质。
酶标仪	通用实验设备	未指定	用于CCK-8实验中450 nm吸光度测定的酶标仪。
PAGE凝胶制备试剂盒, 10%	翌圣生物, 中国	PG212	SDS-PAGE凝胶制备试剂盒。
PAGE凝胶制备试剂盒, 7.5%	翌圣生物, 中国	PG111	SDS-PAGE凝胶制备试剂盒。
多聚甲醛溶液 (4%)	碧云天生物技术, 中国	P0099-100 mL	用于克隆形成及迁移/侵袭实验的4%多聚甲醛固定液。
青霉素-链霉素溶液	Gibco, 赛默飞世尔科技, 美国	15140163	细胞培养用抗生素添加剂。
聚凝胺	碧云天生物技术, 中国	C0351-1 mL	六亚甲基双胍溴化物溶液 (10 mg/mL)，用于促进慢病毒转导。
预染蛋白Marker	Elabscience, 中国	E-IR-R331	蛋白质分子量标准。
PrimeScript RT试剂盒	宝生物工程株式会社, 日本	RR047A	用于cDNA合成的反转录试剂盒。
嘌呤霉素	碧云天生物技术, 中国	ST551-10 mg	用于稳定敲低细胞筛选的盐酸嘌呤霉素。
PVDF膜	碧云天生物技术, 中国	FFP20	亲水性PVDF膜 (0.45 µm)，用于Western印迹转膜。
R	奥地利R统计计算基金会	版本 4.5.1	用于生物信息学分析的统计计算环境。RRID:SCR_001905。
RIPA裂解缓冲液	碧云天生物技术, 中国	P0013B	强效RIPA裂解缓冲液，用于蛋白质提取。
SDS-PAGE上样缓冲液 (5×)	碧云天生物技术, 中国	P0015L	蛋白质样品上样缓冲液。
SYBR Premix Ex Taq II	宝生物工程株式会社, 日本	RR066A	qPCR预混液。
Transwell小室, 8.0-µm孔径	Corning, 美国	3422	带有8.0 µm孔径聚碳酸酯膜的细胞培养小室；标准24孔格式，用于迁移和侵袭实验。
TRIzol试剂	Invitrogen, 赛默飞世尔科技, 美国	10296010CN	RNA提取试剂。
U251胶质瘤细胞	中国国家认证细胞库	SCSP-559	用于基因敲低和功能实验的人胶质瘤细胞系。RRID:CVCL_0021。
U87胶质瘤细胞	中国国家认证细胞库	SCSP-5432	用于基因敲低和功能实验的人胶质瘤细胞系。RRID:CVCL_0022。