绿色CuO/ZnO纳米颗粒：减少玉米中AFB1的转运与积累

摘要

本研究探讨了绿色合成的CuO/ZnO复合纳米颗粒在减少玉米中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）积累和转运方面的有效性，结果表明，125 mg/kg处理显著降低了AFB₁含量，从而最小化了人类和动物膳食暴露的风险。

摘要

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）是由曲霉属（Aspergillus）真菌产生的一种强致癌物，可污染玉米作物，通过膳食暴露对人类和动物健康构成严重威胁。传统的收获后管理和化学干预措施通常成本高昂，或难以有效阻止土壤中的毒素在植物生长期间向植株体内转移。本实验方案的主要目标是评估绿色合成的氧化铜/氧化锌（CuO/ZnO）复合纳米颗粒（NPs）作为可持续的收获前土壤改良剂的应用潜力。研究旨在确定这些纳米颗粒是否能有效抑制AFB₁在玉米组织中的转移与积累，从而降低可食用籽粒中的毒素含量。本研究采用随机完全区组设计，在两个不同的田间地点进行，玉米种植于接种了AFB₁或黄曲霉（Aspergillus flavus）孢子的土壤中，并施用不同浓度的纳米颗粒（0–125 mg/kg）。该方案采用牡蛎菇（Pleurotus ostreatus）基质进行绿色合成，以确保环境友好性。在不同生理发育阶段采集植株组织，利用高效液相色谱法（HPLC）检测AFB₁含量，并进行人类和家畜健康风险评估。施用125 mg/kg绿色复合纳米颗粒后，各生长阶段的AFB₁浓度均显著降低（p < 0.05）。在校内试验点，与阳性对照相比，营养生长期AFB₁减少68%，开花期减少82%，成熟期减少76%。关键的是，籽粒中AFB₁水平降至6.91 ppb，显著降低了对人体的估计日摄入量。然而，仍需进一步研究以评估纳米颗粒残留及其长期毒性。本方法表明，绿色合成的CuO/ZnO复合纳米颗粒可作为有效的生物修复剂，阻止毒素向植物可食用部分的转运。该策略具有可扩展性和环境安全性，有望在黄曲霉毒素高发地区提升粮食安全并减少AFB₁暴露风险。

引言

黄曲霉毒素，尤其是黄曲霉毒素B₁（AFB₁），由于其广泛存在、高毒性和对人类的严重影响，是最重要的真菌毒素之一。它们由某些真菌产生，主要是曲霉属（Aspergillus）真菌^1,2,3。AFB₁与肝细胞癌相关，是所有黄曲霉毒素中毒性最强的一种⁴。这些强效致癌物可侵染多种农作物，包括玉米（Zea mays L.），从而引发严重的食品安全问题^5,6。玉米中AFB₁的存在不仅影响作物产量和品质，还通过膳食暴露对人类和动物健康构成严重威胁^7,8。

目前，黄曲霉毒素的管理主要依赖于收获后的策略，例如适当的干燥、剔除受损的籽粒、化学处理（如氨或臭氧）、辐照以及密闭储存，以防止储存期间真菌的生长⁹。其他策略包括良好的作物管理、生物防控剂（如石灰）以及改进的储存设施¹⁰。物理和化学处理方法，如微波、紫外线（UV）、脉冲光、电解水、低温等离子体、臭氧、电子束和伽马辐照，也已得到测试¹¹。然而，这些收获后方法通常成本较高、耗能大，或难以广泛实施，并且无法阻止黄曲霉毒素在植物生长期间的体内转运。

目前正在采用的收获前干预措施包括农艺措施，如种植抗性品种、适时播种、灌溉以减轻干旱胁迫，以及利用产毒能力弱的黄曲霉（A. flavus）菌株进行生物防治（例如 Aflasafe）。这类菌株可通过竞争性排斥作用抑制产毒菌株，但需重复施用，且可能无法完全阻断土壤中的毒素转移^11,12,13。这些方法常面临局限性：收获后干预无法消除已存在的污染，在资源有限的地区还需承担高昂的分拣与储存基础设施成本，化学处理可能造成营养损失或化学残留风险，且生物防治的效果受环境条件影响而存在波动¹⁴。

相比之下，绿色合成的CuO-ZnO复合纳米颗粒提供了一种新型的采前土壤改良策略。与传统的化学纳米颗粒不同，利用植物提取物（如蘑菇基质）进行绿色合成可避免使用有毒溶剂，降低生产成本，并提高生物相容性，因而具有环境可持续性。^15,16CuO-ZnO杂化通过产生活性氧（ROS）、破坏真菌膜结构并提供高比表面积以增强抗真菌活性，具有协同作用。₁ 吸附，从而阻止其被植物吸收并转运至可食用部分（如谷物）。该方法与现有策略不同，可在土壤-植物界面实现早期干预，使黄曲霉毒素B1（AFB1）的阻控效率达到80-99%₁ 低剂量（例如 125 mg/kg）下实现减量，且不影响作物产量，也不留下有害残留物¹⁷主要优势包括：与化学杀菌剂相比更环保，与单一金属纳米颗粒或生物防治相比在多变的田间条件下具有更优的防治效果，以及在黄曲霉毒素高发地区（如撒哈拉以南非洲）具备可扩展地整合到农业生产实践中的潜力。

在这些材料中，金属氧化物纳米颗粒（NPs），特别是氧化锌（ZnO）和氧化铜（CuO），因其抗真菌特性及吸附毒素的能力而受到关注^18,19。例如，有研究报道，铜纳米颗粒（Cu NPs）能够产生活性氧（ROS），从而损害细菌和真菌的生物大分子²⁰。此外，在另一项实验中，当F. solani经壳聚糖基氧化铜纳米颗粒处理后，真菌菌株表现出显著变化，呈现出明显的有序化趋势，其中以有序化效应最为显著²¹。纳米颗粒的绿色合成作为一种更安全、可持续的方法，已引起广泛关注，相较于传统化学方法，可有效减少有毒副产物并降低环境影响^15,22。

CuO与ZnO纳米颗粒的复合结合了两种金属的有益特性，有望提高其对黄曲霉毒素B1（AFB）的降解或吸附效能₁^23,24目前，这些绿色合成的纳米颗粒主要用于体外实验中控制真菌菌株的黄曲霉毒素产生；例如，Sheik 和 Awad 研究了 AgNPs、AuNPs 及其混合物对真菌生长及黄曲霉毒素 B 的影响₁ 产黄曲霉毒素的积累 A. flavus 菌株²⁵。然而，所需的控制浓度 A. flavus 生长情况尚不明确。因此，迫切需要在接近实际环境的条件下评估绿色合成的CuO-ZnO杂化材料对黄曲霉菌（AFB）的影响₁ 与传统纳米颗粒相比，从添加土壤的来源向玉米组织中的转运。因此，本研究的目的是确定不同浓度的CuO/ZnO绿色杂化纳米颗粒对AFB的影响₁/A. flavus 玉米植株组织中的浓度，并评估黄曲霉毒素B1的暴露风险₁ 在用CuO/ZnO绿色杂化纳米颗粒处理玉米后。研究假设旨在为绿色合成的CuO-ZnO杂化纳米颗粒所表现出的功效提供机制性依据。本研究检验以下可量化的假设：1）抗真菌抑制假设，即杂化纳米颗粒将显著降低 A. flavus 孢子形成及后续过程 从头合成 抗酸杆菌₁ 与单一金属纳米颗粒相比，Molelwane 地点的土壤中真菌负荷和毒素水平较低，表明其产毒能力下降。2）吸附-转运假说：在已有毒素存在的条件下（Campus 地点），纳米颗粒表现出对 AFB 具有高结合亲和力₁，显著降低毒素从土壤向玉米根系的迁移速率。3）生物相容性（植物毒性）假说：与传统化学合成的纳米材料相比，绿色合成的杂化纳米颗粒在玉米组织中残留的金属积累量更低，氧化应激标志物更少，从而提高作物的生物安全性。

方案

实验地点
试验在相距7 km的两个地点进行，各试验点接种了不同的处理。第一次试验在南非西北省西北大学（NWU）研究农场莫勒尔瓦内（Molelwane, 25.810°S, 25.630°E, 1276 m）搭建了遮光率为40%的网室设施。该地的红砂壤土被归类为Hutton土型，含有75%的砂、4%的粉砂和21%的黏土²⁵。第二次试验在西北大学马菲肯校区（NWU Mafikeng campus，25.8278°S, 25.6079°E, 1276 m）的网室设施中进行。第二个试验点的土壤为砂壤土，含82%的砂、3%的粉砂和15%的黏土，此前被归类为Arcadia土型²⁵。CuO/ZnO绿色杂化纳米颗粒在南非西北大学自然与农业科学学院物理与化学科学学部化学系实验室中合成。

氧化铜/氧化锌绿色杂化纳米颗粒的合成
将10 g干燥的平菇（Pleurotus ostreatus）废弃菌渣基质（SMS）加入100 mL去离子水中，在70 °C下加热并搅拌2 h²⁶。随后将混合物冷却至室温，过滤后取30 mL滤液，加入含有2.5 g醋酸铜和2 g醋酸锌的30 mL蒸馏水溶液中。用氢氧化钠（NaOH）将该溶液pH调节至8，于80 °C加热反应2 h，反应结束后离心，产物在烘箱中过夜干燥，并在650 °C下煅烧2 h²⁶。所合成的纳米颗粒经表征确认为氧化铜/氧化锌绿色杂化纳米颗粒。

土壤采样与分析
土壤样品采自莫勒尔瓦内的大学农场和校园试验点，采样深度分别为0–15 cm和15–30 cm。随后根据文献²⁷所述方法，对样品进行分类，并分析其物理和化学性质。

实验设计
本研究采用随机完全区组设计（RCBD），设置三个重复，进行因子实验。为评估绿色合成的CuO-ZnO复合纳米颗粒在不同污染情景下的有效性，在两个独立地点设置了两种不同的暴露模式：地点1（西北大学校园）代表外源性污染模型，土壤中添加提取的AFB₁，添加量为160 ppb/kg，用于评估纳米颗粒的直接吸附能力及其对毒素转运的屏蔽作用；地点2（Molelwane 研究农场）代表生物感染模型，土壤中接种A. flavus孢子，接种量为160个孢子/kg，用于研究纳米颗粒对从头合成霉菌毒素的抗真菌效应及其对植物吸收的影响。接种（AFB₁或A. flavus孢子）后，将粉末状纳米颗粒称重并均匀混入1 kg土壤中，装入种植用塑料袋。每种处理独立操作，处理间需对手部进行消毒。每个花盆（上口直径9 cm，底部直径6.5 cm）中最初种植四粒玉米种子。出苗一周后，每盆保留三株健康幼苗，其余幼苗剪除。根据土壤分析得出的最佳玉米种植施肥建议，对土壤进行施肥。花盆按行距0.75 m × 株距0.3 m布置，共216个花盆。播种后，花盆中的土壤浇水至田间持水量的60%。在三个发育阶段采集土壤和植物样品：V10期（营养生长期）、R1期（开花期）和R6期（成熟期）。样品采集后立即放入装有冰块的冷藏箱中运回实验室，并于-20 °C保存以备进一步分析。剩余植物样品用牛皮纸袋封装后深度冷冻，用于AFB₁浓度测定及其他检测。用于AFB₁浓度及其他分析的剩余植物样品均保存在牛皮纸袋中，并深度冷冻至分析前。

玉米中黄曲霉毒素的分析
在不同生长阶段采集玉米的各个发育部位（根、茎、叶和籽粒），装入无菌塑料袋中，仔细标记后运送到实验室。为保持生长数据的完整性，并确保每个发育阶段的独立观测，采用破坏性取样方案。为避免不同纳米颗粒浓度和接种类型之间的交叉污染，每次处理组之间均使用70%乙醇清洁采收工具和手套，并用去离子水冲洗。取10 g植物材料和1 g氯化钠（NaCl），加入25 mL 80%甲醇和20%蒸馏水，用研钵和研杵研磨10分钟。对于玉米籽粒和玉米芯，取25 g粉碎样品和2.5 g NaCl，加入100 mL 80%甲醇:20%蒸馏水，高速搅拌10分钟。随后，将均质提取液通过玻璃微纤维滤膜过滤，并用20 mL含0.2% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。黄曲霉毒素经免疫亲和柱洗脱（流速为每秒一滴）后，收集上清液（胞质部分）至棕色小瓶中。然后，按照液相色谱法²⁸检测AFB₁及其他黄曲霉毒素，该方法包括使用邻苯二甲醛溶液对黄曲霉毒素进行衍生化，并将衍生化产物注入高效液相色谱（HPLC）系统。HPLC系统配备Jasco FP-920荧光检测器，激发波长设为362 nm，发射波长设为425 nm。AFB₁因其固有的生理结构，可在362 nm激发波长下被有效检测。色谱柱采用Hichrom柱（4.6 mm × 150 mm），填料粒径为5 µm，衍生化反应器使用KOBRA Cell程序，电流为100 µA。色谱峰的分离在Hichrom柱上进行，该柱前端连接有相同固定相的预柱。Inertsil ODS-3和ODS-3 V分别用作保护柱和分析柱，进样器由带Rheodyne阀的自动进样器组成。流动相由水:甲醇（65:35, v/v）、溴化钾（119 mg）和4 M硝酸（350 µL）每升组成，在等度洗脱程序下以1.0 mL/min的流速泵送。当检测到的色谱峰保留时间与标准品一致，且峰高超过基线噪声五倍时，即判定为黄曲霉毒素阳性²⁹。

通过公式1、2和3分别计算检测限（LOD）、定量限（LOQ）和回收率（%），以验证HPLC分析方法的可靠性。LOD是指能够与背景噪声可靠区分的黄曲霉毒素最低浓度，而LOQ是指能够以可接受的精密度和准确度进行定量测定的黄曲霉毒素最低浓度³⁰。通过向阴性玉米对照样品中加入10 µL的总黄曲霉毒素标准品（AFB₁、AFB₂、AFG₁ 和 AFG₂），每组设三个重复，以回收AFB₁及其代谢物。随后采用前述方法通过HPLC对样品进行提取。

检测限 = X + 3s　　1

定量限 = X + 10s     2

    3

其中：“X”为加标样品空白值的平均浓度，“s”为样品的标准偏差。

AFB1 暴露量估算
利用玉米饲料中的平均黄曲霉毒素水平、玉米的日摄入量以及平均体重（儿童、成人、肉牛、奶牛和雏鸡），计算估计每日摄入量（EDI）。根据公式 2 计算黄曲霉毒素的平均 EDI，并以（ng/kg 体重/天）表示；在计算危害指数（HI）时，将 EDI 值转换为 ng/kg 体重/天（1 ppb/kg/天 = 1,000 ng/kg 体重/天），以与 TD5032³¹ 的单位一致。

      4

风险评估与表征
危害指数（HI）通过将每日暴露剂量（EDI）除以TD50，并乘以50,000的安全系数计算得出。半数中毒剂量（TD50）是指在原本不会因零剂量而产生肿瘤的实验动物中，引发50%个体出现肿瘤所需的剂量（ng/kg/体重/天）^31,32。

数据分析
使用 SAS 9.4 软件（SAS Institute Inc.，美国北卡罗来纳州凯里）中的 RCBD 程序对收集的生长和产量数据进行方差分析。采用 Tukey 的真实显著性差异（HSD）检验³³对最小二乘均值进行多重比较。

结果

生长组分中的黄曲霉毒素浓度
结果表明，在施用绿色合成的 CuO/ZnO 纳米颗粒（NPs）的生长组分及玉米籽粒中均检测到黄曲霉毒素，表明所有主要类型的黄曲霉毒素（AFG₂、AFG₁、AFB₂ 和 AFB₁）均存在。用于计算黄曲霉毒素浓度的校准曲线在不同黄曲霉毒素之间表现出良好的线性关系，r² 值范围为 0.9999 至 1（图 1 和补充文件 1）。高效液相色谱法（HPLC）的验证通过黄曲霉毒素类似物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）值进行说明，分别为 0.006 至 0.07 ppb 和 0.002 至 0.2 ppb（表 1）。在校内试验点，总黄曲霉毒素（Afs-total）的平均回收率范围为 95% 至 102%（表 2，图 2），表明回收率可接受且方法...

讨论

该方案在减少AFB方面的成功₁ 易位和积累在玉米中依赖于多个关键步骤，这些步骤可确保生物学效应和分析可靠性的实现^16,27结果表明，125 mg/kg的绿色合成CuO-ZnO杂化纳米颗粒显著降低了AFB₁ 两种实验模型中的浓度均如此，尽管其潜在机制可能不同¹⁶吸附动力学（校园站点）：在校园站点，玉米暴露于预提取的 AFB₁，植物组织中毒素含量显著降低（V10期减少68%，R1期减少82%），表明该杂化纳米颗粒能有效吸附土壤基质中的毒素，从而降低其被根系吸收的生物可利用性（图4)^17,18,19抗真菌抑制作用（Molelwane 地点）：相反，在 Molelwane ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸铜(II) [Cu(CO2CH3)2]	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, USA	10,53,753	深蓝绿色结晶固体（纯度98%）
玻璃微纤维滤膜	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, USA	1703965	硼硅酸盐玻璃
高效液相色谱（HPLC）系统	Shimadzu	20H2	用于分析物的分离与定量
色谱纯乙醇	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, USA	34923	高纯度无色溶剂（≥ 99%）
色谱纯甲醇	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	322415	高纯度无色溶剂（≥ 99%）
免疫亲和柱	Shimadzu	KJ524	用于目标分析物的选择性纯化
PAN 5R-590R 玉米种子	NWK	N/A	小而坚硬的白色胚乳籽粒
磷酸盐缓冲液（PBS）	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	3526580	等渗缓冲溶液
塑料袋	Eco-Agro Enterprise (Pty) Ltd	N/A	带孔
纯化的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 及原位总黄曲霉毒素（AFs-total）	Trilogy Analytical Laboratory, Inc (Vossbrink Drive, WA, USA)	TAS-M12DA1-10	白色至微黄色结晶固体
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, USA	N/A	白色结晶固体
乙酸锌 [Zn(CH3COO2)2H2O]	VWR chemicals	2331 210 2	白色结晶固体（纯度99%）