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方法文章

小鼠脑微血管内皮细胞的分离与培养

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DOI：

10.3791/70909

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2026年7月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

本文内容

摘要

一种从新生小鼠脑组织中分离和原代培养脑微血管内皮细胞（BMECs）的方案，用于建立稳定的体外血脑屏障模型 体外 用于研究生理和病理条件下血脑屏障功能的模型。

摘要

脑微血管内皮细胞（BMECs）是血脑屏障（BBB）的主要细胞成分，在调控分子转运和维持中枢神经系统稳态中发挥关键作用。可靠的 体外 脑血管内皮模型对于研究神经系统及全身性疾病中血脑屏障（BBB）的生理与功能障碍至关重要。本文描述了一种可重复的小鼠新生脑皮层脑微血管内皮细胞（BMEC）分离与原代培养的实验方案。该方法包括皮层组织解剖、机械与酶解离解、利用牛血清白蛋白（BSA）密度梯度去除髓鞘碎片，以及基于CD31的免疫筛选富集内皮细胞。分离后的细胞在胶原包被的培养板上进行培养，并通过形态学评估、内皮标志物的免疫荧光检测、血管生成管状结构形成实验以及跨内皮电阻（TEER）测量来评估其屏障特性。该方案为获得适用于生理与病理条件下研究血脑屏障生物学、内皮信号传导及神经血管相互作用的原代BMEC培养体系提供了可靠方法。 关键词：脑微血管内皮细胞，血脑屏障，原代培养，CD31免疫筛选，跨内皮电阻，管状结构形成，小鼠新生皮层

引言

血脑屏障（BBB）是一种高度特化的结构，严格调控中枢神经系统（CNS）与体循环之间的物质交换1。血脑屏障主要由通过紧密连接相连的脑微血管内皮细胞构成。这些内皮细胞存在于一种称为神经血管单元（NVU）的多细胞系统中，该系统还包括星形胶质细胞、周细胞、神经元、胶质细胞以及基底膜2。在这些组分中，脑微血管内皮细胞（BMECs）发挥核心作用，它们形成具有紧密连接的连续层，拥有数千种选择性转运系统，囊泡运输有限，并通过低表达黏附分子来限制免疫细胞浸润，从而限制溶质和细胞进入脑实质3,4。

除了作为物理性和选择性屏障外，脑微血管内皮细胞（BMECs）还积极参与多种重要过程，包括神经血管信号传导、脑血流调节、局部免疫反应，尤其是脑血管生成5。后者在胚胎发育过程中至关重要，但在中风、缺血或炎症等病理条件下也会被重新激活。BMECs 能响应促血管生成信号，如血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PLGF），协调新血管的形成与成熟6,7。因此，脑内皮功能障碍将严重损害血脑屏障（BBB）的完整性和脑内环境稳态。

研究BMECs 体外 能够帮助我们模拟血脑屏障的生理特性以及调控脑血管生成的机制。然而，由于神经组织结构复杂、髓鞘含量丰富，且需要获得内皮细胞纯度较高的培养物，从脑组织中分离这些细胞面临重大的技术挑战。尽管已有永生化细胞系可供使用，但其在表型和功能上的代表性存在显著局限性8.

在此背景下，源自新生小鼠模型的脑微血管内皮细胞（BMECs）原代培养方案构成了一种强大的实验工具，因为它们保留了脑内皮细胞在体内的多种形态学、分子和功能特性。in vivo. 然而，目前已有的一些小鼠BMEC分离方案依赖于机械解离结合密度梯度（如葡聚糖或Percoll），常导致内皮细胞富集程度不稳定，并残留周细胞、星形胶质细胞及髓鞘碎片的污染9。采用嘌呤霉素进行抗生素筛选可提高内皮纯度（高达约95%），但因其抑制蛋白质合成，可能引起细胞应激，并对内皮表型产生潜在影响10。另一种方法是基于荧光激活细胞分选（FACS）的技术，可获得高度纯化的细胞群体，但需要专用设备且操作繁琐，可能降低细胞活力和可扩展性11。较新的新生小鼠方案则避免使用密度梯度，并减少离心步骤，从而在提高产量的同时有效控制污染12。

基于上述背景，本研究描述了一种优化的小鼠新生脑微血管内皮细胞分离与培养方案。该方法结合了精确的解剖分离、高效的酶消化、利用牛血清白蛋白（BSA）梯度去除髓鞘，以及使用与CD31标记物偶联的磁性微珠进行免疫筛选富集。本方案可获得具有活性、可重复且高度富集的原代细胞培养物，适用于在生理和病理条件下对脑血管生成、神经血管相互作用、内皮细胞信号传导及血脑屏障功能障碍的研究。

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方案

比奥比奥大学生物伦理与生物安全委员会批准了本项目（Fondecyt 基金编号 1240925）。动物实验严格按照实验动物使用中“3R原则”的核心准则进行。13 并遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》中的建议14动物在比奥比奥大学动物饲养室的标准饲养条件下饲养（12小时光照/12小时黑暗循环，温度控制在22 ± 2 °C，提供 随意摄取 自由饮水和采食。

为获取细胞，选用4至6个月大的野生型（WT）妊娠小鼠（C57BL/6）。分娩后，仔鼠与母鼠共同饲养至出生后第5天（P5）。在此时间点，仔鼠通过异氟烷深度麻醉至反射消失，随后实施安乐死。低温仅作为辅助手段以减少动物活动，并立即继以断头处理。所有操作均遵循美国兽医协会（AVMA）《动物安乐死指南》（2020年）15以及国际实验动物护理与使用规范（NIH）14。分离脑皮层组织并用于建立本实验方案（见方案步骤3）。材料表列出了本方案中所使用的材料和抗体。

1. 准备内皮细胞培养基

  1. 为小鼠脑微血管内皮细胞准备 500 mL 培养基时，在无菌容器中混合 250 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 与 250 mL 添加了 10% FBS 的内皮细胞培养基。
    注意：该培养基提供必需的内皮细胞生长因子并支持细胞增殖。若无法获得文中所列产品（见材料表），可向 DMEM + FBS 中添加等效的内皮细胞补充成分（例如 ECGS、氢化可的松和 L-谷氨酰胺），以达到相似的生长条件16。
  2. 将完全培养基（含 10% FBS）经 0.22 µm 滤膜无菌过滤，以确保无菌。
  3. 将配制好的培养基于 4 °C 保存，直至使用。每 2–4 周配制新鲜培养基，以维持生长因子活性。

2. 包被培养板

注意：为了促进细胞贴壁并维持内皮细胞表型，培养板必须预先包被I型胶原蛋白。该过程的步骤如下：

  1. 通过将 I 型胶原蛋白（0.1 mg/mL）、乙酸溶剂溶解胶原蛋白，并加入无菌基础培养基至总体积为 15 mL，配制预包被溶液。轻轻混匀直至胶原蛋白完全溶解，必要时将溶液调节至pH 4.0。使用 0.22 µm 滤器对溶液进行无菌过滤，并在使用前置于冰上保存，以维持胶原蛋白的稳定性。
    注：I 型胶原蛋白可模拟基底膜，支持内皮细胞的贴附，并有助于维持细胞表型。
  2. 在无菌条件下将溶液充分混匀。将溶液均匀涂布于培养板的整个表面。
    注：仅使用足以覆盖表面的体积。
  3. 将培养板置于 37 °C 培养过夜（12–16 小时），以使胶原蛋白充分吸附。在接种细胞前，去除多余的包被溶液，并用无菌 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 7.4）洗涤培养板 2 次，以去除残留的酸和未结合的胶原蛋白。

3. 脑混合细胞培养物的分离

注意：本方案基于先前旨在从小鼠大脑皮层（P5）分离脑微血管内皮细胞（BMECs）的报道9,17。

  1. 使用异氟烷深度麻醉处死五只P5幼鼠；仅可将低温作为辅助手段，随后进行颈椎脱位。
    注意：从本步骤开始，所有操作均须在层流式生物安全柜中进行。
  2. 取出大脑（图1A），将其置于含无菌冷PBS（1x）的50 mL锥形管中，直至所有大脑处理完毕。
  3. 将每只大脑在无菌硝酸纤维素膜上轻轻滚动，以分离脑膜。将去除了脑膜的大脑转移至含有冷PBS（1x）的100 mm培养皿中。使用无菌手术刀切除脑干、小脑、丘脑和嗅球（图1B，C）。
  4. 收集去除脑膜后的大脑皮层，并将其保存在冷PBS（1x）中。立即将所有脑皮层转移至含有5 mL冰上预冷的PBS（1x）的50 mL锥形管中（图1D）。
  5. 使用无菌剪刀进行机械解离，随后用1 mL移液器反复吹打，直至肉眼不可见组织块，悬液呈均一状态（图1E）。
    注意：可剪去移液器吸头尖端以减少吹打过程中的机械剪切力。通过控制吸力和轻柔吹打实现组织解离，较宽的吸头开口可最小化剪切力和机械性细胞裂解，从而保持细胞活力。
  6. 收集全部组织并置于15 mL离心管中。
  7. 为消化组织，将样品转移至含有2 mL胶原酶溶液（2 mg/mL，溶于DMEM）的无菌15 mL锥形管中，在37 °C、180 rpm的振荡培养箱中孵育2小时。
  8. 消化完成后，向悬液中加入5 mL含10% FBS的DMEM，于3,000 × g 离心10分钟（见 图1F）。弃去上清液。
  9. 为去除髓鞘，将沉淀重悬于4 mL含20% BSA（w/v）的PBS中，于3,000 × g 离心20分钟（图1G）。离心后，使用巴斯德吸管小心吸除含有髓鞘的上层乳白色液体，并弃去剩余上清液（图1H）。
  10. 将沉淀重悬于2 mL含10% FBS的DMEM中，再次于3,000 × g 离心10分钟。弃去上清液后，将最终沉淀轻柔重悬于1 mL含10% FBS的DMEM中。
    注意：此时的重悬液包含由组织解离所得的多种脑源性细胞群体。该混合物可能包括脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞及其他神经细胞。后续需通过纯化与培养步骤选择性富集脑微血管内皮细胞（BMECs）。
  11. 在接种分离细胞前，从已准备好的培养板中移除包被液（见步骤2.3），并用无菌PBS（1x）清洗每孔两次。
  12. 将重悬的细胞（步骤3.10）接种至包被的培养板中（推荐使用60 mm培养皿）。
    注意：通常，一次分离所获得的全部细胞悬液可分配至一个或两个包被培养皿中，每个培养皿含5 mL内皮细胞生长培养基。
  13. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中，使用内皮细胞培养基进行培养。每2–3天更换一次培养基。当细胞融合度达到90–100%时，使用CD31包被的磁珠进行免疫筛选，以富集内皮细胞。
    注意：在完成分离及初始培养建立后，每次制备通常可获得约5 × 106 个细胞，这些细胞可贴附于胶原包被的培养板，并形成内皮单层细胞典型的鹅卵石样形态。

4. 使用 CD31 磁珠分离脑微血管内皮细胞（BMECs）

  1. 细胞的准备与消化
    1. 当细胞培养至90–100%融合时，用PBS（1×）洗涤细胞3次，以去除残留培养基。
    2. 向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶（0.5% 1×），于37 °C孵育3–5分钟，使细胞脱落。
    3. 加入1 mL含10% FBS的内皮细胞培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液（约2 mL）转移至无菌微量离心管中，在4 °C下以220 × g离心10分钟，弃去上清液。
  2. CD31磁珠的准备
    1. 取8 µL CD31磁珠置于新的15 mL离心管中，加入1 mL 1% Hank’s溶液洗涤磁珠，并通过轻轻晃动管壁使磁珠重悬。
    2. 将离心管置于磁力架上2分钟，使磁珠沉淀。小心吸除上清液，避免扰动磁珠。重复洗涤步骤3次。
      注意：操作过程中应始终靠近磁力架，以防磁珠丢失；所有步骤均需在无菌条件下进行，以避免原代细胞培养污染。
  3. 细胞与磁珠孵育
    1. 将细胞沉淀用1 mL含FBS的1% Hank’s溶液重悬（以减少非特异性结合）。
    2. 使用1,000 µL移液器将细胞转移至含有预洗磁珠的离心管中。冰上轻柔振荡孵育20分钟。
  4. 内皮细胞的磁分离
    1. 将离心管置于磁力架上3分钟，使结合磁珠的内皮细胞沉淀。
    2. 小心吸除上清液。
      注意：在此阶段可获得两种分离的细胞类型——一种为内皮细胞（见步骤4.5），另一种为多种脑细胞的混合物。此时有两种选择：
      1. 保持离心管置于磁力架上，移除并弃去上清液（即脑细胞混合物）。用2 mL Hank’s溶液洗涤磁珠结合的细胞（即CD31+细胞），重复洗涤3次。
      2. 利用含有细胞碎片的上清液建立新的未筛选细胞培养体系（例如成纤维细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元、周细胞等）。
  5. 纯化脑微血管内皮细胞（BMECs）的培养
    1. 将磁珠结合的内皮细胞重悬于7 mL完全内皮细胞培养基（含10% FBS）中。
    2. 将细胞接种至预先用胶原蛋白包被过夜的60 mm培养皿中（见第2节）。在标准条件下（37 °C，5% CO₂）孵育。
      注意：在所述培养条件下，内皮细胞表型可维持至第3代（p3）。为保持血脑屏障相关特性，建议使用早期代次（p0–p3）进行实验检测。

5. 细胞鉴定

  1. 微观测量珠捕获的细胞
    注意：在本方案所述的培养条件下，原代BMECs通常可维持培养至多 三代（p3） 同时保持其特征性的内皮细胞形态和表型。根据接种密度和生长速度，培养物通常可维持 长达约2–3周 体外 在显著的表型变化发生之前。
    1. 使用CD31磁珠进行免疫筛选后，在相差显微镜下观察贴壁细胞（图2A).
      1. 在5–7天内观察CD31阳性内皮细胞，其应呈现典型的鹅卵石样形态并形成均一的单层细胞层。
        ​注意：在免疫筛选过程中，CD31包被的磁珠可特异性结合内皮细胞，从而富集内皮细胞群体。筛选过程结束后，在早期传代中仍可能观察到磁珠（直径约4.5 µm）与内皮细胞结合或被其内化。这些磁珠通常会随着后续的洗涤和培养维持而逐渐减少，且不会影响脑微血管内皮细胞（BMEC）的活力或细胞生长。 （图2B）。
      2. 利用内皮细胞形态均一且无细长或星形胶质细胞样细胞的特征，评估内皮细胞群体的纯度。
  2. CD31 和 GLUT1 的免疫荧光染色
    1. 接种 2 × 103 在胶原蛋白包被的盖玻片上培养BMECs，并继续培养至细胞融合度达到80–90%。
    2. 用4%多聚甲醛在室温（22–25 °C）固定细胞10分钟，随后用PBS洗涤。
    3. 用0.1% Triton X-100透化5分钟，然后用5% BSA封闭非特异性结合位点30分钟。
    4. 4 °C 条件下与抗 CD31 和 GLUT1（脑血管内皮特异性葡萄糖转运蛋白）的一抗共同孵育过夜。
    5. 用 PBS 洗涤，并与适当的荧光标记二抗在室温下孵育 1 小时。
    6. 用复染剂染色细胞核 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并用抗荧光淬灭封片剂封片。
    7. 在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察，寻找定位于细胞边界的 CD31图3A），而GLUT1呈现胞质和膜分布，可确认内皮细胞身份及脑内皮表型（图3B).
      注意：来自独立BMEC分离实验的代表性图像展示了培养的BMEC典型的形态特征和标志物表达。紧密连接蛋白（如claudin-5）的存在也可用于表征脑血管内皮细胞。为进一步评估内皮细胞培养的纯度，可使用其他神经细胞类型的阴性标志物进行额外的免疫荧光染色。例如，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）可用于检测星形胶质细胞，离子化钙结合接头分子1（Iba1）可用于鉴定小胶质细胞。这些标志物染色的缺失表明培养物中无上述非内皮细胞群体的污染图3C，D).
  3. 管形成实验
    注意：内皮细胞在 Matrigel 实验中表现出促血管生成能力18，内皮细胞身份可通过该检测进行确认。
    1. 用Matrigel包被96孔板，并在37 °C下孵育30分钟使其聚合。
    2. 接种 1 × 104 每孔加入100 µL完全内皮培养基（含10% FBS）中的BMECs。在37 °C培养，使用相差显微镜在4–8 h内监测管状结构形成。图4A).
    3. 使用 ImageJ（血管生成分析插件）量化总管长、 junction 数量和网状结构数量19. (图4B).
      注意：BMECs 形成相互连接的管状结构的能力证实了其血管生成潜能和内皮细胞功能。
  4. 跨内皮电阻（TEER）的测量
    注意：脑血管内皮细胞必须形成紧密的屏障，因为它们是血脑屏障（BBB）的关键组成部分20需要确认内皮细胞形成电屏障的能力。 
    1. 在胶原蛋白包被的Transwell小室（孔径0.4 µm）上室接种20,000个BMEC，培养至细胞融合。
    2. 使用上皮细胞伏特-欧姆计测量经上皮电阻（TEER）以评估单层细胞的完整性。每日记录TEER值直至数值稳定；电阻值的升高表明紧密的细胞间连接形成，这是功能性内皮屏障的特征。 （图4C）。
      注意：未被选中的细胞混合物（包括星形胶质细胞）的残留物可用于建立共培养系统。该体系需要对上层（BMECs）与下层（未被选中的细胞混合物）之间的细胞比例进行仔细优化，各实验室应根据自身条件对该比例进行标准化。此共培养体系改编自先前报道的血脑屏障模型。21.
    3. 将未筛选的细胞混合液（步骤 4.4.2.2）接种至培养板的下室，将 BMECs 接种至 Transwell 小室膜的上室。
      注意：本实验以单培养和共培养条件的代表性实验为例，通过跨上皮电阻（TEER）测量评估屏障紧密性 （图4C）。

6. 纯化脑微血管内皮细胞的扩增与维持

  1. 培养条件
    1. 将纯化的脑微血管内皮细胞（BMECs）在完全内皮细胞培养基（含10% FBS）中，于37 °C、95%湿度、5% CO₂的恒温培养箱中进行培养。每2–3天更换一次培养基，以提供新鲜营养并维持细胞活力。
  2. 细胞生长与形态观察
    1. 每日在相差显微镜下观察细胞培养情况，监测细胞贴壁、生长状态及形态变化。注意观察BMECs典型的“鹅卵石”样形态，通常在5–7天内形成融合的单层细胞。
  3. 传代培养与扩增
    1. 当细胞融合度达到80–90%时，使用0.05–0.1%胰蛋白酶在37 °C条件下消化3–5分钟，使细胞脱落。
    2. 加入等体积的完全培养基中和胰蛋白酶活性，于4 °C下以220 × g 离心10分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于新鲜内皮细胞培养基中。
    3. 将细胞以所需密度接种至胶原包被的培养皿中继续扩增。
      注意：为维持内皮细胞表型及功能完整性，BMECs传代次数应限制在3–5代以内。
  4. 可选的冷冻保存
    1. 如需长期保存，将BMECs重悬于冻存液（含10% DMSO的完全内皮细胞培养基）中，使用程序降温仪逐步降温至–80 °C，随后转移至液氮中长期保存。

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结果

本文所述方案可用于从新生小鼠（P5）中分离和培养原代脑微血管内皮细胞（BMECs）。这些细胞是血脑屏障（BBB）的主要细胞组分，因此是研究脑血管生理学及病理生理学的宝贵实验工具。通过形态学、表型和功能评估，已证实脑微血管内皮细胞（BMECs）的成功分离与培养。

分离流程获得的细胞悬液来自切除非皮质区域、经酶消化以及使用BSA梯度去除髓鞘后的脑皮层组织，如图1A–H所示。经过离心步骤后，得到含有细胞的沉淀，用于后续培养。

分离后第5天，细胞总群在免疫筛选前为混合细胞群体（图2A）。经基于CD31的磁珠分选后，内皮细胞得到富集，分选后可见与磁珠结合的细胞（图2B）。随着时间推移，脑微血管内皮细胞（BMECs）逐渐扩增，并呈现典型的鹅卵石样形态，在免疫分选后第3至7天形成融合的单层细胞（

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讨论

脑微血管内皮细胞（BMECs）的分离是研究血脑屏障（BBB）生理调控机制及其在多种中枢神经系统（CNS）病理状态下功能障碍的重要工具4,9，包括中风。与永生化细胞系不同，原代脑微血管内皮细胞（BMEC）培养物保留了脑血管内皮细胞的关键表型和功能特征，包括紧密连接蛋白的表达以及具有代表性的血管生成能力 体内 背景8,10.

本文介绍了一种优化的、可重复且技术上易于操作的方案，用于从出生后小鼠脑组织中分离和培养脑微血管内皮细胞（BMECs）。该方案能够获得高活力和功能性的内皮细胞富集群体，适用于信号传导研究、血管生成以及屏障特性的评估。通过使用胶原酶进行酶消化、BSA梯度法高效去除髓鞘，以及利用抗CD31抗体进行磁性免疫筛选，形成了一种有效的策略，可从神经组织中其他细胞群体污染极小的情况下纯化脑内皮细胞

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披露

作者声明无任何利益冲突。

本手稿的部分内容使用了OpenAI的ChatGPT（GPT-4，2025年7月版本）以提升表述的清晰性、语言质量和逻辑连贯性。作者对所有由人工智能辅助生成的内容进行了批判性审阅、修改并最终批准。未使用任何人工智能工具进行数据分析、结果解释或科学结论的生成。

致谢

作者谨向隶属于 GRIVAS Health 和 NEUROVAS 的研究人员致以诚挚感谢，感谢他们提供的宝贵意见。本研究由 Fondecyt Regular 1240295 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60 mm 培养皿康宁430166
96孔培养板康宁41122107
乙酸Sigma-AldrichA6283
抗生素-抗真菌剂（可选）Gibco15240062
抗CD31Santa Cruz sc-466941:100
抗GFAP赛默飞世尔科技13-03001:500
抗GLUT1Abcamab1157301:200
抗Iba1圣克鲁斯sc-327251:500
抗小鼠 IgG Alexa Fluor（594 染料）赛默飞世尔科技A-110051:500
Alexa Fluor 标记的抗兔 IgG  （488染料）赛默飞世尔科技A-110081:500
自动移液器和血清移液器 牛津LP  OXL.OXL.OSP-5C
基础培养基（用于胶原蛋白溶液）Gibco（DMEM）11965092
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA9647
II型胶原酶Sigma-AldrichC6885
DAPI赛默飞世尔科技622481 µg/mL
DMEM（高糖）赛默飞世尔科技11965092
EndoGRO-MV 完全培养基默克密理博SCME004内皮细胞生长培养基
Falcon 管（15 && 50 mL康宁®352096 / 352070
胎牛血清（FBS）Gibco（Thermo Fisher）16000044
荧光显微镜MoticBA410
手套、口罩、实验室耗材多家供应商—
肝素（100 U/mL）Sigma-AldrichH3393
倒置显微镜奥林巴斯 CKX41
磁力分离磁铁EasySep  NC9284020
轨道摇床（37 °C)赛默飞世尔科技SK-0180-S
Parafilm贝米斯PM996
PBS（1×)赛默飞世尔科技10010023
冷冻离心机HITACHICT5RE
手术刀Fine Science Tools各种
剪刀和精细镊子精细科学工具各种
无菌硝酸纤维素膜BIO-RAD1620094
I型胶原蛋白康宁 30394

参考文献

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