拟南芥核单分子定位显微镜的简化方案

Summary

该方案为单分子定位显微镜成像提供了高效的工作流程，利用优化的分离、固定和标记，实现染色质和RNA聚合酶II的可靠纳米尺度可视化。该方法可轻松应用于其他染色质相关蛋白或组蛋白修饰，实现高分辨率成像。

Abstract

虽然共聚焦荧光显微镜为植物细胞核中染色质组织提供了宝贵见解，但其绕射极限分辨率限制了染色质结构的研究，促使采用单分子定位显微镜（SMLM）等超分辨率技术。在这些方法中，直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在单个细胞中提供纳米级分辨率，使染色质结构域、组蛋白修饰和细胞核组织的精确可视化成为可能。尽管此类方法在哺乳动物系统中日益应用，但由于样品制备的技术难题，它们在植物生物学中的应用仍然有限。

本文介绍了一种简化且可重复的SMLM成像流程，用于从 拟南芥中分离出的核。该方案从幼苗固定以保持细胞核形态开始，随后进行温和的组织切割和离心，以富集完整细胞核。分离出的核随后在液体培养基中进行荧光团标记，并固定在低熔融的琼脂糖垫上，这一策略增强了长时间单分子成像过程中的稳定性。这些步骤共同减少了背景荧光，提高了标记一致性，并提高了生物复制体间的重复性。

由此产生的制剂为植物中染色质修饰和核结构的可视化提供了更清晰的理解。通过降低在拟南芥中实现SMLM成像的技术障碍，该方案为研究表观遗传调控、染色质组织和核拓扑变异在纳米尺度上提供了一种多功能手段。本研究奠定了将SMLM应用于植物的方法论基础，弥合了哺乳动物细胞生物学的空白，并为研究核结构如何响应植物系统发育和环境信号对基因组调控的贡献开辟了新机遇。

Introduction

显微镜长期以来一直是研究染色质组织和核结构的基石，揭示了DNA和组蛋白相关蛋白如何在三维核空间中排列并影响基因调控^1,2。传统荧光显微镜为对大尺度染色质结构域（如染色体领域、染色中心和核实体^3,4）提供了宝贵见解，这些结构可原位进行，尤其是在植物的根组织中（^3,5,6）。然而，这些技术在根本上受限于光的绕射障碍，空间分辨率限制在横向约200纳米和轴向约500纳米。这一限制掩盖了染色质折叠、组蛋白修饰模式以及转录区隔的纳米级细节，这些都是表观遗传调控的基础。为克服这一障碍，开发了超分辨率显微镜（SRM）方法，如结构照明显微镜（SIM）⁸、受激发射耗尽（STED）^9,10 和单分子定位显微镜（SMLM）^11,12，以实现从100纳米到几纳米¹³的分辨率。

在SRM技术中，SMLM——包括光激活定位显微镜（PALM）¹³和直接随机光学重建显微镜（dSTORM）——结合了卓越的空间分辨率和分子特异性¹⁴。通过检测单个荧光团随时间的位置，SMLML重建了单细胞中染色质结构域、组蛋白标记和核结构的高精度纳米级图像^15,16。这一能力彻底改变了哺乳动物系统中的染色质研究，SMLM 已被应用于以前所未有的细节可视化核小体聚集、染色质压缩和组蛋白修饰模式 15,16,17。相比之下，SMLM在植物细胞核中的应用仍然有限，主要原因是植物组织特性相关的技术挑战——如高自发荧光、细胞壁刚性以及淀粉和叶绿素¹⁸等光散射化合物的存在。此外，细胞核在分离和标记过程中的脆弱特性要求优化工作流程，以保持结构完整性并减少长时间成像过程中的背景荧光。

本文所述的方案最初由Elizabeth Kracik-Dyer和Célia Baroux为受激发射耗尽（STED）显微镜¹⁹开发。随后，该技术经过优化和调整，以满足STORM成像的具体需求，整合了来自已发表微生物学应用^20、21、22的知识。总体目标是为分离拟南芥核的SMLM成像提供一个简化且可重复的工作流程。通过整合优化固定、温和机械破坏和悬浮荧光团标记，该方法既保持核形态，又高效去除常影响成像质量的细胞质污染物。在低熔融琼脂垫上固定标记核能确保采集过程中的机械稳定性，从而实现纳米级高精度的长期单分子成像。与之前描述的植物细胞核SRM协议——尤其是基于STED显微镜^19,23的方案相比——该工作流程使用可光开关荧光团（如AF647、JF549），并通过洗涤步骤去除叶绿素和组织碎片，减少背景荧光，并通过直接将标记分子添加到固定和透光的细胞核中，提高标记均匀性。因此，它能够持续可视化单个细胞核中的染色质修饰、核室和表观遗传模式。通过降低在植物中实施SMLM的技术障碍，该方法拓宽了纳米成像的可及性，并为研究染色质组织和核结构如何响应发育和环境信号对基因调控的贡献奠定了基础。

Protocol

注意：本议定书中使用的材料和仪器的详细信息可在 材料表中查阅。除非另有说明，缓冲液在无风源0.2微米过滤器上进行清除。在整个方案中使用双重蒸馏超纯H₂O（ddH₂O）。离心步骤在1.5毫升微管中使用固定角度转子进行。

1. 幼苗的固定与核的释放

1. 将一个6孔培养板置于抽风罩下冰块上，然后在每个槽中加入约4毫升即兴制备的冰冷固定液（4%甲醇稳定甲醛，0.1%Triton X-100,1×磷酸盐缓冲生理盐水[PBS]）。
2. 使用干净的镊子，取出在发芽后8至15天内，这些幼苗在固体（0.8%琼脂）半浓度Murashige和Skoog培养基2.2克/升MS盐、1%蔗糖（w/v）、pH值5.7上生长，如文献²⁴所述MS幼苗，并立即将其浸入固定溶液中。大约用一口井种植20株幼苗（每个样本需要3口井以获得足够的材料）。
3. 将板放入充满冰块的真空腔体，并在0.2巴至0.8巴之间的压力循环下施加真空15分钟，以去除滞留空气，使固定剂深度渗透到^{植物组织中}。缓慢释放真空，搅拌样品，然后再施加真空15分钟。
4. 在排气罩下，用移液器取出固定溶液，并用5毫升冰冷PBS轻轻搅拌，每口井清洗3次，每次10分钟。
5. 取出PBS，使用产钳将固定组织转移到120毫米×120毫米培养皿。在固定幼苗基础上加入50微升核分离缓冲液（NIB），由Kracik-Dyer和Baroux描述（45 mM MgCl 2,20 mM MOPS，30 mM 柠檬酸钠，0.3% Triton X-100）。用1 N HCl调整到pH 7）¹⁹。刀锋。
   注：切片刀在这项工作中比传统剃须刀片更高效。
6. 用同一刀片将切碎的组织刮到培养皿的一侧，加入600微升NIB，同时确保清洗粘附在刀片上的组织。
7. 将组织浆液转移到2毫升的Dounce均质管中，用较小的杵冲刺5–10次，然后用较大的杵在管内平滑移动（通常同样需要5–10次冲刺）。
8. 将均质化样品通过30微米网状滤网过滤，放入1.5毫升微管中。
9. 在800 × g 下离心10分钟，使用最低斜坡进行加速和减速。绿色组织碎片中可见一颗小白色颗粒。
10. 丢弃上清液，将沉淀重新悬浮于150微升NIB中。
11. 再次用800× 克 离心10分钟，取出上清液。如果有明显的绿色残渣，就再洗一次。根据沉淀颗粒大小，再悬浮于50微升至150微升的NIB中。
12. 在进行染色前，将分离出的原子核悬浮液储存在4°C下，最多1周。但建议立即采取行动。

2. （免疫）染色

注意：在接下来的步骤中，该方案应用于50微升的核悬浮液体积，通常对应20株幼苗。除非特别说明，以下步骤均在室温下执行。

1. 将溶液离心10分钟，800× 克 后丢弃上清液。小心不要碰到颗粒。
2. 通过温和移液于50微升阻断缓冲液（143 mM NaCl，4% BSA in PBS，储存于4°C）中重新浮出核。在轻微搅拌下潜伏30分钟。
3. 将溶液离心10分钟，电压为800× 克 ，然后丢弃上清液，但不接触核团。
4. 通过温和移液，1× PBS浓度50微升，重新置核。再次离心10分钟，压力为800× 克。如上所述，丢弃上清液。
5. 将核重新悬浮于50微升的初级抗体溶液中，该溶液由143 mM NaCl、1% BSA、0.05% Tween 20 PBS组成的免疫染色缓冲液中（抗体和工作稀释详见 材料表）。将样本在轻微搅拌下孵育60分钟。
6. 进行两次洗涤（重复步骤2.3和2.4）。
7. 将细胞核重新浮于50微升的山羊抗兔AF647二级抗体中，稀释度为1/²⁰⁰。用铝箔包裹荧光团，保护荧光团免受光线伤害。在轻微搅拌下将管子孵育60分钟。
8. 进行两次洗涤（重复步骤2.3和2.4）。
9. 将沉积物重新悬浮在50微升的NIB中。将悬浮液储存在1.5毫升微管中，包裹铝箔。标记在4°C下稳定数周。

3. 安装

1. 为STORM成像，将粉末溶解于1.25×缓冲液B中，含50 mM Tris pH 8、10 mM NaCl、10% 葡萄糖，制备低熔度琼脂糖溶液（LMA 1.5% w/v）。准备1.25×高汤溶液，储存在4°C。
2. 在90°C加热1分钟，使粉末溶解并获得透明溶液。冷却并保持熔化LMA溶液在37°C，然后进入下一步，以避免葡萄糖氧化酶缓冲液（GLOX）热变性（准备10x溶液，储存于-20°C，含100 mM Tris pH 7.5、25 mM KCl、1 mM TCEP pH 7.0、5 mg/mL葡萄糖氧化酶、0.4 mg/mL 过氧化氢酶， 50%的甘油）。
3. 当LMA溶液达到37°C后，向温热的LMA溶液中加入100 mM巰基乙胺（MEA）和GLOX，准备STORM缓冲液，达到1×的最终浓度。将MEA 1 M高汤溶液在4°C下保存最长1个月，但建议使用新鲜制备的溶液。轻轻搅拌。
   注意：可选的DNA标记时，加入1.5 nM（最终浓度，1 mM的DMSO库存溶液）JF549结合Hoechst。使用前保持悬挂温度在37°C。
4. 以1/1500稀释度轻柔混合核悬浮液与纳米钻石。将样本与胚胎一起孵育5分钟。
   注意：纳米钻石作为标杆，用于纠正样品漂移。
5. 将10微升混合物沉积在臭氧处理过的1.5H盖玻片上（紫外臭氧清洗系统20分钟），等待3分钟让核沉积在盖层上。
6. 把多余的液体清除掉，等2分钟。将步骤3.3中制备的10微升LMA加入盖片，立即用显微镜载玻片覆盖。
7. 用硅胶密封剂封住盖玻片。用微量移液器尖端在一个小培养皿中混合等量的溶液A和B。将混合物涂抹在盖片边缘以密封样品。硅胶密封剂在5分钟内硬化。
8. 安装完成后，立即对载玻片进行成像，最终在接下来的4至5小时内，以避免安装垫氧气扫氧特性的损失。

4. 成像

注意：成像参数必须根据样品的性质、荧光团的光物理特性以及显微镜的光学构型进行精心优化。确保每个荧光团的信噪比高至关重要，同时最大限度地减少荧光通道间的光谱透视和交叉激发。样品通过配备高NA 100倍油浸物镜、焦点维持单元和白光LED进行明场成像的倒置荧光显微镜观察。荧光标记AlexaFluor647（AF647）在640 nm激发，JF549-Hoechst在561 nm激发。发射的光采用兼容的二色镜和带通滤镜进行滤波，最后用科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机采集图像。

1. 安装样本玻片，找到焦点。如果系统有保持对焦的模块，建议激活（强烈建议长时间采集）。
2. 找到并聚焦于一个核心。最好在目标核附近放置一到几颗纳米金刚石，以更高效地纠正重建过程中的漂移。
3. （可选）捕捉低激光功率下的明场和每个荧光通道的衍射极限快照。
4. 在进行双色成像时，先采集较长波长的通道，然后切换到较短波长的通道（即在获取 JF549 之前获取 AF647 通道）。
   注意：本研究中使用的获取参数示例：
   通道A - 表位标记 - AF647
   曝光时间：20毫秒
   激光强度：640 nm – 2.2 kW/cm^²
   激发模式：HiLo²⁷
   通道B - DNA标记 - JF549-Hoechst
   曝光时间：50毫秒
   激光强度：561 nm - 1 kW/cm²
   激发模式：肾上腺素
   记录图像数量：每通道10,000-30,000张，确保每帧荧光团密度保持足够稀疏，以便准确定位单分子，而累计定位数则通过超分辨率QUantitative图像评级与误差报告（SQUIRREL）²⁸实证确定，该方法也显示了足够的帧数。

Results

上述方案能够制备适合SMLM的高质量 拟南芥 核。进行了多轮优化，以提升核完整性并减少影响图像质量的细胞质和细胞碎片。每完成一次优化步骤后，使用奥林巴斯IX81旋转盘显微镜进行共聚焦成像，评估核制剂质量，随后进入超分辨率采集。

共焦点成像
上述程序确实与共軛聚焦成像兼容。为此，步骤3.1中使用的LMA溶液可以基于PBS（或任何中性缓冲液或介质）。MEA和GLOX只对SMLM必要。另一方面，用于SMLM（步骤3.3）的基于JF的Hoechst稀释度过高，传统成像方法无法检测到。因此，使用Hoechst H33258在1/500稀释（1 mg/mL）下实现了共焦或荧光成像的DNA标记。

采用当前优化方案，从15天大的拟南芥野生型幼苗中分离出细胞核。RNA聚合酶II的主动延长形式，表现为C端结构域（CTD）上七肽串联重复序列的Ser2磷酸化，并用特异性一级抗体²⁹ 和AF647结合二级抗体^26...

Discussion

拟南芥核的制备用于单分子定位显微镜（SMLM）需要多个关键步骤，这些步骤对最终样品质量有重大影响。如^{前所述，彻底}且持续的组织切割对于最大化完整细胞核的恢复至关重要。使用切片刀代替标准剃刀刀片能实现更干净、更均匀的组织碎片化，从而改善细胞核的释放。后续的清洗和离心步骤同样重要，有助于减少杂物。这些步骤需谨慎进行，先用200微升微量移液器缓慢去除上清液，随后使用10微升微量移液器以减少核质损失。当颗粒特别紧凑时，将NIB缓冲液的悬浮容积增加到200–250微升，有助于防止聚集，并确保悬浮液更均匀。

可选的改装可进一步提升样品纯度和成像质量。在最终洗涤前进行简短的超声波处理步骤，去除杂质并分散聚集的核¹⁹;然而，过度的超声波处理可能会损伤核膜。此外，成像缓冲液可在真空下脱气以去除溶解氧，这有助于改善荧光团的闪烁——尤其是针对AF647，并消...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS（磷酸化S2）抗体	Abcam	ab5095	初级抗体在免疫染色缓冲液中以1/200的比例稀释，用于可视化聚合酶的活性形式（在兔子中产生的多克隆抗体）
采集软件	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C40
认证低熔点琼脂	Bio-Rad	1613111
盖玻片厚度1.5H圆形	Marienfeld	117640	Ø: 24毫米
D-(+)-葡萄糖，无水，99%	Thermo Scientific	A16828-36
二色镜	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	用于激发/发射分离的二色镜
Dulbecco’s磷酸盐缓冲液10´	biowest	X0515 - 500	在无菌条件下工作
Epredia Ultra一次性微切片刀片	FisherScientific	12191830	低型，一次性使用
Falcon 6孔透明平底TC处理多孔培养板，带盖	Falcon	353046
甲醛溶液37%	Carl Roth	7398	在烟道罩下工作
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	G2133
甘油	VWR	24388.295
山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	作为与AF647偶联的二级抗体，以1/200的比例使用
Hoechst 33258溶液	Sigma-Aldrich	94403	以1/500的比例用于DNA背景染色，加入琼脂垫
盐酸溶液	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab和Open Chemistry团队（Janelia）	JF549-Hoechst	用于染色DNA，以1.5 nM的最终浓度加入琼脂垫
KIMBLE Dounce组织研磨器套装	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL管与大（0.0030-0.0050英寸）和小（0.0005-0.0025英寸）间隙研磨棒
激光器单元	Oxxius	L6Cc	配备六个激光器：405 nm - 100 mW，488 nm - 200 mW，532 nm - 500 mW，561 nm - 300 mW，640 nm - 500 mW和730 nm - 30 mW
氯化镁六水合物	Carl Roth	HN03
巯基乙胺（MEA）	Sigma-Aldrich	30070
MOPS钠盐98%	Fisher Scientific SAS	352590010
多波段发射滤光片	Semrock	FF01-446/523/600/677	多波段发射过滤以阻挡激光散射光
纳米金刚石	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	库存1 mg/mL
ORCA-Fusion数字CMOS摄像机	Hamamatsu	C14440-20UP
培养皿，100/20毫米，PS，透明，带通风孔，无菌	Greiner Bio-One	664161	用于在1/2 MS培养基上培养植物
培养皿，方形，PS，透明，120/120/17毫米，无菌	Greiner Bio-One	688161	用于切割植物幼苗时使用
pluriStrainer Mini细胞过滤器	pluriSelect	43-10030-50	网格尺寸30微米，适合1.5毫升Eppendorf管
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
单波段发射滤光片	Semrock	FF01-698/70	AF647通道的特定发射滤光片
单波段发射滤光片	Chroma	ET600/50m	JF549通道的特定发射滤光片
氯化钠（99.5%）	Euromedex	1112-A
Star-Frost玻片76 x 26毫米	Knittel	VS112711FKB.01
无菌注射器过滤器ø 33毫米孔径0.2微米Luer Lock锥形	ClearLine	146560
超分辨率系统	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83配备100x NA1.5油浸物镜
三钠柠檬酸2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris基底分子生物学级别	Promega	H5135
Tris（2-羧基乙基）磷酸氢盐盐酸盐（TCEP）	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	硅基密封剂
紫外线臭氧清洁系统UVOCS烤箱	UVOCS Inc.	T10X10