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研究文章

调控SPRY2和miR-590-5p表达对人骨关节炎模型软骨细胞自噬的影响

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DOI：

10.3791/70883

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2026年7月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在IL-1β诱导的C28/I2软骨细胞模型中，炎症应激增加了miR-590-5p的表达并降低了SPRY2的表达水平。调控该信号轴可改变Beclin-1、LC3-II和Bcl-2的表达，提示可能存在一条miR-590-5p/SPRY2调控通路，该通路可能影响骨关节炎中的自噬相关反应及软骨细胞存活。

摘要

骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是软骨进行性破坏以及软骨细胞稳态的丧失。尽管自噬失调参与了OA的发病过程，但调控软骨细胞中自噬相关反应的分子机制尚未完全阐明。本研究利用IL-1β诱导的C28/I2人源软骨细胞，探讨了miR-590-5p/SPRY2调控轴在炎症性OA微环境中的作用。 体外 通过用IL-1β处理C28/I2细胞建立骨关节炎（OA）模型。采用定量PCR和Western印迹法检测miR-590-5p和SPRY2的表达水平。利用 gain-和 loss-of-function 方法评估SPRY2和miR-590-5p对自噬相关标志物Beclin-1和LC3-II以及生存相关蛋白Bcl-2的影响。通过生物信息学分析和挽救实验探究miR-590-5p与SPRY2之间的调控关系。IL-1β处理显著上调miR-590-5p表达，同时降低SPRY2的mRNA和蛋白水平（P < 0.05）。过表达miR-590-5p可抑制SPRY2表达，并促进Beclin-1、LC3-II和Bcl-2的表达。而SPRY2过表达则逆转miR-590-5p过表达引起的上述效应。研究结果表明，miR-590-5p通过靶向SPRY2促进自噬和细胞存活，从而在体外OA模型中发挥保护作用。 miR-590-5p，SPRY2，骨关节炎，自噬，C28/I2细胞，IL-1β < 0.05）。SPRY2 过表达显著降低了 Beclin-1 和 LC3-II 的表达水平，分别减少了约 65% 和 77%（P < 0.05）。相反，miR-590-5p 过表达增加了 Beclin-1、LC3-II 和 Bcl-2 的表达，而抑制 miR-590-5p 则逆转了这些效应并恢复了 SPRY2 的表达。功能分析支持 SPRY2 是 miR-590-5p 的一个潜在下游调控靶点。这些发现表明，在炎症条件下，miR-590-5p/SPRY2 轴是自噬相关标志物表达和软骨细胞存活的重要调控因子，并提示其在骨关节炎（OA）中具有作为治疗靶点的潜在意义。

引言

作为全球最常见的关节炎类型，骨关节炎（OA）是导致疼痛、活动能力受损和身体残疾的主要原因，给医疗系统和社会带来巨大负担1。从病理学角度看，OA的特征是关节软骨进行性退化、滑膜炎症以及软骨下骨的病理性重塑1。流行病学估计表明，全球约有3.03亿人受OA影响，且随着人口老龄化和肥胖率上升，这一数字预计将继续增长2。在中国，有症状的膝骨关节炎患病率估计为8.1%，其中女性和农村人群的患病率明显更高3。尽管OA患病率很高，目前的治疗选择仍主要局限于使用非甾体抗炎药（NSAIDs）缓解症状，以及对晚期疾病采取手术干预4。尚无疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）可用，反映出人们对调控软骨细胞稳态与存活的分子机制仍缺乏完整认识5。

关节软骨的结构和功能完整性依赖于定居的软骨细胞，这些细胞通过合成代谢与分解代谢活动之间的平衡来维持细胞外基质（ECM）的更新6。在骨关节炎（OA）进展过程中，软骨细胞会暴露于异常的机械应力和促炎介质，特别是白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这些因素促使细胞从基质合成转向基质降解6。IL-1β通过促进基质金属蛋白酶（MMPs）和聚集蛋白聚糖酶的产生，同时抑制II型胶原和蛋白聚糖的合成，从而导致软骨破坏7。此外，IL-1β可诱导氧化应激和线粒体功能障碍，进而引起软骨细胞凋亡和衰老8。因此，识别在炎症条件下调控软骨细胞存活的细胞内信号通路，仍是骨关节炎研究的重点方向。

自噬是一种在进化上保守的溶酶体降解途径，通过清除和再利用受损细胞器及蛋白质聚集体来维持细胞稳态9。基础自噬对细胞存活和能量平衡至关重要；然而，自噬失调可能促进疾病进展9。在骨关节炎（OA）中，自噬通常被视为一种保护性反应，有助于软骨细胞适应细胞应激并抵抗凋亡10。既往研究表明，自噬活性在OA进展过程中下降，尤其是在疾病晚期，导致细胞质量控制功能受损和软骨细胞丢失增加11。多种蛋白质常被用作自噬相关活性的指标。Beclin-1参与自噬小体的启动，而微管相关蛋白1轻链3（LC3-I转化为LC3-II）的转换则被广泛用作自噬小体形成的标志物12。相反，B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）可抑制Beclin-1依赖性自噬，同时发挥抗凋亡作用13。然而，解读自噬相关标志物时需谨慎，因为对LC3-II和Beclin-1的静态测量无法独立区分自噬小体形成增强与溶酶体降解障碍。尽管存在这些局限性，调控自噬相关通路仍是治疗OA的有前景策略。

microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，可通过与靶信使RNA（mRNA）的3′-非翻译区（3′-UTR）中的互补序列结合，在转录后水平调控基因表达，从而导致mRNA降解或翻译抑制14。已有研究表明，miRNA表达异常通过影响炎症反应、细胞凋亡及细胞外基质（ECM）重塑等过程，参与骨关节炎（OA）的发病机制15。在众多miRNA中，miR-590-5p因其在骨代谢及其他病理过程中的调控作用而受到关注。既往研究显示，miR-590-5p可促进间充质干细胞的成骨分化，并抑制其脂肪生成16。在癌症模型中，miR-590-5p的功能具有环境依赖性，既可作为促癌因子，也可发挥抑癌作用17。此外，包括miR-590家族成员在内的microRNA表达谱改变，已被证实参与OA过程中关节组织的病理性重塑18。然而，来源于干细胞或癌症模型的研究证据尚不能直接外推至成熟的关节软骨细胞。因此，miR-590-5p在炎症性OA微环境中调控软骨细胞反应的具体作用仍有待进一步阐明。

为了研究miR-590-5p在骨关节炎（OA）中可能的下游作用机制，进行了in silico靶点预测分析，鉴定出Sprouty2（SPRY2）为一个潜在的下游靶基因。SPRY2属于Sprouty蛋白家族，该家族可负向调控受体酪氨酸激酶信号通路，并抑制RAS/MAPK/ERK通路的激活19。由于MAPK信号通路影响软骨细胞分化、炎症反应和自噬过程，SPRY2可能是OA病理生理中的一个重要调控节点20。既往研究表明，SPRY2可在类风湿性关节炎模型中抑制炎症反应21，参与上皮系统中与凋亡相关的调控22，并在缺血性损伤模型中与自噬相关反应相关联23。尽管这些发现提示SPRY2参与调控细胞凋亡和自噬过程，但其在关节软骨细胞中的作用仍尚不明确。因此，本研究假设miR-590-5p与SPRY2构成一个调控轴，影响软骨细胞在炎症应激条件下的存活。

基于这些观察结果，研究提出miR-590-5p通过调控SPRY2的表达来调节软骨细胞中与自噬相关的反应。尽管miR-590-5p和SPRY2在其他生物学背景下已被分别研究，但它们在骨关节炎（OA）软骨细胞中的功能关系尚未明确。在本研究中，采用白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的C28/I2人源软骨细胞OA模型，检测miR-590-5p和SPRY2的表达模式，并评估其对Beclin-1、LC3-II和Bcl-2表达的影响。通过探究miR-590-5p/SPRY2调控轴，本研究揭示了软骨细胞存活相关的表观遗传机制，并为骨关节炎提供了潜在的治疗靶点。

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方案

本研究 exclusively 采用 commercially available 的人软骨细胞系 C28/I2 进行。研究中未涉及人类受试者、人体组织样本、患者来源材料或活体动物。因此，根据机构和国家指南，无需获得机构审查委员会（IRB）批准和机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。实验方案中使用到的工具、化学品、试剂盒和试剂均列于材料表中。

1. 细胞培养与骨关节炎模型构建 

人软骨细胞系 C28/I2（材料表中提供详细信息）购自商业供应商。为确保实验的可重复性，细胞通过短串联重复序列（STR）分型进行鉴定，并常规检测以确认无支原体污染。所有实验均使用传代 3 至 8 代之间的细胞。细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中培养（所有培养试剂详见材料表），培养条件为 37 °C、5% CO2 的加湿环境。

建立 体外 骨关节炎（OA）模型中，使用重组人IL-1β刺激C28/I2细胞。依据已有文献报道6,7为初步进行剂量-反应优化实验，旨在诱导强烈的分解代谢状态同时避免过度的即时细胞毒性，细胞经20 ng/mL IL-1β处理24小时。

2. 实验分组与转染 

为了阐明其作用机制，本研究分为三个主要实验模块，每个模块至少包含三个独立的生物学重复：

  1. SPRY2 功能获得/缺失：
    将细胞分为对照组、骨关节炎（OA）模型组、OA + 空载体（NC）组、OA + SPRY2 过表达质粒（OE-SPRY2）组，以及相应的小干扰RNA组（si-NC 和三种特异性 si-SPRY2 构建体：si-695、si-800、si-896），以筛选干扰效率。
  2. miR-590-5p 调控：
    将细胞分为对照组、OA 模型组、OA + 模拟物阴性对照（mimic NC）组、OA + miR-590-5p 模拟物（mimic）组、OA + 抑制剂阴性对照（inhibitor NC）组，以及 OA + miR-590-5p 抑制剂（inhibitor）组。
  3. miR-590-5p/SPRY2 调控关系的功能验证：
    为进一步评估 miR-590-5p 与 SPRY2 之间假定的调控关系，对细胞施加 miR-590-5p 模拟物和抑制剂处理，以确定在 OA 模型中调控 miR-590-5p 是否改变 SPRY2 的表达水平。
    转染时，将 C28/I2 细胞以每孔 2 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔板中。待细胞融合度达到 70%–80% 时，根据制造商说明书及软骨细胞中小 RNA 递送的既定方法，使用商用脂质体转染试剂进行转染24。简言之，将质粒（OE-SPRY2 和 NC；2 µg/孔）和寡核苷酸（miR-590-5p 模拟物/抑制剂及 siRNA；50 nM）溶于低血清培养基中，脂质体-核酸复合物于室温孵育 15 分钟后逐滴加入无血清 DMEM 培养基中的细胞。转染 6 小时后，更换为含 10% 胎牛血清（FBS）的完全 DMEM 培养基，继续培养 48 小时后提取 RNA 和蛋白质。

3. qPCR 检测

使用专用的miRNA提取试剂盒，按照制造商的说明书分离总RNA和miRNA。采用紫外-可见分光光度计测定RNA的纯度和浓度，选择A260/A280比值为1.8–2.0的样品用于后续分析。使用商业化的逆转录试剂合成cDNA。qPCR扩增程序如下：95 °C预变性10 min；进行40个循环，每个循环为95 °C变性10 s、58 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；随后进行熔解曲线分析，以验证引物特异性并排除引物二聚体的形成。β-actin和U6分别作为mRNA和miRNA的内参对照。相对基因表达水平采用2-ΔΔCt法25计算。所有引物序列，包括Col-II、SPRY2、Beclin-1、LC3、Bcl-2、miR-590-5p及内参基因的引物序列，均列于表1中。

引物名称 上游引物 (5′-3′)下游引物 (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

表1：用于定量PCR（qPCR）分析的引物序列。 用于通过qPCR扩增和定量目标转录本及内参对照的正向和反向引物序列。

除非另有说明，数据均表示为均值 ± 标准差（SD）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合S-N-K事后检验来确定统计学显著性。符号说明：*P < 0.05 与对照组比较；#P < 0.05 与指定模型组或阴性对照组比较；&P < 0.05 与OA+Inhibitor-NC组比较。

4. 蛋白质印迹检测

细胞经收集后，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解，按照既定的蛋白质提取和免疫印迹实验流程进行操作。离心条件为14,000 × g × g 在4 °C下离心15分钟以去除细胞碎片，收集上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒定量蛋白浓度。取等量蛋白裂解液（30 µg）进行变性，通过SDS-PAGE电泳分离1.5小时，然后在300 mA电流下转移至PVDF膜上1.5小时26膜在含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）中加入5%脱脂奶粉，室温封闭1小时，随后与特异性一抗（如抗SPRY2抗体，1:1000稀释）在4 °C孵育16小时。TBST洗涤三次后，膜与相应的HRP标记二抗在室温孵育2小时。使用ECL检测系统显影蛋白条带，并用ImageJ软件进行定量分析。

5. 统计分析

数据采用统计分析软件进行分析。所有实验均至少进行三次独立的生物学重复（n ≥ 3），定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。在进行参数检验前，使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性，并检验方差齐性。多个组间的统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行评估，随后采用Student-Newman-Keuls（S-N-K）事后检验进行多重比较。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。

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结果

体外软骨细胞炎症模型的建立

为了研究骨关节炎病理背后的分子机制，一种 体外 采用IL-1β刺激C28/I2人软骨细胞建立炎症模型。通过检测透明软骨细胞外基质主要成分——II型胶原α1链（Col-II）的表达水平验证该模型的有效性，Col-II是健康软骨细胞的标志性分子。定量分析显示，与对照组相比，IL-1β处理显著降低了Col-II mRNA的表达水平。这一表型改变提示软骨细胞初步向类似骨关节炎微环境的分解代谢状态转变，从而为后续的机制研究提供了基础模型。图1).

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讨论

先前的研究表明，miRNA 在自噬的多个阶段发挥调控作用，包括起始、囊泡延伸和成熟阶段。27miRNA 在骨关节炎发病机制中的作用已有越来越多的报道，尤其是在炎症、细胞凋亡、细胞外基质重塑以及自噬相关通路中的影响。miR-590-5p 已被发现与细胞稳态及癌症相关过程有关28,29,30在骨骼和软骨相关研究中，miR-590-5p 被报道可促进人骨髓间充质干细胞的软骨向分化16，而在骨关节炎软骨细胞模型中，其可通过靶向 FGF 调控细胞增殖、凋亡及炎症反应18,24然而，miR-590-5p 是否影响骨关节炎软骨细胞中与自噬相关反应仍不明确。

因此，利用RNAInter和TargetScan探索潜在的下游中介分子，两种分析均提示SPR...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢广西中医药大学瑞康医院老年病科为本研究提供了实验设施和技术支持。作者还感谢实验室工作人员和同事在数据收集与分析方面给予的帮助。本研究得到广西中医药大学自然科学基金项目（项目编号：2022MS039；长链非编码RNA-GAS5通过介导SPRY2表达抑制小鼠膝骨关节炎软骨细胞自噬：化瘀祛湿方的作用机制及早期干预效应）和国家自然科学基金区域创新发展联合基金（项目编号：82160912；Skp2介导FoxO1泛素化降解抑制膝骨关节炎软骨细胞自噬的机制探讨及化瘀祛湿方早期干预作用）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Anti-β-actin 抗体Proteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Western 印迹分析的内参对照
SPRY2 抗体Proteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324检测 SPRY2 蛋白表达水平
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher Scientific23225总蛋白浓度测定
C28/I2 人软骨细胞系PunocelCP-H107骨关节炎研究的体外软骨细胞模型
完全 DMEM 培养基KeyGen BiotecKGM12800S常规细胞培养的基础培养基
CWBIO 超纯 miRNA 提取试剂盒CWBIOCW0627S总 RNA 和 miRNA 的分离
ECL 检测系统Thermo Fisher Scientific32106蛋白条带的化学发光显影
胎牛血清（FBS）Gibco1891605细胞培养生长添加剂
GraphPad Prism 9.0 版GraphPad SoftwareN/A统计分析与图表绘制
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01mRNA 逆转录为 cDNA
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）N/AWestern 印迹条带强度的定量分析
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015质粒和寡核苷酸的转染
miR-590-5p 模拟物、抑制剂及阴性对照（NCs）RiboBio定制合成调控 miR-590-5p 的表达水平
miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒VazymeMR101-02miRNA 逆转录为 cDNA
Opti-MEM 培养基Gibco31985-062转染复合物的配制
青霉素-链霉素Gibco15140122防止细胞培养中的细菌污染
蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物MedChemExpressHY-K0010蛋白提取过程中的蛋白保护
PVDF 膜Millipore SigmaISEQ00010免疫印迹中的蛋白转膜膜
重组人 IL-1βMedChemExpressHY-P78459诱导类骨关节炎炎症状态
RIPA 裂解缓冲液BeyotimeP0013B细胞裂解与蛋白提取
si-SPRY2 构建体及阴性对照 si-NCGenePharma定制合成敲低 SPRY2 的表达
SPRY2 过表达质粒（OE）及空载体（NC）GeneChem定制构建评估 SPRY2 过表达效应
紫外-可见分光光度计（NanoDrop 2000）Thermo Fisher ScientificND-2000RNA 浓度与纯度测定

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