利用分裂西兰花RNA报告细胞在 体外 RNA簇中分子间RNA碱基配对的可视化与定量

Summary

该方案描述了利用分裂西兰花RNA报告器进行体 外检测和定量RNA簇中分子间碱基配对的视觉测定。

Abstract

RNA聚集由多价分子间RNA–RNA相互作用驱动，可以在体 外 无蛋白质的情况下发生。虽然化学探测和计算模拟已被用于预测这些相互作用，但直接评估RNA簇中分子间碱基配对的方法仍然有限。本研究采用了基于分裂西兰花RNA报告细胞的视觉测定，这些报告细胞与感兴趣的荧光标记RNA结合。该检测方法使RNA簇中的分子间碱基配对能够检测和定量。分裂的西兰花系统包含互补的报告序列，这些序列二聚形成西兰花RNA适配体。由此产生的二聚化RNA结构结合DFHBI-1T，这是一种结合时发出绿色荧光的荧光团。RNA聚集时，绿色荧光的出现报告了由互补报告序列介导的碱基配对。测量DFHBI-1T荧光有助于定量评估体 外 RNA聚集条件如何影响这些报告序列之间的分子间碱基配对。

Introduction

体外转录RNA可通过添加盐类和分子拥挤试剂^{1、2、3、4、5}自组装成可见簇。值得注意的是，这些RNA簇可以在缺乏其他细胞成分（包括蛋白质）的情况下形成，表明在特定条件下，分子间RNA-RNA相互作用足以驱动体外RNA缩合。

在各种分子间RNA–RNA相互作用中，分子间碱基配对在凝聚态^场1,2,4,6,7,8,9,10中获得了大量关注。这些相互作用可能由转录本间暴露的互补序列（“邮编”）驱动，如丝状真菌Ashbya gossypii²中BNI1和SPA2 mRNA的共聚，或果蝇黑胃蝇中oskar mRNA的寡聚化 ^6,7 所示.或者，通过重塑RNA二级结构，促进分子间碱基配对，暴露出结构嵌入的互补序列。这一机制已在silico⁹中的重复RNA和体外的胍苷核糖开关中观察^到。暴露的互补序列和RNA结构重塑均可通过化学探测^11,12或模拟方法^4,9,13,14进行测量。然而，在体外RNA聚类测定中直接观察分子间碱基配对的方法仍然有限。

使用碱基配对交联剂^15、16、17和凝胶电泳4^、6、7的RNA拉下分析法常用于体外研究分子间RNA碱基配对。然而，这些方法缺乏空间分辨率，无法区分簇内的碱基配对与簇外的碱基配对。此外，在技术上具有挑战性，因为在保持簇的稳定性的同时，还要确保缓冲液与后续检测的兼容性。

此前，基于分裂西兰花RNA报告¹⁸的视觉测定法，结合于感兴趣的荧光标记RNA，已被用于在体外4号RNA缩合过程中直接检测分子间碱基配^对。在此背景下，分裂西兰花系统报告了报告者之间或携带其RNA之间在特定体外聚集条件下分子间相互作用的可能性。因此，该检测探讨了序列环境和环境因素如何影响RNA簇状环境中分子间碱基配对的倾向。

分裂的西兰花系统由 上下 两段互补的RNA序列 组成，它们通过二聚体重组西兰花RNA即体（见图1A–C）¹⁸。二聚体结合后，aptamer与荧光团DFHBI-1T结合，产生绿色荧光（见图1A–C）¹⁸。利用该系统，RNA簇内报告互补序列间分子间碱基配对的程度被证明依赖于RNA折叠。通过比较不同实验条件下DFHBI-1T荧光与RNA水平的比例，可以定量评估体 外 条件对RNA簇中报告介导分子间碱基配对的影响。

该检测法补充了RNA拉下和凝胶电泳方法，用于研究RNA簇中分子间碱基配对。然而，强健的信号检测可能需要分子拥挤试剂，灵敏度受限于西兰花上下分裂RNA的二聚化和折叠效率。

Protocol

该协议提供了实现该检测的逐步方法，并讨论其应用。所用试剂和设备详列于 材料表中。

1. 制备用于体 外 RNA转录的DNA模板

1. 在每个包含分裂西兰花适配体序列的DNA模板5′端附加T7启动子序列，用于体外RNA转录。单独使用分裂的西兰花适体序列（顶部 和 底部），或插入T7启动子下游任意位置，可选择添加或不添加额外目标RNA序列。
   注意： 用于扩增DNA模板的T7启动子、分裂西兰花报告蛋白和引物序列列于 表1。
   注意： T7 RNA聚合酶强烈偏好在+1位点以“G”启动转录。在+2和+3位置下游立即存在额外的G可以提高转录产率¹⁹。然而，当下游序列以G开头时，如 顶部 和 底部 结构中以两个G开头，转录可以从不同位置^开始。因此，转录本在5′端可能携带一、二或三个G（如GATCC、GGATCC或GGGATCC），这可能影响设计构造中碱基配对的解释。
2. 使用商业合成的基因块、质粒或DNA片段作为PCR的模板。如果原始模板中没有T7启动子，则使用带有5英尺T7启动子突出的正向引子，并配合相应的反向引子。
3. 在200 μL PCR管中准备一个50 μL的PCR反应，管内各含2.5 μL的10 μM正向和反向引物、20 ng的DNA模板、25 μL 2×高精度主混合液和无核酸酶水。通过上下移液，在2000 × 克离心机中充分搅拌2秒。
4. 在热循环仪中运行PCR反应，程序如下：98°C30秒（1个循环）;98°C持续10秒，优化退火温度30秒，72°C冷却30秒/千碱（35次循环）;72°C，持续2分钟（1个周期）。
   注意： 使用在线工具如Tm计算器确定最佳退火温度。PCR产物完成后可储存在4°C。
5. 将2微升PCR产物与8微升无核酸酶水和2微升6×载染料混合。将混合物装入1%琼脂糖凝胶进行电泳。
   注意： PCR产物应呈现为单条。如果发现多条波段，应切除正确的波段，并用凝胶提取套件进行纯化后再进行。
6. 使用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物或凝胶提取的DNA，并在20–30微升无核酸酶水中洗脱至1.5毫升微离心管中。
7. 使用微体积分光光度计测量DNA浓度和纯度。确保A260/A280的分数约为1.8，A260/A230大于2.0。
   注意： 如果A260/A230低于2.0，则进行额外的纯化步骤。
8. 将DNA模板保存在−20°C，直到使用。

2. 体 外 RNA转录反应的制备

1. 用RNase消毒液擦拭工作表面、管架和移液器。使用无RNase、过滤过的吸头。
2. 解冻反应缓冲液和核苷酸溶液（ATP、CTP、GTP、UTP）与UTP-Cy5一起随T7转录试剂盒冰藏。使用前将所有管子以2000 ×克 离心2秒。
   注意： 保护UTP-Cy5免受光照伤害。
3. 计算DNA模板中胸腺嘧啶碱基数（不含T7启动子），并确定20微升转录反应所需的UTP和UTP-Cy5体积。保持RNA物种间标记密度的一致性。
   注意： 例如，要标记含有100个尿嘧啶碱基的RNA，约含三个Cy5标记尿嘧啶，加入4.5微升1 mM UTP-Cy5和1.9微升75 mM UTP。
4. 通过将ATP、CTP和GTP各2微升、UTP体积（均随试剂盒附带）、UTP-Cy5、2微升10×反应缓冲液、2微升酶混合物、200 ng DNA模板和无核酸酶水混合，制备20微升转录反应。通过上下移液，在2000 ×克 离心机中充分搅拌2秒。
5. 在37°C下孵育反应6小时。
6. 加入试剂盒附带的1微升DNase。通过上下移液，在2000 ×克 离心机下充分搅拌2秒。
7. 在37°C下再孵育15分钟。
8. 将反应（~20微升）转移到1.5毫升的管子中。加入试剂盒附带的115微升无核酸酶水和15微升醋酸铵封堵液。通过上下移液，在2000 ×克 离心机中充分混合，浸泡2秒。
   注意： 可使用商业RNA纯化试剂盒代替 步骤2.9–3.7。
9. 加入150微升酚/氯仿，轻轻混合。
   注意： 在化学排气柜中处理酚/氯仿。
10. 离心机在16,000 ×克 ，4°C下离心10分钟。
11. 将上层水相转移到新的管子上。
    注意： 避免扰动间期;下层可能因未掺入染料而呈现蓝色。
12. 加入等量的氯仿，充分搅拌均匀。
    注意： 在化学排气柜中处理氯仿。
13. 离心机在16,000克×4°C下离心2分钟。
14. 重复 步骤2.11–2.13。
15. 将水层（~100–150 μL）转移到新的管子中。加入900微升异丙醇并充分混合。
16. 将药液分成三个相等体积的容器，分别放在不同的管子中。
    注意： 每个分组足以进行多次RNA聚集反应。
17. 在−20°C下过夜或最长一个月保存。

3. 体 外 转录RNA的纯化

1. 将RNA样品置于异丙醇中，16,000 × g ，在4°C离心15分钟。
2. 小心地去除异丙醇，同时不扰动RNA沉淀。
3. 加入1毫升70%乙醇，用无核酸酶水调制。
4. 离心机在 16,000克× 4摄氏度下离心2分钟。
5. 去除乙醇，重复 步骤3.3–3.4。
6. 在最后的乙醇清洗过程中，使用1000微升移液器去除大部分乙醇。在工作台式微型离心机中以2000 ×克 短暂离心2秒，然后用20微升移液器去除剩余的乙醇。
7. 将RNA沉淀在室温（RT）下风干1–2分钟。
8. 将RNA沉淀重新悬浮在20微升无核酸酶水中。将样品冰藏并保护其免受光照。
9. 使用微体积分光光度计测量RNA浓度和纯度。确保A260/A280约为2.0，A260/A230大于2.0。

4. 体 外 RNA聚集反应的制备

注意：在本方案中，RNA聚集诱导需要精矿和PEG 8000，基于之前的研究^2,4,5。具体来说，将100 mM的四盐精精液在无核酸酶水中制备，被分装到多个1.5毫升微离心管中，并在−20°C下储存。

1. 冰上解冻一管100 mM的精液和50% PEG 8000。
   注意： 开封后，50%PEG 8000应使用不超过两个月，以免降解。
2. 为制备500微升新鲜制备的10×RNA重折叠缓冲液，将50微升2M KCl、50微升1M_MgCl2、50微升1M Tris（pH 7.0）和350微升无核酸酶水混合。通过上下移液彻底混合。在2000 克× 离心机中，工作台式微型离心机运行2秒。
   注意： 重折叠缓冲液应在RNA聚类实验当天准备。
   注意：步骤4.3-4.4取决于实验条件，并可根据需要进行调整。本研究中使用的两种RNA聚类条件示例如下。共折叠条件是从一种用于将反义寡核苷酸退火为RNA²的方法改良而来。该方法将RNA混合在盐缓冲液中并加热，以促进携带互补序列的RNA之间的分子间碱基配对。相比之下，在分离折叠条件下，每个RNA在混合前都单独折叠。该条件旨在模拟细胞内RNA在相互作用前被折叠的场景。
3. 共折叠
   注意： 该条件促进包含 顶 序列和 底 序列的RNA之间的分子间碱基配对。它作为RNA聚类条件下报告者驱动的分子间碱基配对的阳性对照。
   1. 在200微升PCR管中，将16 pmol体 外 转录RN（携带 顶部 或 底部 序列）、2微升10 μL×重折叠RNA缓冲液和无核酸酶水混合至最终体积14 μL。通过上下移液彻底混合。在2000克 × 离心机中，工作台式微型离心机中运行2秒。
      注意： 计算对应16 pmol的RNA质量。
   2. 将RNA样品加热至90°C，加热2分钟。
   3. 立即将样本转送至RT，并保护其免受光照照射。在RT下孵育反应1小时。
4. 分开折叠
   1. 将RNA样本加热至90°C2分钟，然后立即将其放入冰块中至少15分钟。
   2. 在200微升PCR管中，将16 pmol体 外 转录RNA（携带 顶部 或 底部 序列）、1微升10×重折叠RNA缓冲液和无核酸酶水混合至7微升的最终体积。
      注意： 计算对应16 pmol的RNA质量。
   3. 在RT下孵育30分钟，避免光照。
   4. 将包含 顶部 和 底部 序列的RNA样本合并到一个PCR管中。通过上下移液彻底混合。在2000克 × 离心机中，工作台式微型离心机中运行2秒。在RT下孵育30分钟。
5. 加入6微升1：2（v/v）预混100 mM精脂和50% PEG 8000。通过上下移液彻底混合。在2000 g下离心机， × 在台式小型离心机中进行2秒。
   注意： 50%的PEG 8000粘度很高。移液管要慢慢且小心。
6. 向反应中加入2微升1 mM DFHBI-1T。通过上下移液彻底混合。在2000 g下离心机， × 在台式小型离心机中进行2秒。反应应呈现黄绿色。
   注意： 要用1毫克DFHBI-1T（质量：320.21）冻干染料制备20 mM DFHBI-1T库存溶液，加入156微升分子生物学级无水DMSO。将高汤分少量放入多个微离心管中，并在-20°C下储存。 避免染料反复冻融循环。将20毫米的原料稀释在无核酸酶水中并冰藏，制备新鲜稀释的1 mM DFHBI-1T工作溶液。
7. 将反应装入玻璃腔盖玻璃中。
8. 在RT下，在黑暗中盖上盖子，孵育箱4小时，以减少蒸发。

5. 影像学准备

1. 使用配备适当激光和物镜的结构化照明或共聚焦显微镜获取三维图像。
   注意： 需要共焦显微镜以减少失焦光线。
2. 配置显微镜先在每个z平面用Cy5通道成像每个感兴趣区域（ROI），然后用GFP通道成像同一ROI。
3. 所有通道的曝光时间设置为500毫秒。将GFP的激光功率设置为80%，Cy5的40%。
4. 用150纳米的Z步长成像反应液滴外的覆盖滑移区域。

6. 分子间碱基配对的定量化

1. 将图像导入图像分析软件²¹。识别GFP（DFHBI-1T）和Cy5（RNA）通道。
2. 在一个RNA簇内绘制5×5像素的投资回报率，测量同一z平面上两个通道的积分密度。每张图像中从不同RNA簇中选择5–8个ROI。
   注意： 根据相机设置调整投资回报率大小，但要保持实验间的一致性。
3. 选择反应液滴外的5–8个ROI进行背景测量，并计算两个通道的平均积分密度。
4. 计算每个ROI的归一化DFHBI-1T强度，使用：
   

7. 常见问题与故障排除

1. 如果离心后未发现RNA沉淀，则考虑RNA降解、转录时间不足、聚合酶失活、残留盐分或RNA浓度低。使用无RNase试剂，延长转录时间，使用新鲜酶，并纯化模板。
2. 如果未观察到Cy5标记RNA簇，则考虑RNA降解或降解PEG 8000或UTP-Cy5。使用新鲜试剂和无RNase条件。
3. 如果在共折叠条件下未观察到DFHBI-1T信号，则考虑染料质量差、缺乏西兰花结构形成或转录本截断。使用新鲜染料，确保缓冲液成分正确，并通过凝胶分析验证转录本大小。
4. 如果荧光信号漂白，应减少激光功率和曝光时间，减少成像步骤，并在培养过程中保护样本免受光线伤害。

Results

在该示范实验中，首次使用上述体外RNA聚类协议⁴评估了顶部和底部RNA报告细胞单独碱基配对并形成西兰花结构的能力。上下基配对产生两个西兰花臂，每个臂能够夹入一个DFHBI-1T分子（图1A–C）^18,22。

当RNA与精矿和PEG 8000一起诱导RNA聚集时，两个RNA单独或共同形成簇（见图1D–Eii）。当单独观察 顶部 或 底部 RNA时，RNA簇内的DFHBI-1T荧光显著低于共折叠条件下，后者是两RNA在热变性和重折叠前结合的（见图1F）。在共折叠条件下，DFHBI-1T（0.1 mM）与 顶部 （0.8 μM）和 底部 （0.8 μM）的摩尔比估计为125：1：1。这相当于DFHBI-1T相对于最大潜在西兰花结构数量的62.5倍。

仅上位和下位的DFHBI-1T信号低但非零，与以往报告中每个报告单独表达时DFHBI-1T荧光极小的报告一致，¹⁸。在缺乏RNA的情况下，DFHBI-1T还表现出非常低但可检测的背景荧光（见图1F）。综合这些结果表明，DFHBI-1T与体外RNA聚类测定相容，且共折叠增强了上下RNA之间的分子间碱基配对。

在归一化至RNA强度后，共折叠条件下归一化后的DFHBI-1T荧光强度达到1.03，显著高于仅上层和下方的水平（分别为0.054和0.023）（图1D、图1Ei和图1F）。随后观察由上下RNA混合形成的RNA簇，这些RNA在聚集前分别折叠（图1D、图1Eii和图1F）。在此独立折叠条件下，归一化后的DFHBI-1T信号为0.031，与负对照组（仅上或下）观察到的基线水平相当（见图1F）。这些结果表明，共折叠促进了上下RNA之间的分子间碱基配对，而分开折叠则限制了这种相互作用。

顶部和底部序列随后入果蝇的 3′未翻译区（UTR），一种生殖颗粒mRNA ^4,23,24及其反义对应物（shu^anti）。选择shu 3′ UTR是因为先前研究表明该RNA主要以单体形式存在于果蝇黑胃壳中，且在RNA凝胶测定中即使在高摩尔浓度下也不会二^聚化。此外，shu-top和shu-bottom在RNA凝胶中不形成同源二聚^体，从而更直接地评估top-bottom分子间相互作用及shu衍生的侧翼序列的影响。
shu-top、shu-bottom、shu^anti-top和^{shu anti-bottom}的DNA模板列于表2。顶部和底部序列插入shu或^shu抗3′ UTR的中间，需要结构重塑以促进相互作用并更好地模拟生理上的RNA-RNA相互作用，其中交互作用区域通常嵌入转录本^中4。

在诱导RNA聚集时，shu-top、shu-bottom、shu反top和^shu反bottom分别表现出极低的DFHBI-1T荧光，与仅上端和下方相似（见图2A和图2B）。一贯地，shu-top与shu-bottom共折叠，或shu^反top与shu^反bottom共折叠产生的DFHBI-1T信号高于单独折叠（见图2Ci和Cii）。在归一化为RNA强度和负面对照（定义为单一RNA的平均归一化DFHBI-1T信号）后，shu-top和shu-bottom的共折叠使得归一化后的DFHBI-1T荧光增加了5.63倍（见图2Di和2Dii）。相比之下，单独折叠仅增加了1.04倍，与单一的上层和下层的基线水平相当。在共折叠和分开折叠条件下，舒^反顶和^反底也观察到类似趋势（见图2Di和图2Dii）。这些结果表明，分离折叠不会促进shu-top与shu-bottom或shu反top与shu反bottom之间的分子间碱基配对，而共折叠则增强这些相互作用，这很可能是由于插入的报告序列。

为了测试shu和shu^anti can的碱基对，shu-top与shu反bottom混合，shu反top与shu-bottom混合。这两种组合在共折叠和分开折叠条件下都表现出比shu-top加shu-bottom或shu^反top-shu反底更高（见图2Ci和2Cii）。归一化后，舒上与^反下共折叠，以及舒^反顶与下反共折叠，分别使DFHBI-1T荧光增加61.86倍和82.60倍（见图2Di和2Dii）。相比之下，单独折叠分别仅增加2.69和4.94倍（见图2Di和2Dii）。虽然远低于共折叠条件下，但这些值高于shu-top加shu-bottom或shu-antitop加shu-antibottom的1.04和1.16。

综合来看，携带额外互补序列的报告者比没有此类序列者更具碱基配对能力。在共折叠条件下，这一效应进一步增强，从而促进分子间相互作用。

图1：体外RNA簇中预测的顶层和底部RNA二级结构及其分子间碱基配对的定量。 （A–B）顶部（A）和底部（B）的二级结构分别折叠的例子，如RNAfold^预测的那样。当分开折叠时，上下层无法重构西兰花适体，DFHBI-1T（灰星）产生的荧光极少。 （C）RNAcofold²⁵预测的碱基对顶和底RNA二级结构示例。两种RNA之间的分子间碱基配对可重构两组西兰花臂¹⁸，使DFHBI-1T结合成为可能，并产生强烈的绿色荧光（绿色星）。 （D）仅用DFHBI-1T（仅染料对照）及体外RNA簇（品红）在DFHBI-1T存在下由上下RNA形成的影像（绿色）。 （Ei， ii） 体外由上下RNA在共折叠（i）和分开折叠（ii）条件下形成的体外RNA簇（品红）。对于D和E面板，RNA被标记为Cy5，平均约三分之一RNA含有单一Cy5标记尿嘧啶，其余三分之二未标记。图像代表了27片切片的平均Z投影，采用150纳米步长，使用相同的曝光和激光功率，适用于所有条件。DFHBI-1T荧光在不同条件下被归一化至相同强度范围。尺度条：2微米（F）DFHBI-1T强度已通过Cy5荧光标准化为RNA丰度。数据以SEM±平均值呈现（**** vs. 共折叠）的P值：仅染色时×1.0 10⁻²²，顶部×2.3 10⁻²²，底部4.9 × 10⁻^23,7.0 × 10⁻²³（单独折叠）。n = 30个区域用于仅染料条件，30–31个RNA簇用于所有其他条件。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：SHU和^抗携带顶、下携带报告者的分子间碱基配对代表性图像和定量。 （A）仅用DFHBI-1T（染料对照）及体外RNA簇（品红）图像，这些簇由shu-top、shu-bottom、^shu反top和shu^反bottom的RNA在DFHBI-1T存在下形成（绿色）。RNA被标记为Cy5，平均在体外转录过程中掺入三颗UTP-Cy5尿嘧啶。图像代表了27片切片的平均Z投影，采用150纳米步长，使用相同的曝光和激光功率，适用于所有条件。DFHBI-1T荧光在不同条件下被归一化至相同强度范围。尺度条：2微米（B）DFHBI-1T强度已归一化为RNA丰度，测量为Cy5荧光。数据以SEM.n.s.平均值表示，±非显著性。双尾t检验（与仅染料检验）的P值：3.1 × 10⁻³（**;Shu-top），1.7 × 10⁻¹（新南西;下半身），2.9×10⁻³⁵（***; 蜀^顶板），以及2.2×10⁻²（;舒^反底）。n = 30个区域用于仅染料条件，30–32个RNA簇用于所有其他条件。 （Ci， ii） 体外RNA簇（品红色）图像，由在DFHBI-1T（绿色）共折叠（i）和分离折叠下混合形成的RNA簇（品红色）。 二）条件。图像代表了27片切片的平均Z投影，采用150纳米步长，使用相同的曝光和激光功率，适用于所有条件。在低波段，DFHBI-1T荧光被归一化至与图1D–Eii和图2A相同的强度范围。高范围中，DFHBI-1T荧光在Ci和Cii面板中被归一化为更高但一致的强度范围。尺度条：2微米（Di，ii）。DFHBI-1T强度先归一为RNA强度，后为负对照组，定义为单一RNA的平均归一化DFHBI-1T信号。数据以SEM.n.s.平均值表示，±非显著性。（i） 双尾t检验的P值（**** vshu-top + shu-bottom）：1.1 × 10⁻³¹（shu反上+shu^反bottom），1.1 × 10⁻²²（shu-top + ^{shu-anti-bottom}），4.3 × 10⁻²⁷（shu^反上+shu-bottom）。（ii） 双尾t检验的P值（对比shu-top+shu-bottom）：2.2×10⁻¹（n.s.）;舒^反顶 + 舒反底），1.9 × 10⁻⁹（;舒-上+舒^反下），以及1.3×10⁻^⁻（;蜀^反上 + 蜀底）。n = 29–32个RNA簇，适用于所有条件。请点击此处查看该图的放大版本。

名称	序列（5′-3′）
T7 启动子	TAATACGACTCACTCACT塔格
顶部	嘎特c 卡加特卡卡加加克 GGTCGGGTCCAGATGATGGGGG
底部	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGGC TCCATCATCC
顶级T7前锋	TAATACGACTCACTCACT塔格 嘎特嘎
上车反转	ATCCGCATCATCTGGACCC
底部T7前进	TAATACGACTCACTCACT塔格G GATCCGCATCATCTGTGTCGA
下档	GGATGATGGAGCCACACACT
前向引物包含T7启动子序列突出（加粗），随后是靶向RNA5′端的序列。

表1：用于扩增T7转录DNA模板的T7启动子序列、分裂的西兰花报告蛋白和引物序列。 上述引物用于生成顶端和底端RNA的体外转录DNA模板，随后被用于本研究描述的RNA聚类检测。

名称	序列（5′-3′）
修顶	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTATTATTTACTACTACCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGAGGGGGGGGTCCAGATGGGGA TAAAAAACATACCAAACATGAATTTAGTTCCAAGTTCTAGTAGGAAGCAGTATCATT AGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTTTTAAAAACCAATAAAAGTAATGCGGcagctacat
舒底	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTATTATTATTTACTACCAAAAAGGATCCGCATCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGGCTGTTGCCATGTGTGTGTGTGTGTCAACCCACATCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAGTTAGAAGCAGTATCATTAGTTATTTCGATTAGTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTTTTTAGTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAA AAACCAATAAAAAGTAATGCGGCactacat
蜀反顶	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTACCTTCATGTGTGTGTATTTTTTTGGA TGATGGAGAGGGTGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGGGGGGGGGGGGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATGAATGAATGAATGGGGGGTTTTTAGTAAGC
蜀反底	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTATTATTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTACCTTCATGTTTTTTTGTGTGTATTTTTTTT GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTGCCATGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCTTTTTGAGTAA GATATGAAATGAATACTGGGGCTTTTTAGTAAGC
shu-top或shu-bottom-T7前进	TAATACGACTCACTCACT塔格GGCTTACTAAGAAGCCCAGT（格特特拉克塔卡格特）
上或下——背面	ATGTAGCTGCCGTGTGTGTATTAC
Shu反顶或Shu反底T7前进	TAATACGACTCACTCACT塔格GGATGTAGCTGCCGTGTGTGTGTCATTA
舒反上或舒反底——背面	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
前向引物包含T7启动子序列突出（加粗），随后是靶向RNA5′端的序列。在T7启动子与舒上和舒底或舒反顶和舒反底之间分别包含一到两个额外的G。这是因为在+2和+3位置有G可以显著提高转录率19。然而，这些额外的G可能会影响设计构造中碱基配对的解释。详见步骤1.1中的说明。

表2：用于扩增T7转录DNA模板的shu-top、shu-bottom、shu反top、shu反bottom序列及引子序列。上述引物用于生成带有顶部和底部报告的shu和^shu抗RNA的体外转录DNA模板，这些模板随后被用于本研究描述的RNA聚类检测。

Discussion

本研究中，分裂的西兰花适体系统¹⁸被改编用于在体外RNA聚集条件下直接可视化和定量分子间碱基配对。该方法能够在不同体外条件下评估分子间碱基配对，并补充下游生化分析，如使用碱基配对交联剂15,16,17的RNA拉下实验和凝胶电泳^4,6,7.与这些缺乏空间分辨率以区分RNA簇内与外部碱基配对不同，这种方法能够直接空间可视化簇内的相互作用。具体来说，它允许在定义的RNA聚集条件下监测顶端和底端RNA之间的碱基配对，或携带这些报告者的RNA。此外，它提供报告RNA间碱基配对的实时定量读数，无需交联或提取RNA，从而最大限度地减少样本损失和缓冲液不兼容。

利用荧光显微镜，通过DFHBI-1T信号定量测量分裂西兰花适体序列间的分子间碱基配对，证明了DFHBI-1T与 体外 RNA聚类协议的兼容性。分子间碱基配对的程度取决于RNA折叠条件，如共折叠和分离折叠条件下观察到的（图1F 和 图2Di–2Dii）。这些发现表明，RNA折叠条件对分子间RNA相互作用具有关键性影响，在解读实验结果时应予以谨慎考虑。

该检测方法还为评估上下报告序列是否增强分子间碱基配对提供了平台，如用SHU所示。DFHBI-1T荧光在shu-top配合shu反底和shu-top配合shu-bottom时更高，高于shu-top加shu-bottom或shu反top与shu反底，表明涉及shu和shu反^反底的分子间相互作用进一步增强西兰花信号。这些观察表明，仅由上下报告共折叠获得的DFHBI-1T荧光信号并不代表该检测的上限。

这些实验中测得的DFHBI-1T荧光涵盖了较宽的动态范围，从1.04倍增加（在单独折叠下，上层与下层）到82.60倍（在共折叠条件下，反顶层与下层相聚）。这种动态范围使携带这些报告蛋白的RNA间分子间RNA相互作用差异能够检测到。

该方案中的若干步骤对于成功检测分裂 的西兰花上层 和 底部 RNA之间的分子间RNA碱基配对至关重要。应使用新鲜的PEG 8000分样品以可靠诱导RNA聚集，并因试剂不稳定性而减少反复冻融循环。DFHBI-1T应被逐价保存，储存在−20°C以保持荧光特性。体 外 转录产物应在聚类前先在变性RNA凝胶上分析，以确认正确的转录本大小。此外，保持无RNase的环境，包括清洁的工作环境和成像室，是因为RNA液滴在成像前需在室温下长时间培养。

该方法的一个局限是DFHBI-1T特异地报告由顶序列和底序列介导的分子间碱基配对。不同RNA区域发生的其他分子间碱基配对事件无法检测。此外，由上下链碱基配对形成的西兰花结构在热力学^上是稳定的，可能无法完全反映较弱或瞬态的相互作用，如果蝇胚芽颗粒mRNA簇中观察到的，如散布、暴露于表面的碱基^形成的。

此外，分子间RNA–RNA相互作用可能杂乱且非特异性，顶部和底部报告子两侧的序列可能影响DFHBI-1T荧光。这些侧翼区域可能直接与报告蛋白序列相互作用，抑制西兰花的形成或改变RNA结构，从而影响携带报告蛋白的RNA之间的相互作用。因此，该检测反映了RNA结构、上下碱基配对、侧翼序列间相互作用以及侧翼序列与报告者间相互作用的综合效应。

该检测为未来研究提供了机会。例如，改变报告细胞两侧的RNA序列、引入RNA解旋酶或伴侣蛋白，或改变盐分条件，都可能影响RNA簇中的分子间碱基配对。通过测量共折叠和分开折叠条件下的DFHBI-1T信号，可以评估此类效应。鉴于类似的RNA适体已被应用于细胞、细菌和酵母26,27,28,29,30，这一方法可推广至细胞系统或模式生物中，以研究mRNA簇中的分子间碱基配对。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	米利波尔西格玛	M1028	用于制备10×RNA重折叠缓冲液。
2M KCl	赛莫飞世尔科学公司;	AM9640G	用于制备10×RNA重折叠缓冲液。
50% PEG 8000	NEB	M0204S	T4 RNA连接酶试剂盒的组成部分;用作分子拥挤试剂以诱导RNA聚集。nbsp;
绝对乙醇，200度	赛莫飞世尔科学公司;	T038181000CS	用于制备RNA洗涤缓冲液。
酸性酚：氯仿，pH值4.5（含IAA，125：24：1）	赛莫飞世尔科学公司;	AM9722	用于RNA纯化。
氨基烯丙氨酸-UTP-Cy5	耶拿生物科学	NU-821-CY5	用于体外转录过程中的RNA标记。
有膛室盖玻璃	赛莫飞世尔科学	155409PK	RNA聚集反应成像腔。
氯仿	赛莫飞世尔科学公司;	C298-500	用于RNA纯化。
东部大洋舰一号T型	卢塞尔纳	410	用作荧光团用于检测西兰花RNA适配体。
DMSO	赛莫飞世尔科学公司;	D12345	无水;分子生物学级别;用于DFHBI-1T的制备。nbsp;
DNA清洁与集中器套件	齐莫	D4014	用于T7转录前的DNA产物净化。
DNA凝胶提取套件	NEB	T1020L	用于凝胶提取。
干浴	基准科学	BSH1001	用于在微离心管中加热RNA样品。
斐济/ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	无	开源图像分析软件;用于定量荧光强度和投资回报率分析。
凝胶电泳系统	赛莫飞世尔科学	B2-BP	用于进行DNA凝胶电泳。
凝胶加载染料，紫色（6次;）	NEB	B7024S	用作DNA凝胶电泳的载入染料。
即时结构照明显微镜	视觉科技国际	VT-iSIM	一台能够成像GFP和Cy5荧光的共聚焦显微镜，并注注;
异丙醇	赛莫飞世尔科学公司;	327272500	用于RNA纯化。
MEGAscript T7转录套件	赛莫飞世尔科学公司;	AM1334	用于体外T7转录。该试剂盒包含核苷酸溶液（ATP、CTP、GTP、UTP）和DNase。
微离心管	杰尼西科学	22-284	1.5毫升管;用于存储体外转录、RNA产物及精子和DFHBI-1T的同分样品的DNA模板;
迷你离心机	基准科学	Z763845	用于短暂离心。
纳米滴一号分光光度计	赛莫飞世尔科学	13-400-518	微体积分光光度计用于测量DNA和RNA的浓度及质量。
无核酸酶水	赛莫飞世尔科学公司;	AM9937	用于RNA沉淀的再悬浮、RNA洗体和重折叠缓冲液的制备，以及对精矿和DFHBI-1T的稀释。
在线摩尔质量计算器	新英格兰生物实验室（NEB）	无	在线工具，用于从摩尔数量（例如pmol）计算RNA质量。
聚丙烯PCR管	科宁	3745	200 & mu;用于PCR、体外转录和RNA聚集反应的L型PCR管
PowerPac 基本电源	生物辐射	1645050	用于进行DNA凝胶电泳。
Proflex PCR 热循环仪	赛莫飞世尔科学	44-840-73	用于PCR、体外转录以及在PCR管中加热RNA样本。
Q5 高保真 2&母带混音	NEB	M0492S	用作2×高保真母带混音。
冷藏离心机及nbsp;	埃彭多夫	5424R	用于RNA纯化和沉淀。
RNase去污溶液	赛莫飞世尔科学公司;	AM9782	用于清洁实验台和表面，以减少RNase污染。
Spermine 四盐酸盐	西格玛-奥尔德里奇	S1141-1G	用于诱导RNA聚集。
特里斯基地	米利波尔西格玛	T1503-1公斤	用于制备Tris缓冲液（pH值7.0）。
超纯琼脂糖	赛莫飞世尔科学公司;	16500500	用于DNA凝胶电泳，注：;