由成体干细胞生成与分化人嗅觉上皮类器官

摘要

本方案概述了一种从成人人类上鼻甲组织中分离嗅觉前体细胞以生成嗅觉上皮类器官的既定方法。同时详细描述了一种化学诱导策略，用于促进这些类器官分化为成熟的嗅觉感觉神经元，从而实现人类嗅觉神经发生的建模。

摘要

人类嗅觉上皮具有显著的神经发生能力，由定居其中的基底干细胞群体维持；然而，建立一种动态的 体外 一种能够真实再现该再生过程的模型已被证明难以建立。本文介绍了一种既定的实验方案，用于从成人人类上鼻甲组织中分离出的前体细胞生成嗅觉类器官。这些类器官保持了干性特征，表现为SOX2表达阳性，并呈现出空间有序的分化模式，其特征为未成熟神经元标志物GAP43的均匀表达以及成熟嗅觉感觉神经元标志物OMP的外周定位。随后通过靶向诱导分化，使用Notch抑制剂LY411575、Wnt激活剂CHIR-99021和视黄酸处理，成功生成了标志物阳性的嗅觉感觉神经元样细胞，这些细胞共表达OMP和神经元标志物Tuj1（III类β-微管蛋白）。该源自人类的模型克服了小鼠系统的局限性，提供了一个可靠的 体外 研究嗅觉神经发生、与 COVID-19 相关的嗅觉丧失及其他嗅觉相关神经退行性疾病的平台。

引言

人类嗅觉系统支持持续的神经发生¹，这一过程主要由嗅上皮中的基底干细胞驱动，具体包括水平基底细胞（HBCs）和球形基底细胞（GBCs）^2,3。GBCs 持续分化为嗅觉感觉神经元（OSNs），而 HBCs 则在未受损伤时保持静息状态，仅在损伤刺激下被激活^4,5。当气味分子与 OSNs 纤毛上的受体结合时，嗅觉感知即被启动，进而触发信号转导级联反应，将信息传递至嗅球和大脑皮层⁶。该感觉功能的发育与维持由嗅上皮所调控。

由物理、化学或生物损伤引起的嗅觉功能障碍通常可自行恢复。⁷ 然而，该病症影响全球1.5%至25%的人口⁸，并可由多种病因导致，包括外伤⁹、感染¹⁰以及阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病¹¹；在这些情况下，自发性恢复常常不完全或完全缺失。目前的治疗方法，如嗅觉训练和皮质类固醇给药，疗效有限。

方案

本研究经四川大学华西医院伦理审查委员会（IRB）批准（批准号：2024 (31)）。在组织采集和数据发表之前，已从所有参与患者处获得书面知情同意。上鼻甲组织标本来源于因脑脊液鼻漏接受内镜下颅底手术或筛窦手术的患者。

1. 组织样本的处理与运输

1. 采集后立即把组织样本放入预冷的无菌运输培养基中，该培养基由添加了10%胎牛血清和5%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12/HEPES基础培养基组成，并在4 °C条件下运送至实验室。
   ​注意：血清有助于维持细胞活性，抗生素混合物可防止运输过程中可能发生的微生物污染。运输时间应控制在2小时以内，以保持细胞活性。

2. 组织预处理（在冰上进行）

1. 将样本转移至预冷的无菌培养皿中，去除运输培养基，并用含有5%青霉素-链霉素溶液的改良PBS缓冲液洗涤组织。洗涤操作如下：向培养皿中加入5 mL预冷的洗涤液，轻轻敲击组织5–7次，然后完全吸除液体。重复此洗涤步骤3次，以去除血细胞和组织碎片。
2. 使用无菌显微剪将组织剪切成约1–2 mm³大小的片段。
   注意：此步骤中应保持组织湿润，用钝头镊子固定组织，并尽量缩短剪切时间，以维持细胞活性。

结果

嗅觉上皮组织的分离与原代嗅觉上皮类器官培养
为建立嗅觉上皮类器官的培养体系，我们从人上鼻甲组织中分离出嗅觉上皮，并将其包埋于三维Matrigel基质中（图1）。在Ren等人报道的明确培养条件基础上，我们验证并优化了关键生长因子EGF、Noggin、Wnt3a和R-spondin 1，以及ROCK抑制剂Y-27632的浓度。该组合可有效支持嗅觉上皮类器官的克隆扩增与增殖。在此条件下，单个嗅觉上皮细胞可在Matrigel中存活，并在原代培养7–12天内发育为典型的球形类器官（图2）。培养12天的类器官经固定后进行免疫荧光染色，检测SOX2（一种对维持神经干细胞再生能力至关重要的转录因子）以及GAP43和OMP（分别为未成熟和成熟嗅觉感觉神经元的标志物）。结果显示，采用本方案生成的类器官共表达SOX2与GAP43，以及SOX2与OMP。GAP43在类器官中分布相对均匀，而OMP主要定位于外周细胞。这些结果表明，培养的类器官保留了干细胞特性，并呈现出空间有序的中间分化状态（

讨论

类器官代表了一种独特的体外模型，因为其自组织的三维结构能够高度模拟天然人体组织的结构，某些情况下在组织学上与真实器官难以区分。¹⁴ 因此，建立人类类器官模型对于研究人类疾病至关重要。本文介绍了一种从原代人嗅觉上皮细胞建立类器官培养体系的方案，该体系可稳定分化为成熟的嗅觉感觉神经元。该方法克服了传统方法仅依赖小鼠嗅觉上皮进行类器官生成的局限性^{21,22,23,24,25,26}，为研究人类嗅觉障碍及其潜在的病理机制提供了一个可靠的平台。

既往研究报道，包埋在Matrigel中的类器官在固定过程中需要极高浓度的一抗才能实现有效的蛋白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALEXA FLUOR 488 驴抗	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 驴抗	Thermo	A31572	1:500
抗GAP43抗体	Abcam	ab75810	1:160
抗OMP抗体	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
抗Sox-2抗体	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27添加剂	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax（L-谷氨酰胺添加剂）	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel（基底膜基质）	Corning	356231	4% (体积/体积)
N-2添加剂	Gibco	17502048	1%
类器官解离试剂	Precedo	PRS-ODR	/
类器官恢复溶液	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin（广谱抗菌剂）	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
重组人EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
重组人Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
重组人RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
重组人Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
视黄酸	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM