基于橄榄油的脂质乳剂通过抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β通路改善免疫检查点抑制剂诱导的心肌炎

摘要

基于橄榄油的脂质乳剂通过靶向NF-κB/NLRP3/IL-1β通路，减轻免疫检查点抑制剂诱导的心肌炎，显示出其在抑制炎症级联反应中的潜力。这些发现凸显了其作为免疫相关性心脏损伤辅助治疗手段的前景。

摘要

本研究旨在探讨基于橄榄油的脂质乳剂（OOLE）在缓解由伊匹单抗（IPI）和纳武单抗（NIVO）引发的免疫检查点抑制剂（ICI）相关心肌炎方面的治疗效果及其潜在作用机制。 体外 通过将HL-1细胞与来自免疫检查点抑制剂（ICI）处理小鼠的CD4⁺/CD8⁺ T细胞共培养，建立炎症性心肌细胞模型。细胞经10% OOLE处理后，采用流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA检测细胞因子谱（TNF-α、IL-1β、IL-6），Western blot和qPCR检测通路相关分子表达（NF-κB、NLRP3、IL-1β）。 体内通过腹腔注射IPI/NIVO在小鼠中诱导心肌炎。采用超声心动图评估心脏功能，并检测血清和心肌组织中的炎症标志物。结果显示，OOLE显著减少T细胞诱导的凋亡，抑制HL-1细胞中炎症细胞因子的产生，同时下调NF-κB、NLRP3和IL-1β的表达。 体内OOLE 改善了左心室功能参数并减轻了全身性炎症。分子分析证实，这些保护作用是通过抑制 NF-κB/NLRP3/IL-1β 信号轴介导的。总之，OOLE 通过靶向 NF-κB/NLRP3/IL-1β 通路，缓解急性免疫检查点抑制剂诱导的心肌炎，显示出其在抑制早期炎症级联反应和提供快速心脏保护方面的潜力。这些发现凸显了其作为免疫相关心脏损伤辅助治疗策略的前景。

引言

免疫检查点抑制剂（ICIs），例如靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的药物，已彻底改变了多种恶性肿瘤的治疗格局。然而，ICIs在临床的广泛应用常受到免疫相关不良事件（irAEs）的限制。其中，ICIs诱导的心肌炎虽罕见，但可能致命，其临床进程迅速，死亡率高达25%至50%^1,2。尽管该并发症严重，目前针对ICIs诱导心肌炎的治疗手段仍主要局限于大剂量皮质类固醇和非特异性免疫抑制剂^3,4。这些传统干预措施常疗效欠佳，且可能削弱ICIs的抗肿瘤效果¹，因而亟需填补一项关键的知识空白：开发更安全、更具靶向性的心脏保护策略，在不引起全身性免疫抑制的前提下减轻心脏炎症。

通过NF-κB信号通路激活的NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体，已成为免疫检查点抑制剂（ICI）诱导的心肌炎中细胞因子风暴的核心驱动因素^5,6。促炎性细胞因子（尤其是IL-1β和IL-6）的过度产生，可导致严重的心肌细胞损伤和心力衰竭⁷。尽管已有多种基于脂质的干预措施在心血管疾病中被探索，但橄榄油基脂质乳剂（OOLE）在这一特定情境下的潜力尚未被研究。OOLE富含油酸，这是一种单不饱和脂肪酸，已知具有调节细胞膜流动性和抑制炎症级联反应的独特能力^8,9。然而，OOLE是否能够特异性地改善ICI诱导心肌炎所特征性的过度炎症状态，仍有待证实。

本研究旨在通过探讨OOLE的治疗潜力来弥补这一空白。我们假设OOLE通过抑制NF-κB/NLRP3/IL-1β信号轴，发挥强大的心脏保护作用，从而抑制炎症反应的爆发并维持心脏功能。通过结合 体外 HL-1 心肌细胞与T细胞的共培养模型 体内 我们通过ICI诱导心肌炎的小鼠模型证明，OOLE干预可实现快速功能恢复并减轻心肌损伤。本研究首次提供了OOLE作为一种新型、靶向性营养药理学策略用于管理ICI相关心脏毒性的证据。

方案

所有实验程序均经广州美莱生物科技有限公司动物伦理委员会批准，批准编号为IACUC-MIS2023076。所述公司为动物实验中心，我们的动物实验在此进行，因此需接受该中心伦理委员会的审查。

动物与实验设计
购自商业渠道的30只BALB/c小鼠（雄性，8周龄，体重22 ± 2 g）。模型诱导与验证标准：通过静脉注射伊匹单抗（ipilimumab，5 mg/kg）和纳武单抗（nivolumab，10 mg/kg）连续2周建立免疫检查点抑制剂（ICI）诱导的心肌炎模型。给药间隔为每3天一次，建模总周期为2周。该方案既往已被证实可诱导显著的免疫介导性心脏损伤¹⁰。末次注射后24小时，通过眼球后静脉丛采集血液样本，在4 °C条件下以300 × g 离心15分钟以分离血清；随后使用特异性ELISA试剂盒定量检测血清cTnT水平，操作步骤包括样本加样、HRP标记抗体孵育、自动洗板及TMB显色反应，于450 nm波长测定吸光度，并根据四参数逻辑曲线计算浓度，当cTnT浓度≥10 ng/mL时判定为模型构建成功。

选取六只体重和cTnT浓度最接近的模型小鼠，随机分为两组：对照组和处理组（每组n=3，生物学重复）。对照组每日通过尾静脉注射生理盐水，剂量为5 mL/kg。处理组每日通过尾静脉注射5%橄榄油型脂肪乳剂（OOLE），剂量为5 mL/kg，连续给药6天（该剂量为我们机构临床治疗所采用的剂量，根据体表面积比值推算并应用于小鼠）。在为期6天的观察期内进行以下检测：采用超声光声成像系统在基线（第0天）和治疗后（第6天）评估心脏功能；于第6天通过眶后静脉采集血液，采用ELISA法定量血清细胞因子。动物经麻醉过量处死后，迅速冷冻心脏组织用于蛋白质分析。

T 细胞分离
对照组小鼠通过过量麻醉实施安乐死。将小鼠脾脏在 75% 乙醇中表面消毒 5 分钟后无菌取出，并去除所有结缔组织。使用 70 µm 细胞筛在含 2% FBS 的 PBS 中机械解离脾脏，制备单细胞悬液。将该悬液在 300 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，随后加入 1 mL ACK 裂解缓冲液，在室温下裂解红细胞 2 分钟。通过 PBS 洗涤终止裂解过程。使用小鼠 T 细胞分离试剂盒对 T 细胞进行负向富集，以避免细胞活化。每 1 × 10⁷ 个细胞加入 50 µL 分选混合液，室温孵育 10 分钟。随后每 1 × 10⁷ 个细胞加入 75 µL 链霉亲和素磁珠，孵育 5 分钟。利用磁铁吸附磁珠结合的细胞 3 分钟，将未结合的上清液收集，获得富集的 T 细胞（纯度超过 94%）。为分选 CD4⁺ 和 CD8⁺ 亚群，将富集后的细胞在避光条件下与抗 CD3ε-PE、抗 CD4-APC 和抗 CD8-FITC 抗体孵育 15 分钟，随后用预冷的 PBS 洗涤 3 次。在流式细胞仪上按照以下设门策略进行分选：淋巴细胞（FSC/SSC）、CD3⁺ 细胞、再分选 CD4⁺ 或 CD8⁺ 亚群。细胞以“纯度模式”分选至预先加入 200 µL PBS 的收集管中，所得目标亚群纯度高于 98%。

心肌炎细胞模型的构建与处理
HL-1 细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的DMEM/F12培养基中，于标准条件下（37 °C，5% CO₂）培养。细胞分为三组：​对照组（未处理）、模型组（HL-1细胞与CD4+/CD8+ T细胞共孵育24小时）和OOLE组（模型组同时用10% OOLE处理24小时）。

用于血清中心肌损伤相关蛋白检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）
将50 µL血清样本加入试剂盒中预先包被有丰富抗体的微孔板孔内，孵育30分钟，然后用PBST洗涤3次，以去除未结合成分。加入制备好的辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素溶液，进行第二次孵育。再次用PBST洗涤3次后，每孔加入100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液以启动比色反应，并在反应启动后30–45分钟内加入100 µL终止液终止反应。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD），并通过已知参考标准品绘制的标准曲线定量目标分析物的浓度。

Western blot
使用组织匀浆器在液氮中将心脏组织粉碎。随后，将组织和细胞样品在冰上用200 µL RIPA裂解缓冲液裂解30分钟。裂解物在4 °C下以12,000 × g 离心15分钟，收集蛋白上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白浓度调整至5 µg/µL后，加入5×上样缓冲液混匀，并在95 °C加热10分钟进行变性。蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶中电泳分离（100 V恒压运行90分钟），然后通过半干式转膜仪在15 V下电转印30分钟至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭膜后，于4 °C与一抗（包括IL-1β、NLRP3、MyD88、NF-κB p65和Tubulin；稀释比例为1:1,000）孵育过夜²。用含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）洗涤膜三次，每次10分钟，然后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（稀释比例为1:10,000）孵育1小时。通过加入增强型化学发光（ECL）底物显色，并使用化学发光成像系统捕获信号。最后，使用ImageJ软件将目标蛋白条带的光密度值相对于Tubulin内参进行归一化，定量分析其相对表达水平。

通过流式细胞术检测细胞凋亡
用磷酸盐缓冲液（PBS）将HL-1细胞洗涤2次。为进行细胞解离，加入1 mL胰蛋白酶，孵育1分钟，随后立即加入2 mL完全培养基中和。将细胞悬液在4 °C下以250 × g 离心5分钟，并弃去上清液。收集的细胞沉淀用预冷的PBS洗涤2次，然后重悬于1×结合缓冲液中，调整细胞密度至1 × 10⁶ 个细胞/mL。取100 µL该细胞悬液转移至流式细胞术检测管中，随后加入5 µL FITC-Annexin V和5 µL碘化丙啶（PI）。轻轻涡旋混匀后，于室温（25 °C）避光孵育15分钟。最后，每管加入400 µL 1×结合缓冲液，使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。在设门策略中，首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门，以排除亚细胞碎片并圈选完整的HL-1细胞群体。在此初级门内，通过象限分析定量凋亡细胞，其中早期凋亡细胞定义为FITC-Annexin V⁺/PI⁻，晚期凋亡细胞定义为FITC-Annexin V⁺/PI⁺。

统计学分析
每个实验均重复三次，采用统计学软件进行统计学分析。两组之间的差异采用独立样本t检验进行分析；三组或三组以上的差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。p < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

伊匹单抗与纳武单抗联合诱导动物模型产生免疫检查点抑制剂相关心肌炎
为建立免疫检查点抑制剂（ICI）诱导的心肌炎模型，通过尾静脉向 BALB/c 小鼠静脉注射伊匹单抗（5 mg/kg）和纳武单抗（10 mg/kg）。随后采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中心肌肌钙蛋白 T（cTnT）的水平。将 cTnT 水平 ≥ 10 ng/mL 定义为模型成功诱导的阈值。如图 1A所示，对接受建模处理的30只小鼠进行血清分析，结果显示其中10只小鼠的 cTnT 浓度超过 10 ng/mL，证实这些动物模型构建成功。

OOLE可改善免疫性心肌炎小鼠的部分心脏功能
在ICI诱导的心肌炎模型中，超声心动图通常显示心率增加，以及收缩期（LVIDs）和舒张期（LVIDd）左心室内径扩大。这些变化提示早期心室扩张及心肌顺应性受损。同时，射血分数（EF）和缩短分数（FS）显著降低，这是由于收缩期射血减少和收缩末期容积（ESV）增加所致——为左心室收缩功能障碍的...

讨论

本研究首次证明，基于橄榄油的脂质乳剂（OOLE）可通过抑制 IL-1β/NLRP3/NF-κB 信号通路，有效减轻免疫检查点抑制剂（ICI）诱导的心肌炎。我们的结果提供了机制和功能上的证据，表明 OOLE 在 ICI 诱导心肌炎的 in vivo 和 in vitro 模型中，不仅可改善心脏功能，还能缓解心肌炎症。

从机制上讲，研究结果支持一种模型，即T细胞介导的心脏损伤通过NLRP3炎性小体的组装和NF-κB信号通路，触发IL-1β级联反应的过度激活¹⁶。该炎症轴已被证实可加剧心肌坏死，促进Th17极化，并诱导长期的心脏重构^17,18。与此一致，我们在CD4⁺/CD8⁺ T细胞与HL-1心肌细胞共培养后，观察到TLR4、MyD88、NLRP3以及磷酸化p65表达的显著上调。值得注意的是，OOLE处理显著下调了这些促炎介质的表达，提示其在此免疫病理通路中可能发挥负向调控作用。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm PVDF 膜	Millipore	ISEQ00010
4% 多聚甲醛	广州翡翠生物科技有限公司	BL539A
BALB/c 小鼠	广东志远生物医药科技有限公司
BCA 检测试剂盒	鼎国生物	BCA02
明场显微镜	MSHOT	ml31
cTnT ELISA 试剂盒	伦长硕生物	ED-28107
电泳仪	WIX	miniPro4
全自动化学发光图像分析系统	FUJIFILM	LAS-3000
苏木精-伊红染色试剂盒	广州翡翠生物科技有限公司	BL2236A
IFN-γ ELISA 试剂盒	厦门伦长硕生物科技有限公司（中国福建）	ED-10284
IL-1β 抗体	affinity	BF8021
IL-1β ELISA 试剂盒	厦门伦长硕生物科技有限公司（中国福建）	ED-10351
IL-6 ELISA 试剂盒	厦门伦长硕生物科技有限公司（中国福建）	ED-10377
ImageJ 1.54 软件	NIH
伊匹单抗	MCE	CAS: 477202-00-9
MyD88 抗体	affinity	AF5195
NF-κB p65 抗体	affinity	BF8005
纳武单抗	MCE	CAS: 946414-94-4
NLRP3 抗体	affinity	BF8029
橄榄油基脂质乳剂	广州复大肿瘤医院营养科
快速半干转膜仪	Bio-Rad	788BR04132
实时荧光定量 qPCR 系统	雅睿	MA-6000
RIPA 裂解液	碧云天	P0013B
轮转式切片机	Leica	RM2235
SDS-PAGE 凝胶	碧云天	P0052A,P0053A
Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒	大连美仑生物科技有限公司	MA0220-1
EasySep 小鼠 CD4+ T 细胞分离试剂盒	Stemcell	19765
HL-1 大鼠心肌细胞系	广州全美生物科技有限公司	TCM-C783
TNF-α ELISA 试剂盒	厦门伦长硕生物科技有限公司（中国福建）	ED-11776
超声光声成像系统	Fujifilm VisualSonics	VEvo3100
尿动力学检测系统	泰盟	BL-420