拟南芥核单分子定位显微镜的简化方案

Summary

该方案为单分子定位显微镜成像提供了高效的工作流程，利用优化的分离、固定和标记，实现染色质和RNA聚合酶II的可靠纳米尺度可视化。该方法可轻松应用于其他染色质相关蛋白或组蛋白修饰，实现高分辨率成像。

Abstract

虽然共聚焦荧光显微镜为植物细胞核中染色质组织提供了宝贵见解，但其绕射极限分辨率限制了染色质结构的研究，促使采用单分子定位显微镜（SMLM）等超分辨率技术。在这些方法中，直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在单个细胞中提供纳米级分辨率，使染色质结构域、组蛋白修饰和细胞核组织的精确可视化成为可能。尽管此类方法在哺乳动物系统中日益应用，但由于样品制备的技术难题，它们在植物生物学中的应用仍然有限。

本文介绍了一种简化且可重复的SMLM成像流程，用于从 拟南芥中分离出的核。该方案从幼苗固定以保持细胞核形态开始，随后进行温和的组织切割和离心，以富集完整细胞核。分离出的核随后在液体培养基中进行荧光团标记，并固定在低熔融的琼脂糖垫上，这一策略增强了长时间单分子成像过程中的稳定性。这些步骤共同减少了背景荧光，提高了标记一致性，并提高了生物复制体间的重复性。

由此产生的制剂为植物中染色质修饰和核结构的可视化提供了更清晰的理解。通过降低在拟南芥中实现SMLM成像的技术障碍，该方案为研究表观遗传调控、染色质组织和核拓扑变异在纳米尺度上提供了一种多功能手段。本研究奠定了将SMLM应用于植物的方法论基础，弥合了哺乳动物细胞生物学的空白，并为研究核结构如何响应植物系统发育和环境信号对基因组调控的贡献开辟了新机遇。

Introduction

显微镜长期以来一直是研究染色质组织和核结构的基石，揭示了DNA和组蛋白相关蛋白如何在三维核空间中排列并影响基因调控^1,2。传统荧光显微镜为对大尺度染色质结构域（如染色体领域、染色中心和核实体^3,4）提供了宝贵见解，这些结构可原位进行，尤其是在植物的根组织中（^3,5,6）。然而，这些技术在根本上受限于光的绕射障碍，空间分辨率限制在横向约200纳米和轴向约500纳米。这一限制掩盖了染色质折叠、组蛋白修饰模式以及转录区隔的纳米级细节，这些都是表观遗传调控的基础。为克服这一障碍，开发了超分辨率显微镜（SRM）方法，如结构照明显微镜（SIM）⁸、受激发射耗尽（STED）^9,10 和单分子定位显微镜（SMLM）

Protocol

注意：本议定书中使用的材料和仪器的详细信息可在 材料表中查阅。除非另有说明，缓冲液在无风源0.2微米过滤器上进行清除。在整个方案中使用双重蒸馏超纯H₂O（ddH₂O）。离心步骤在1.5毫升微管中使用固定角度转子进行。

1. 幼苗的固定与核的释放

1. 将一个6孔培养板置于抽风罩下冰块上，然后在每个槽中加入约4毫升即兴制备的冰冷固定液（4%甲醇稳定甲醛，0.1%Triton X-100,1×磷酸盐缓冲生理盐水[PBS]）。
2. 使用干净的镊子，取出在发芽后8至15天内，这些幼苗在固体（0.8%琼脂）半浓度Murashige和Skoog培养基2.2克/升MS盐、1%蔗糖（w/v）、pH值5.7上生长，如文献²⁴所述MS幼苗，并立即将其浸入固定溶液中。大约用一口井种植20株幼苗（每个样本需要3口井以获得足够的材料）。
3. 将板放入充满冰块的真空腔体，并在0.2巴至0.8巴之间的压力循环下施加真空15分钟，以去除滞留空气，使固定剂深度渗透到^{植物组织中}。缓慢释放真空，搅拌样品，然后再施加真空15分钟。
4. 在排气罩下，用移液器取出固定溶液，并用5毫升....

Results

上述方案能够制备适合SMLM的高质量 拟南芥 核。进行了多轮优化，以提升核完整性并减少影响图像质量的细胞质和细胞碎片。每完成一次优化步骤后，使用奥林巴斯IX81旋转盘显微镜进行共聚焦成像，评估核制剂质量，随后进入超分辨率采集。

共焦点成像
上述程序确实与共軛聚焦成像兼容。为此，步骤3.1中使用的LMA溶液可以基于PBS（或任何中性缓冲液或介质）。MEA和GLOX只对SMLM必要。另一方面，用于SMLM（步骤3.3）的基于JF的Hoechst稀释度过高，传统成像方法无法检测到。因此，使用Hoechst H33258在1/500稀释（1 mg/mL）下实现了共焦或荧光成像的DNA标记。

采用当前优化方案，从15天大的拟南芥野生型幼苗中分离出细胞核。RNA聚合酶II的主动延长形式，表现为C端结构域（CTD）上七肽串联重复序列的Ser2磷酸化，并用特异性一级抗体²⁹

Discussion

拟南芥核的制备用于单分子定位显微镜（SMLM）需要多个关键步骤，这些步骤对最终样品质量有重大影响。如^{前所述，彻底}且持续的组织切割对于最大化完整细胞核的恢复至关重要。使用切片刀代替标准剃刀刀片能实现更干净、更均匀的组织碎片化，从而改善细胞核的释放。后续的清洗和离心步骤同样重要，有助于减少杂物。这些步骤需谨慎进行，先用200微升微量移液器缓慢去除上清液，随后使用10微升微量移液器以减少核质损失。当颗粒特别紧凑时，将NIB缓冲液的悬浮容积增加到200–250微升，有助于防止聚集，并确保悬浮液更均匀。

可选的改装可进一步提升样品纯度和成像质量。在最终洗涤前进行简短的超声波处理步骤，去除杂质并分散聚集的核¹⁹;然而，过度的超声波处理可能会损伤核膜。此外，成像缓冲液可在真空下脱气以去除溶解氧，这有助于改善荧光团的闪烁——尤其是针对AF647，并消.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗RNA聚合酶II CTD重复YSPTSPS（磷酸S2）抗体	阿布卡姆	AB5095	以1/200稀释度在免疫染色缓冲液中观察聚合酶活性形式的初级抗体（在兔子中培养多克隆抗体）
采购软件	阿贝莱特	NEO LiveImaging v2.18
牛血清白蛋白	西格玛-奥尔德里奇	A7906及nbsp;
过氧化氢酶	西格玛-奥尔德里奇	C40
认证低融琼脂糖	生物辐射	1613111
盖套厚度：1.5H圆形	马里恩费尔德	117640	Ø： 24毫米
D-（+）-葡萄糖，无水，99%	热力科学	A16828-36
二色镜	塞姆罗克	Di03-R405/488/561/635-t1	用于激发/发射分离的二色镜
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水10及急性;	生物西方	X0515 - 500	在无菌条件下工作
Epredia超一次性切片刀	费舍尔科学	12191830	低矮，一次性
Falcon 6孔透明平底TC处理多孔细胞培养板，带盖	猎鹰	353046
甲醛溶液 37%	卡尔·罗斯	7398	排气罩下的工作
葡萄糖氧化酶	西格玛-奥尔德里奇	G2133
甘油	VWR	24388.295
山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor Plus 647	热力科学	A32733TR	以1/200剂量作为二级抗体，偶联于AF647
Hoechst 33258 解	西格玛-奥尔德里奇	94403	以1/500比例使用，用于抵染DNA并加入琼脂糖垫
盐酸溶液	化学实验室	CL05.0311.1000
JF549-霍斯特	拉维斯实验室和开放化学团队（Janelia）	JF549-霍斯特	用于对DNA进行对比染色，加入琼脂糖垫上，最终浓度为1.5 nM
KIMBLE Dounce 纸巾研磨机套装	西格玛-奥尔德里奇	D8938	2 mL管，含有大（0.0030-0.0050英寸）和小（0.0005-0.0025英寸）的净化杵
激光单元	奥克修斯	L6Cc	配备六束激光器：405 nm - 100 mW，488 nm - 200 mW，532 nm - 500 mW，561 nm - 300 mW，640 nm - 500 mW，730 nm - 30 mW
六水酸盐氯化物	卡尔·罗斯	HN03
巰基乙胺（MEA）	西格玛-奥尔德里奇	30070
MOPS 钠盐 98%	费舍尔科学SAS	352590010
多频段发射滤波器	塞姆罗克	FF01-446/523/600/677	多波段发射滤波以阻挡激光散射光
纳米钻石	亚当斯纳米技术	NDNV100nmHiWGA2ml	原装 1 mg/mL
ORCA-Fusion 数字CMOS相机	滨松	C14440-20UP
培养皿，100/20毫米，PS，透明，带通风口，无菌	格赖纳生物一号	664161	用来用半毫秒培养基种植植物
培养皿，方形，PS，透明，120/120/17毫米，无菌	格赖纳生物一号	688161	用于切植苗
pluriStrainer 迷你细胞滤网	pluriSelect	43-10030-50	网格尺寸30和微型;m，适合1.5毫升Eppendorf管
氯化钾	西格玛-奥尔德里奇	P9333
单频段发射滤波器	塞姆罗克	FF01-698/70	AF647通道专用发射滤波器
单频段发射滤波器	色彩	ET600/50米	JF549通道专用发射滤波器
氯化钠（99.5%）	欧罗美德快报	1112-A
星霜幻灯片 76 x 26 毫米	尼特尔	VS112711FKB.01
无菌注射器过滤器与注射器;33毫米孔隙率0.2和微孔隙;m 卢尔·洛克锥	清晰线	146560
超解析系统	阿贝莱特	SAFe360	配备100倍NA1.5油浸物镜的奥林巴斯IX83
柠檬酸三钠 2H2O Gen-Apex 生物摩尔	普罗拉博	PRO-33615.268
Tris碱性分子生物学级	普罗梅加	H5135
盐酸三烯（2-羧乙基）磷酸盐（TCEP）	热力科学	20491
特里顿 X-100	欧罗美德快报	2000-B
二十岁以上	欧罗美德快报	2001-B
双轮速	Picodent	13001002	硅胶密封剂
紫外臭氧清洁系统UVOCS烤箱	UVOCS公司	T10X10	20分钟的暴露用于封面套片清洁
真空泵	真空品牌	VP 100C
赫雷厄斯机械16R离心机	热力科学		转子 TX-400 75003629。使用Eppendorf管进行离心。