调控SPRY2和miR-590-5p表达对人骨关节炎模型软骨细胞自噬的影响

摘要

在IL-1β诱导的C28/I2软骨细胞模型中，炎症应激增加了miR-590-5p的表达并降低了SPRY2的表达水平。调控该信号轴可改变Beclin-1、LC3-II和Bcl-2的表达，提示可能存在一条miR-590-5p/SPRY2调控通路，该通路可能影响骨关节炎中的自噬相关反应及软骨细胞存活。

摘要

骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是软骨进行性破坏以及软骨细胞稳态的丧失。尽管自噬失调参与了OA的发病过程，但调控软骨细胞中自噬相关反应的分子机制尚未完全阐明。本研究利用IL-1β诱导的C28/I2人源软骨细胞，探讨了miR-590-5p/SPRY2调控轴在炎症性OA微环境中的作用。 体外 通过用IL-1β处理C28/I2细胞建立骨关节炎（OA）模型。采用定量PCR和Western印迹法检测miR-590-5p和SPRY2的表达水平。利用 gain-和 loss-of-function 方法评估SPRY2和miR-590-5p对自噬相关标志物Beclin-1和LC3-II以及生存相关蛋白Bcl-2的影响。通过生物信息学分析和挽救实验探究miR-590-5p与SPRY2之间的调控关系。IL-1β处理显著上调miR-590-5p表达，同时降低SPRY2的mRNA和蛋白水平（P < 0.05）。过表达miR-590-5p可抑制SPRY2表达，并促进Beclin-1、LC3-II和Bcl-2的表达。而SPRY2过表达则逆转miR-590-5p过表达引起的上述效应。研究结果表明，miR-590-5p通过靶向SPRY2促进自噬和细胞存活，从而在体外OA模型中发挥保护作用。 miR-590-5p，SPRY2，骨关节炎，自噬，C28/I2细胞，IL-1β < 0.05）。SPRY2 过表达显著降低了 Beclin-1 和 LC3-II 的表达水平，分别减少了约 65% 和 77%（P < 0.05）。相反，miR-590-5p 过表达增加了 Beclin-1、LC3-II 和 Bcl-2 的表达，而抑制 miR-590-5p 则逆转了这些效应并恢复了 SPRY2 的表达。功能分析支持 SPRY2 是 miR-590-5p 的一个潜在下游调控靶点。这些发现表明，在炎症条件下，miR-590-5p/SPRY2 轴是自噬相关标志物表达和软骨细胞存活的重要调控因子，并提示其在骨关节炎（OA）中具有作为治疗靶点的潜在意义。

引言

作为全球最常见的关节炎类型，骨关节炎（OA）是导致疼痛、活动能力受损和身体残疾的主要原因，给医疗系统和社会带来巨大负担¹。从病理学角度看，OA的特征是关节软骨进行性退化、滑膜炎症以及软骨下骨的病理性重塑¹。流行病学估计表明，全球约有3.03亿人受OA影响，且随着人口老龄化和肥胖率上升，这一数字预计将继续增长²。在中国，有症状的膝骨关节炎患病率估计为8.1%，其中女性和农村人群的患病率明显更高³。尽管OA患病率很高，目前的治疗选择仍主要局限于使用非甾体抗炎药（NSAIDs）缓解症状，以及对晚期疾病采取手术干预⁴。尚无疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）可用，反映出人们对调控软骨细胞稳态与存活的分子机制仍缺乏完整认识⁵。

关节软骨的结构和功能完整性依赖于定居的软骨细胞，这些细胞通过合成代谢与分解代谢活动之间的平衡来维持细胞外基质（ECM）的更新⁶。在骨关节炎（OA）进展过程中，软骨细胞会暴露于异常的机械应力和促炎介质，特别是白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这些因素促使细胞从基质合成转向基质降解⁶。IL-1β通过促进基质金属蛋白酶（MMPs）和聚集蛋白聚糖酶的产生，同时抑制II型胶原和蛋白聚糖的合成，从而导致软骨破坏⁷。此外，IL-1β可诱导氧化应激和线粒体功能障碍，进而引起软骨细胞凋亡和衰老⁸。因此，识别在炎症条件下调控软骨细胞存活的细胞内信号通路，仍是骨关节炎研究的重点方向。

自噬是一种在进化上保守的溶酶体降解途径，通过清除和再利用受损细胞器及蛋白质聚集体来维持细胞稳态⁹。基础自噬对细胞存活和能量平衡至关重要；然而，自噬失调可能促进疾病进展⁹。在骨关节炎（OA）中，自噬通常被视为一种保护性反应，有助于软骨细胞适应细胞应激并抵抗凋亡¹⁰。既往研究表明，自噬活性在OA进展过程中下降，尤其是在疾病晚期，导致细胞质量控制功能受损和软骨细胞丢失增加¹¹。多种蛋白质常被用作自噬相关活性的指标。Beclin-1参与自噬小体的启动，而微管相关蛋白1轻链3（LC3-I转化为LC3-II）的转换则被广泛用作自噬小体形成的标志物¹²。相反，B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）可抑制Beclin-1依赖性自噬，同时发挥抗凋亡作用¹³。然而，解读自噬相关标志物时需谨慎，因为对LC3-II和Beclin-1的静态测量无法独立区分自噬小体形成增强与溶酶体降解障碍。尽管存在这些局限性，调控自噬相关通路仍是治疗OA的有前景策略。

microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，可通过与靶信使RNA（mRNA）的3′-非翻译区（3′-UTR）中的互补序列结合，在转录后水平调控基因表达，从而导致mRNA降解或翻译抑制¹⁴。已有研究表明，miRNA表达异常通过影响炎症反应、细胞凋亡及细胞外基质（ECM）重塑等过程，参与骨关节炎（OA）的发病机制¹⁵。在众多miRNA中，miR-590-5p因其在骨代谢及其他病理过程中的调控作用而受到关注。既往研究显示，miR-590-5p可促进间充质干细胞的成骨分化，并抑制其脂肪生成¹⁶。在癌症模型中，miR-590-5p的功能具有环境依赖性，既可作为促癌因子，也可发挥抑癌作用¹⁷。此外，包括miR-590家族成员在内的microRNA表达谱改变，已被证实参与OA过程中关节组织的病理性重塑¹⁸。然而，来源于干细胞或癌症模型的研究证据尚不能直接外推至成熟的关节软骨细胞。因此，miR-590-5p在炎症性OA微环境中调控软骨细胞反应的具体作用仍有待进一步阐明。

为了研究miR-590-5p在骨关节炎（OA）中可能的下游作用机制，进行了in silico靶点预测分析，鉴定出Sprouty2（SPRY2）为一个潜在的下游靶基因。SPRY2属于Sprouty蛋白家族，该家族可负向调控受体酪氨酸激酶信号通路，并抑制RAS/MAPK/ERK通路的激活¹⁹。由于MAPK信号通路影响软骨细胞分化、炎症反应和自噬过程，SPRY2可能是OA病理生理中的一个重要调控节点²⁰。既往研究表明，SPRY2可在类风湿性关节炎模型中抑制炎症反应²¹，参与上皮系统中与凋亡相关的调控²²，并在缺血性损伤模型中与自噬相关反应相关联²³。尽管这些发现提示SPRY2参与调控细胞凋亡和自噬过程，但其在关节软骨细胞中的作用仍尚不明确。因此，本研究假设miR-590-5p与SPRY2构成一个调控轴，影响软骨细胞在炎症应激条件下的存活。

基于这些观察结果，研究提出miR-590-5p通过调控SPRY2的表达来调节软骨细胞中与自噬相关的反应。尽管miR-590-5p和SPRY2在其他生物学背景下已被分别研究，但它们在骨关节炎（OA）软骨细胞中的功能关系尚未明确。在本研究中，采用白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的C28/I2人源软骨细胞OA模型，检测miR-590-5p和SPRY2的表达模式，并评估其对Beclin-1、LC3-II和Bcl-2表达的影响。通过探究miR-590-5p/SPRY2调控轴，本研究揭示了软骨细胞存活相关的表观遗传机制，并为骨关节炎提供了潜在的治疗靶点。

方案

本研究 exclusively 采用 commercially available 的人软骨细胞系 C28/I2 进行。研究中未涉及人类受试者、人体组织样本、患者来源材料或活体动物。因此，根据机构和国家指南，无需获得机构审查委员会（IRB）批准和机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。实验方案中使用到的工具、化学品、试剂盒和试剂均列于材料表中。

1. 细胞培养与骨关节炎模型构建 

人软骨细胞系 C28/I2（材料表中提供详细信息）购自商业供应商。为确保实验的可重复性，细胞通过短串联重复序列（STR）分型进行鉴定，并常规检测以确认无支原体污染。所有实验均使用传代 3 至 8 代之间的细胞。细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中培养（所有培养试剂详见材料表），培养条件为 37 °C、5% CO₂ 的加湿环境。

建立 体外 骨关节炎（OA）模型中，使用重组人IL-1β刺激C28/I2细胞。依据已有文献报道^6,7为初步进行剂量-反应优化实验，旨在诱导强烈的分解代谢状态同时避免过度的即时细胞毒性，细胞经20 ng/mL IL-1β处理24小时。

2. 实验分组与转染 

为了阐明其作用机制，本研究分为三个主要实验模块，每个模块至少包含三个独立的生物学重复：

1. SPRY2 功能获得/缺失：
   将细胞分为对照组、骨关节炎（OA）模型组、OA + 空载体（NC）组、OA + SPRY2 过表达质粒（OE-SPRY2）组，以及相应的小干扰RNA组（si-NC 和三种特异性 si-SPRY2 构建体：si-695、si-800、si-896），以筛选干扰效率。
2. miR-590-5p 调控：
   将细胞分为对照组、OA 模型组、OA + 模拟物阴性对照（mimic NC）组、OA + miR-590-5p 模拟物（mimic）组、OA + 抑制剂阴性对照（inhibitor NC）组，以及 OA + miR-590-5p 抑制剂（inhibitor）组。
3. miR-590-5p/SPRY2 调控关系的功能验证：
   为进一步评估 miR-590-5p 与 SPRY2 之间假定的调控关系，对细胞施加 miR-590-5p 模拟物和抑制剂处理，以确定在 OA 模型中调控 miR-590-5p 是否改变 SPRY2 的表达水平。
   转染时，将 C28/I2 细胞以每孔 2 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 6 孔板中。待细胞融合度达到 70%–80% 时，根据制造商说明书及软骨细胞中小 RNA 递送的既定方法，使用商用脂质体转染试剂进行转染²⁴。简言之，将质粒（OE-SPRY2 和 NC；2 µg/孔）和寡核苷酸（miR-590-5p 模拟物/抑制剂及 siRNA；50 nM）溶于低血清培养基中，脂质体-核酸复合物于室温孵育 15 分钟后逐滴加入无血清 DMEM 培养基中的细胞。转染 6 小时后，更换为含 10% 胎牛血清（FBS）的完全 DMEM 培养基，继续培养 48 小时后提取 RNA 和蛋白质。

3. qPCR 检测

使用专用的miRNA提取试剂盒，按照制造商的说明书分离总RNA和miRNA。采用紫外-可见分光光度计测定RNA的纯度和浓度，选择A260/A280比值为1.8–2.0的样品用于后续分析。使用商业化的逆转录试剂合成cDNA。qPCR扩增程序如下：95 °C预变性10 min；进行40个循环，每个循环为95 °C变性10 s、58 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；随后进行熔解曲线分析，以验证引物特异性并排除引物二聚体的形成。β-actin和U6分别作为mRNA和miRNA的内参对照。相对基因表达水平采用2-^ΔΔCt法²⁵计算。所有引物序列，包括Col-II、SPRY2、Beclin-1、LC3、Bcl-2、miR-590-5p及内参基因的引物序列，均列于表1中。

引物名称	上游引物 (5′-3′)	下游引物 (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAGAAGATT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGCGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actin	TGGCACCCAGCACAATGAA	CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAAGAT	TGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
Bcl-2	TGGGATTCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1	TCCCGTGGAATGGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-II	CATCCAACCAAAATCCCGGT	GAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

表1：用于定量PCR（qPCR）分析的引物序列。 用于通过qPCR扩增和定量目标转录本及内参对照的正向和反向引物序列。

除非另有说明，数据均表示为均值 ± 标准差（SD）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合S-N-K事后检验来确定统计学显著性。符号说明：*P < 0.05 与对照组比较；#P < 0.05 与指定模型组或阴性对照组比较；&P < 0.05 与OA+Inhibitor-NC组比较。

4. 蛋白质印迹检测

细胞经收集后，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解，按照既定的蛋白质提取和免疫印迹实验流程进行操作。离心条件为14,000 × g × g 在4 °C下离心15分钟以去除细胞碎片，收集上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒定量蛋白浓度。取等量蛋白裂解液（30 µg）进行变性，通过SDS-PAGE电泳分离1.5小时，然后在300 mA电流下转移至PVDF膜上1.5小时²⁶膜在含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）中加入5%脱脂奶粉，室温封闭1小时，随后与特异性一抗（如抗SPRY2抗体，1:1000稀释）在4 °C孵育16小时。TBST洗涤三次后，膜与相应的HRP标记二抗在室温孵育2小时。使用ECL检测系统显影蛋白条带，并用ImageJ软件进行定量分析。

5. 统计分析

数据采用统计分析软件进行分析。所有实验均至少进行三次独立的生物学重复（n ≥ 3），定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。在进行参数检验前，使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性，并检验方差齐性。多个组间的统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行评估，随后采用Student-Newman-Keuls（S-N-K）事后检验进行多重比较。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

体外软骨细胞炎症模型的建立

为了研究骨关节炎病理背后的分子机制，一种 体外 采用经IL-1刺激的C28/I2人软骨细胞建立炎症模型β通过评估透明软骨细胞外基质的主要成分、健康软骨细胞标志物——II型胶原α1链（Col-II）的表达，验证了该模型的有效性。定量分析显示，经IL-1处理后β 与对照组相比，导致II型胶原mRNA表达量出现具有统计学意义的下降。该表型改变提示细胞正向类似于骨关节炎微环境的分解代谢状态发生初始转变，从而为后续的机制研究提供了基础模型。图1).

图1建立 体外 人软骨细胞C28/I2中的骨关节炎（OA）模型 细胞用 20 ng/mL IL-1 处理β 24小时。通过qPCR检测Col-II的相对mRNA表达水平， β-actin 作为归一化对照。数据以均值表示 ± 三个独立生物学重复的标准差（SD）（n = 3）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行。*P < 0.05 与对照组相比。 请点击此处以查看此图的放大版本。

验证 SPRY2 在 C28/I2 细胞中的过表达效率

在评估Sprouty2（SPRY2）在此模型中的功能作用之前，首先验证了SPRY2过表达载体的转染效率。软骨细胞分别转染过表达质粒（OE）或阴性对照空载体（NC）。qPCR和Western blot分析均显示，与NC组和未处理对照组相比，OE组中SPRY2在mRNA和蛋白水平均显著上调。如图2所示，这些数据证实实验体系能够维持SPRY2的高表达水平，从而可进一步研究其特定的生物学效应。

图2：验证 SPRY2 在 C28/I2 软骨细胞中的过表达。 细胞被转染了空载体（NC）或 SPRY2 过表达质粒（OE）。检测了 SPRY2 的相对 mRNA 和蛋白水平 通过 qPCR 和 Western 印迹法。 β-actin 用作内参对照。数据以均值表示 ± SD（n = 3). *P < 0.05 与NC组相比。 请点击此处以查看此图的放大版本。

SPRY2 过表达在炎症条件下减弱自噬并调节凋亡标志物

后续实验旨在确定 SPRY2 是否在炎症环境下作为自噬和凋亡的调控因子发挥作用。在建立骨关节炎（OA）模型后，单独使用 IL-1β 处理显著增加了自噬标志物 Beclin-1 和 LC3-II 的表达水平，提示在炎症应激下发生了代偿性自噬反应。同时，模型组中 Bcl-2 的表达也升高。然而，引入 SPRY2 过表达载体后，这一表达谱发生了显著改变。如图3所示，与模型组和 Model+NC 组相比，Model+OE-SPRY2 组中 Beclin-1 和 LC3-II 的 mRNA 水平均显著降低。此外，SPRY2 过表达抑制了炎症诱导的 Bcl-2 升高。这些结果表明，SPRY2 在炎症性软骨细胞中负向调控自噬相关标志物的表达。

图3：SPRY2过表达在IL-1β诱导的炎症条件下减弱自噬并调节凋亡标志物。通过qPCR检测对照组、模型组（IL-1β处理）、模型+NC组和模型+OE-SPRY2组中SPRY2、Bcl-2、Beclin-1和LC3-II的相对mRNA表达水平。以β-actin作为内参。数据以均值±标准差表示（n = 3）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合S-N-K事后检验确定统计学显著性。*P < 0.05，与对照组比较；#P < 0.05，与模型+NC组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

miR-590-5p 上调自噬相关标志物并促进软骨细胞存活

接下来，研究了miR-590-5p对自噬相关和生存相关标志物的功能影响。如图4所示，在骨关节炎（OA）模型中转染miR-590-5p模拟物后，Bcl-2、Beclin-1和LC3-II的表达显著升高，这与SPRY2过表达后观察到的抑制效应形成对比。相反，抑制miR-590-5p则显著降低了Bcl-2和Beclin-1的表达，而LC3-II的下降未达到统计学显著性。这些结果表明，miR-590-5p可增加软骨细胞中自噬相关标志物及生存相关蛋白Bcl-2的表达，提示其潜在的下游调控靶点值得进一步研究。

图4：miR-590-5p 增加自噬相关标志物表达及生存相关蛋白 Bcl-2 的表达。 在骨关节炎（OA）模型中，转染 miR-590-5p 模拟物、抑制剂或相应的阴性对照（NC）后，通过 qPCR 检测 Bcl-2、Beclin-1 和 LC3-II 的相对 mRNA 表达水平。以 β-actin 作为归一化对照。数据以均值 ± 标准差表示（n = 3）。*P < 0.05，与 Model+Mimic-NC 组比较；#P < 0.05，与 Model+Inhibitor-NC 组比较（针对 Bcl-2 和 Beclin-1）。请点击此处查看该图的放大版本。

IL-1β 调控 miR-590-5p/SPRY2 轴及自噬相关标志物的表达 

为了阐明调控 SPRY2 的上游机制及其与 miR-590-5p 的关系，研究了在炎症条件下两者的表达谱。在对 IL-1β 诱导的 C28/I2 细胞模型进行形态学观察后（图 5A），验证了 SPRY2 基因操作的转染效率。qPCR 和 Western blot 分析均证实，与各自对照组相比，过表达（OE）组中 SPRY2 表达显著上调，而小干扰 RNA（siRNA）各组中 SPRY2 成功敲低（图 5B 和 5C）。相反，IL-1β 处理后，miR-590-5p 水平显著上调。

图5：SPRY2转染效率的形态学观察与验证。（A）经IL-1β处理后C28/I2细胞的形态学观察（20×，相差显微图像）。（B）对照组（Control）、阴性对照组（NC）及SPRY2过表达（OE）组中SPRY2的相对mRNA和蛋白表达水平。（C）代表性Western blot图像，证实SPRY2过表达（左图）以及通过特异性siRNA（si-896、si-800、si-695）实现SPRY2敲低（右图），并与对照组比较。β-actin作为内参对照。数据以均值±标准差表示（n = 3）。*P < 0.05，与对照组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

为了确定这种反向表达模式是否反映了一种潜在的调控关系，使用 TargetScan Human 7.1 鉴定了人 SPRY2 3′-非翻译区（3′-UTR）内（核苷酸 236–243）一个 8 个核苷酸长度的 hsa-miR-590-5p 潜在结合位点。 图 6 中的序列比对显示了预测的种子区互补性。随后进行挽救实验，以功能性地检测 miR-590-5p 的调控是否改变了骨关节炎（OA）模型中 SPRY2 的表达水平。在确认 miR-590-5p 模拟物和抑制剂的转染效率后（图 7A、B），挽救实验表明，miR-590-5p 抑制可逆转 OA 相关的 SPRY2 mRNA 表达下调（图 7C）。miR-590-5p 模拟物未能进一步降低 IL-1β 所引起的显著抑制水平下的 SPRY2 表达，而 miR-590-5p 抑制则相对于抑制剂阴性对照显著提高了 SPRY2 的表达水平。这些结果支持在炎症性软骨细胞中，miR-590-5p 与 SPRY2 之间存在一种反向的、潜在的调控关系。

图6：in silico 预测假定的 miR-590-5p/SPRY2 调控相互作用。采用 TargetScan Human 7.1^31,32 进行生物信息学分析，以鉴定假定的 miRNA 结合位点。示意图展示了 hsa-miR-590-5p 与人源 SPRY2 3′-非翻译区（核苷酸 236–243）之间预测的序列比对及种子区域互补性。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：miR-590-5p 调控对软骨细胞中 SPRY2 表达的影响。通过qPCR检测miR-590-5p模拟物（A）和抑制剂（B）相对于各自对照组的转染效率。(C) 在骨关节炎（OA）模型中，经miR-590-5p调控后，检测各指定实验组中SPRY2 mRNA的相对表达水平。U6和β-actin分别作为miRNA和mRNA定量的内参对照。数据以均值±标准差表示（n = 3）。*P < 0.05，与对照组比较；#P < 0.05，与相应的Mimic-NC或Inhibitor-NC组比较；&P < 0.05，与OA+Inhibitor-NC组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

与 图4 中的结果一致，自噬相关标志物的变化与SPRY2表达降低所预期的效果相吻合，提示miR-590-5p可能通过解除SPRY2介导的抑制作用来增强其表达。综上所述，这些发现支持一个假定的信号轴：IL-1β上调miR-590-5p，miR-590-5p抑制SPRY2表达，而SPRY2水平降低与Beclin-1和LC3-II标志物表达增加相关。

数据可用性：

本研究的数据见补充文件1。

补充文件 1： 本研究使用的所有数据集，包括 qPCR 原始数据、Western blot 原始图像以及统计分析结果。请点击此处下载该文件。

讨论

先前的研究表明，miRNA 在自噬的多个阶段发挥调控作用，包括起始、囊泡延伸和成熟阶段。²⁷miRNA 在骨关节炎发病机制中的作用已有越来越多的报道，尤其是在炎症、细胞凋亡、细胞外基质重塑以及自噬相关通路中的影响。miR-590-5p 已被发现与细胞稳态及癌症相关过程有关^28,29,30在骨骼和软骨相关研究中，miR-590-5p 被报道可促进人骨髓间充质干细胞的软骨向分化16，而在骨关节炎软骨细胞模型中，其可通过靶向 FGF 调控细胞增殖、凋亡及炎症反应^18,24然而，miR-590-5p 是否影响骨关节炎软骨细胞中与自噬相关反应仍不明确。

因此，利用RNAInter和TargetScan探索潜在的下游中介分子，两种分析均提示SPRY2是miR-590-5p的潜在靶基因。TargetScan Human 7.1^31,32鉴定出在SPRY2 3′-非翻译区（UTR）第236–243位核苷酸处存在一个预测的8碱基种子区结合位点（图6）。SPRY2是受体酪氨酸激酶/MAPK信号通路的负调控因子，在多种组织中均有表达¹⁹。已有报道显示，关节内SPRY2基因转移可减轻佐剂诱导的大鼠关节炎²¹。SPRY2过表达可抑制HGF/SF介导的细胞生长、侵袭、迁移和胞质分裂³³，而Spry2功能缺失则与MAPK-ERK通路过度激活及B细胞增殖增加相关³⁴。此外，SPRY2还参与凋亡相关调控²²、miRNA相关的迁移控制³⁵以及缺血模型中的自噬相关反应²³。综上所述，这些研究支持SPRY2作为一个调控节点，连接炎症信号、生存相关通路以及自噬相关反应。

鉴于既往研究尚未报道 miR-590-5p 与 SPRY2 在骨关节炎软骨细胞中的关系，生物信息学预测提示二者可能存在相互作用，从而促使进一步实验验证。本研究结果显示，在 IL-1β 刺激的 C28/I2 软骨细胞中，SPRY2 显著下调，而 miR-590-5p 上调，提示该调控轴可能参与炎症状态下软骨细胞的应答反应。功能实验表明，SPRY2 过表达可降低 Beclin-1 和 LC3-II 的表达水平，支持其对自噬相关标志物表达具有抑制作用。相反，抑制 miR-590-5p 可减少 Beclin-1 和 Bcl-2 的表达，并恢复 SPRY2 的表达水平，符合二者之间存在潜在负向调控关系。由于 Bcl-2 既可抑制 Beclin-1 依赖性自噬，又具有抗凋亡作用13，因此在本研究中 Bcl-2 与 Beclin-1 和 LC3-II 同时升高，需结合具体生物学背景进行解读。在该炎症性骨关节炎模型中，Bcl-2 的上调可能主要反映与细胞存活相关的抗凋亡反应，而 Beclin-1 和 LC3-II 表达增加则可能反映 SPRY2 相关抑制作用的解除。上述结果提示一种机制模型：在炎症应激条件下，miR-590-5p 通过抑制 SPRY2，协调调控软骨细胞存活相关信号通路及自噬标志物的表达。

尽管本研究为miR-590-5p/SPRY2轴的机制提供了有价值的见解，但仍需承认存在若干局限性。首先，所有实验均在二维（2D）条件下进行 体外 使用永生化C28/I2细胞系构建的系统。该简化模型无法完全重现关节软骨的生物力学应力、多细胞相互作用及炎症微环境 在体，限制了研究结果的即时转化应用价值。第二，尽管生物信息学预测和挽救实验支持miR-590-5p与SPRY2之间存在潜在的调控关系，但缺乏双荧光素酶报告基因实验，因此无法确证miR-590-5p与SPRY2 3′-非翻译区（3′-UTR）之间的直接物理结合。第三，对Beclin-1和LC3-II的静态检测无法区分自噬小体生成增加与自噬溶酶体降解受阻；因此，未来研究应采用巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1）处理或串联荧光报告系统等方法评估自噬流。未来的工作还应包括更广泛的骨关节炎表型标志物（如MMP13和ADAMTS5）、原代人软骨细胞以及三维软骨组织外植体模型，并 体内 通过内侧半月板失稳化建立骨关节炎模型，以评估miR-590-5p和SPRY2调控的长期效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Anti-β-actin 抗体	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Western 印迹分析的内参对照
SPRY2 抗体	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	检测 SPRY2 蛋白表达水平
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225	总蛋白浓度测定
C28/I2 人软骨细胞系	Punocel	CP-H107	骨关节炎研究的体外软骨细胞模型
完全 DMEM 培养基	KeyGen Biotec	KGM12800S	常规细胞培养的基础培养基
CWBIO 超纯 miRNA 提取试剂盒	CWBIO	CW0627S	总 RNA 和 miRNA 的分离
ECL 检测系统	Thermo Fisher Scientific	32106	蛋白条带的化学发光显影
胎牛血清（FBS）	Gibco	1891605	细胞培养生长添加剂
GraphPad Prism 9.0 版	GraphPad Software	N/A	统计分析与图表绘制
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	mRNA 逆转录为 cDNA
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）	N/A	Western 印迹条带强度的定量分析
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	质粒和寡核苷酸的转染
miR-590-5p 模拟物、抑制剂及阴性对照（NCs）	RiboBio	定制合成	调控 miR-590-5p 的表达水平
miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒	Vazyme	MR101-02	miRNA 逆转录为 cDNA
Opti-MEM 培养基	Gibco	31985-062	转染复合物的配制
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	防止细胞培养中的细菌污染
蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物	MedChemExpress	HY-K0010	蛋白提取过程中的蛋白保护
PVDF 膜	Millipore Sigma	ISEQ00010	免疫印迹中的蛋白转膜膜
重组人 IL-1β	MedChemExpress	HY-P78459	诱导类骨关节炎炎症状态
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime	P0013B	细胞裂解与蛋白提取
si-SPRY2 构建体及阴性对照 si-NC	GenePharma	定制合成	敲低 SPRY2 的表达
SPRY2 过表达质粒（OE）及空载体（NC）	GeneChem	定制构建	评估 SPRY2 过表达效应
紫外-可见分光光度计（NanoDrop 2000）	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	RNA 浓度与纯度测定