通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

摘要

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。

摘要

小细胞外囊泡（sEVs）是一类纳米级的脂质包被颗粒，通过传递蛋白质、脂质和核糖核酸（RNAs）介导细胞间通讯。由于产量低且易受非囊泡成分污染，从骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）等实体组织中分离sEVs仍具挑战性。本方案描述了一种可重复地从小鼠SkM和BM中分离sEVs的工作流程。SkM采用酶消化法处理，而BM则直接处理，随后进行差速离心和尺寸排阻色谱（SEC）。对于SkM，弃去空体积（约2.5 mL），收集后续约1.6 mL的囊泡富集组分，通常分为400 µL的连续组分（F1–F4）。对于BM，弃去700 µL的空体积，随后收集约850 µL的囊泡富集组分，可进一步分为约170 µL的连续组分（F1–F5），并根据EV标志物富集情况合并组分。采用该方法，可从少量组织体积中分离sEVs（单侧股四头肌约500 µL，合并的股骨和胫骨骨髓约150 µL），获得约~10⁸ 粒子·mL⁻¹·mg⁻¹ 组织，粒子直径主要<200 nm。通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及经典EV标志物的Western blotting验证囊泡的完整性与纯度，并结合单粒子干涉检测技术对四跨膜蛋白定义的囊泡亚群进行进一步表征。该方法可在使用极少起始材料的前提下，实现从结构复杂的组织中可重复地分离高纯度sEVs，支持对组织来源囊泡进行下游分子和功能分析。

引言

小型细胞外囊泡（sEVs）是一类纳米级的脂质包被颗粒，通过传递蛋白质、脂质和核酸介导细胞间通讯¹。所有类型的细胞均可释放sEVs，它们几乎存在于所有生物体液中，作为生物活性物质（包括肽段和微小核糖核酸（RNAs））的关键载体发挥作用²。其内容物经过选择性分选，能够精确递送特定信号³；同时，囊泡结构使其能够克服自由分泌因子通常面临的浓度梯度和稀释限制，实现远距离传递高浓度的分子负载⁴。尽管来自生物体液（如血浆、血清和唾液）的细胞外囊泡（EVs）可提供系统性信号传导的便捷快照，但它们来源于多种组织，构成高度混合的群体⁵。这使得确定特定生物信号由哪个器官产生，或组织水平上EV介导的通讯如何被调控变得困难。由于循环中的EVs是多种来源的混合物，组织特异性的变化可能被稀释或掩盖，从而限制了对信号真实来源的识别能力⁶。

骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）是具有显著代谢活性和功能的重要组织，其细胞组成和信号作用各不相同^7,8。这两种组织均可能释放富含独特、组织特异性内容物的细胞外囊泡（EV）群体....

方案

所有动物实验程序均经麦吉尔大学动物护理委员会（DOUG10029）批准，并依照加拿大动物护理委员会的指南进行。

1. 骨骼肌来源的sEV（SkM-sEV）分离方案

1. 样本采集与组织解离
   1. 组织收获与保存
      1. 切除骨骼肌（SkM）组织后，立即将其浸入预冷的甲基丁烷中进行速冻。
         注意：为制备预冷的甲基丁烷，将甲基丁烷容器置于干冰浴中，并逐渐将小块干冰直接加入液体中。让溶液冷却，温度通常在−70°C至−80°C之间。使用过程中应将甲基丁烷保持在干冰浴中以维持温度。将组织浸入约3–4秒，直至完全冻结，表现为组织完全硬化并失去柔韧性。
      2. 将组织转移至冻存管中。
      3. 将样本置于干冰上。
         注意： 将样本储存在−80°C直至进一步处理。避免反复冻融循环。当样本密封良好时，快速速冻能有效保存细胞外囊泡（EVs）。若组织暴露在空气中或经历多次冻融循环，可能发生脱水或囊泡损伤¹³。
   2. 组织解离
      ​注意： 所有步骤均应在生物安全柜中使用无菌器械和手套进行，以防止污染，否则可能影响EV纯度。
      1. 称量组织 ....

结果

为评估该方案在分离组织来源sEVs方面的有效性，本文展示了来自SkM和BM样本的代表性结果。成功的分离需满足以下标准：（i）早期SEC组分中富集典型的EV标志物（TSG101、CD63、CD81和CD9）；（ii）细胞内污染物（如Calnexin和BiP）的检出量极低；（iii）粒子尺寸分布呈单峰，且大多数粒子 <200 nm；（iv）通过透射电子显微镜（TEM）观察完整且具有膜结构的囊泡；（v）与后期富含蛋白质的组分相比，EV富集组分中颗粒浓度更高。附加表征包括单颗粒四跨膜蛋白分析。相比之下，次优或失败的分离表现为早期组分中EV标志物富集微弱或缺失、细胞内污染物显著存在、颗粒粒径分布广泛或呈多峰分布，以及电子显微镜下缺乏清晰可辨的囊泡结构。这些标准与既定的小细胞外囊泡（sEV）表征指南一致。

骨骼肌来源的sEVs（SkM-sEVs）

骨骼肌组织经过酶解离、过滤和尺寸排阻色谱分离后（图1A），在早期SEC洗脱组分中持续检测到富含.......

讨论

本方案描述了一种稳健且可重复的方法，用于直接从骨骼肌（SkM）和骨髓（BM）这两种产量低且高度异质的组织中分离富含小细胞外囊泡（sEV）的组分。尽管细胞外囊泡（EV）的分离在生物体液和细胞培养体系中已有成熟方法，但由于组织解离困难、细胞内物质污染以及产量波动等问题，目前针对组织来源EV的标准化方法仍十分有限。本文详细阐述了影响EV纯度、产量和可重复性的关键步骤、故障排除策略及局限性，并特别针对SkM和BM样本的制备提供了具体建议。本研究中富含EV的组分是根据多个互补标准进行操作性定义的，包括典型EV标志物的富集、细胞内污染物的最低检出水平，以及与预期的尺寸排阻色谱（SEC）洗脱谱型的一致性¹⁰。因此，选择早期洗脱组分（SkM为F1–F4，BM为F1–F5）用于后续分析；而较晚的洗脱组分虽仍持续检出EV标志物，但同时伴随蛋白质含量升高和细胞内污染物水平增加，表明囊泡纯度降低（补充表1和2）。这些结果强调了在解析SEC洗脱组分时，应结合标志物检测与蛋白质含量评估的重要性，因为仅基于尺寸的分离无法区分囊泡性颗粒与非囊泡性颗粒

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Sarstedt	72.690.300	本方案中通用的微量离心管
1.5 mL 低蛋白吸附管	Sarstedt	72.706.600	用于细胞外囊泡（EV）操作、尺寸排阻层析（SEC）组分收集及储存
0.2 mL PCR 管	Fisher Scientific	14-222-262	用于穿孔管骨髓提取装置的搭建
16 G 针头	BD	305197	用于穿刺 0.2 mL PCR 管
30 µm 细胞筛	Miltenyi Biotec	130-098-458	用于骨骼肌样本过滤
70% 乙醇	Sigma-Aldrich	1.11727	用于镊子的灭菌
生物安全柜	NA	NA	用于无菌组织操作
骨组织切割器械	Fisher Scientific	10-001-976	用于分离股骨与胫骨并暴露骨髓
牛血清白蛋白（BSA）	BioShop	ALB001	用于 Western 印迹封闭及抗体稀释
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）	BioShop	CCL302	用于 HEPES 缓冲液的配制
200 目碳支持铜网	Sigma-Aldrich	930342	用于透射电子显微镜（TEM）样本制备
离心过滤器，100 kDa 截留分子量（MWCO）	MilliporeSigma	UFC810096	用于细胞外囊泡（EV）浓缩
胶原酶 D	Roche	11088858001	用于骨骼肌组织的酶解消化
冻存管	Sarstedt	72.690.300	用于组织和骨骼的储存
去离子水（超纯）	NA	NA	用于缓冲液配制及透射电镜（TEM）洗涤步骤
DNase I	Roche	11284932001	用于骨骼肌组织的酶解消化
干冰	NA	NA	用于样本冷却和运输
增强型化学发光底物	Biorad	1705061	用于 Western 印迹检测
滤器，0.22 µm	Sarstedt	83.3941.501	用于必要时过滤 PBS
镊子	MilliporeSigma	F3892	用于组织操作
戊二醛	NA	NA	用于透射电镜（TEM）固定
甘氨酸	NA	NA	用于透射电镜（TEM）载网洗涤步骤
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14175-095	用于 DNase I 储存液的配制
HEPES	BioShop	HEP001.500	用于 HEPES-NaOH 缓冲液的配制
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素	Thermo Fisher	S911	用于 Western 印迹检测
化学发光成像系统	Biorad	12003153	用于 Western 印迹膜的成像
KCl	BioShop	POC308	用于 HEPES 缓冲液的配制
氯化镁（MgCl2）	BioShop	MAG510.500	用于 HEPES 缓冲液的配制
2-甲基丁烷	Thermo Fisher	78-78-4	用于骨骼肌组织的速冻
毫克天平	MilliporeSigma	Z741359	用于组织和骨髓的称重
NaCl	BioShop	SOD004.1	用于 HEPES 缓冲液的配制
纳米颗粒追踪分析仪	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	使用 NanoSight NS300 进行颗粒尺寸分析与计数
NaOH	BioShop	SHY500.500	用于 pH 调节
硝酸纤维素膜	BioRad	1704271	用于 Western 印迹转膜
旋转混合仪	Labnet	S0500	用于酶解消化过程中的混合
P1000 移液器	MilliporeSigma	FA10006M-1EA	用于组织转移
移液器吸头，1 mL	Sarstedt	70.3050.275	吸头经修剪以扩大开口，便于组织碎片转移
磷酸盐缓冲液（PBS）	Wisent	INC 811.012-FL	本方案中广泛使用；也用于尺寸排阻层析（SEC）的平衡与洗脱
磷酸酶抑制剂	MilliporeSigma	4906845001	用于 Western 印迹裂解液的制备
培养皿	MilliporeSigma	CLS351146	用于骨髓制备
聚丙烯酰胺凝胶，4–20% 梯度免染胶	BioRad	4561094	用于 Western 印迹蛋白分离
蛋白酶抑制剂	MilliporeSigma	11697498001	用于 Western 印迹裂解液的制备
RPMI-1640 培养基	Sigma-Aldrich	R7388-500ML	未添加补充物；不含胎牛血清（FBS）或抗生素
RIPA 裂解缓冲液，10×	Merck	20-188	用于 Western 印迹的蛋白提取
手术刀片，无菌一次性	Ultident Paragon	02-90000-10	用于切碎骨骼肌组织
SEC 柱，原始型 70 nm	IZON	ICO70P	用于骨骼肌的尺寸排阻层析（SEC）
SEC 柱，单用型 70 nm	IZON	ICS70P	用于骨髓的尺寸排阻层析（SEC）
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	添加至 PBS 中用于柱子的洗涤
二甲胂酸钠缓冲液	NA	NA	用于透射电镜（TEM）固定缓冲液
无针鲁尔滑动一次性注射器	Medline	SYR101020	必要时用于纳米颗粒追踪分析（NTA）采集
透射电子显微镜	FEI	NA	使用 Tecnai G2 Spirit Twin 120 kV 冷冻透射电镜（Cryo-TEM）进行 TEM 成像
Tween-20	BioShop	TWN508.1	用于配制 PBS-T 进行 Western 印迹
醋酸铀	NA	NA	用于透射电镜（TEM）负染色
Whatman 滤纸	MilliporeSigma	WHA1003055	用于吸除多余的 TEM 染色液