由成体干细胞生成与分化人嗅觉上皮类器官

摘要

本方案概述了一种从成人人类上鼻甲组织中分离嗅觉前体细胞以生成嗅觉上皮类器官的既定方法。同时详细描述了一种化学诱导策略，用于促进这些类器官分化为成熟的嗅觉感觉神经元，从而实现人类嗅觉神经发生的建模。

摘要

人类嗅觉上皮具有显著的神经发生能力，由定居其中的基底干细胞群体维持；然而，建立一种动态的 体外 一种能够真实再现该再生过程的模型已被证明难以建立。本文介绍了一种既定的实验方案，用于从成人人类上鼻甲组织中分离出的前体细胞生成嗅觉类器官。这些类器官保持了干性特征，表现为SOX2表达阳性，并呈现出空间有序的分化模式，其特征为未成熟神经元标志物GAP43的均匀表达以及成熟嗅觉感觉神经元标志物OMP的外周定位。随后通过靶向诱导分化，使用Notch抑制剂LY411575、Wnt激活剂CHIR-99021和视黄酸处理，成功生成了标志物阳性的嗅觉感觉神经元样细胞，这些细胞共表达OMP和神经元标志物Tuj1（III类β-微管蛋白）。该源自人类的模型克服了小鼠系统的局限性，提供了一个可靠的 体外 研究嗅觉神经发生、与 COVID-19 相关的嗅觉丧失及其他嗅觉相关神经退行性疾病的平台。

引言

人类嗅觉系统支持持续的神经发生¹，这一过程主要由嗅上皮中的基底干细胞驱动，具体包括水平基底细胞（HBCs）和球形基底细胞（GBCs）^2,3。GBCs 持续分化为嗅觉感觉神经元（OSNs），而 HBCs 则在未受损伤时保持静息状态，仅在损伤刺激下被激活^4,5。当气味分子与 OSNs 纤毛上的受体结合时，嗅觉感知即被启动，进而触发信号转导级联反应，将信息传递至嗅球和大脑皮层⁶。该感觉功能的发育与维持由嗅上皮所调控。

由物理、化学或生物损伤引起的嗅觉功能障碍通常可自行恢复。⁷ 然而，该病症影响全球1.5%至25%的人口⁸，并可由多种病因导致，包括外伤⁹、感染¹⁰以及阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病¹¹；在这些情况下，自发性恢复常常不完全或完全缺失。目前的治疗方法，如嗅觉训练和皮质类固醇给药，疗效有限。^12,13 这一治疗空白源于对损伤后嗅觉神经上皮存活与再生机制的理解尚不充分，而现有用于研究人类嗅觉生物学的体外（in vitro）模型的不足进一步加剧了这一知识缺口。

近年来，多种人类类器官模型的建立为研究人类疾病提供了新的技术平台。¹⁴ 来源于成体干细胞（AdSCs）——也称为组织驻留干细胞——的类器官已成功应用于多种内胚层来源的组织，包括胃、肝、胰腺、肺和膀胱。^{15,16,17,18,19} 相比之下，从外胚层来源的嗅板建立人类嗅觉上皮类器官在技术上仍具挑战性。其中一个主要的实际困难在于难以持续获取来自人类上鼻甲的有活性的嗅觉上皮组织。嗅觉区域的位置和范围在个体间差异显著，并且会随着年龄增长发生明显的退行性变化。若无意中采集到呼吸性上皮而非嗅觉上皮，将会影响培养结果。为解决这一问题，我们优化了Ren等人于2021年建立的从人类嗅黏膜培养细胞簇的方案²⁰，以稳定地生成人类嗅觉上皮类器官。本方法所获得的人类嗅觉上皮类器官具有三维、层次分明的结构特征，并可支持其分化为嗅觉感觉神经元。该模型为研究决定嗅觉上皮干细胞命运的机制以及筛选嗅觉障碍潜在治疗药物提供了有价值的实验平台。

明确总结而言，本方法的主要目标是建立一套标准化的工作流程，用于从成人前体细胞生成并分化人嗅觉上皮类器官。该方法的理论依据在于解决目前缺乏生理相关性的人体嗅觉系统体外（in vitro）模型这一关键空白。与传统的二维（2D）单层培养或小鼠模型相比，这种三维（3D）、人源性系统具有显著优势，能够真实再现嗅黏膜复杂的空間结构以及人类特有的遗传背景。研究人员在考虑采用本方案时，必须认识到：从人上鼻甲精确分离出具有活性的嗅觉上皮组织，同时避免呼吸道上皮的污染，是一项极具挑战性的操作，且高度受患者年龄和个体解剖差异的影响。因此，本方案特别适用于那些能够持续获得人临床样本，并致力于研究人类嗅觉神经发生、病毒诱导的嗅觉丧失，或与神经退行性疾病相关的嗅觉功能障碍的研究人员。

方案

本研究经四川大学华西医院伦理审查委员会（IRB）批准（批准号：2024 (31)）。在组织采集和数据发表之前，已从所有参与患者处获得书面知情同意。上鼻甲组织标本来源于因脑脊液鼻漏接受内镜下颅底手术或筛窦手术的患者。

1. 组织样本的处理与运输

1. 采集后立即把组织样本放入预冷的无菌运输培养基中，该培养基由添加了10%胎牛血清和5%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12/HEPES基础培养基组成，并在4 °C条件下运送至实验室。
   ​注意：血清有助于维持细胞活性，抗生素混合物可防止运输过程中可能发生的微生物污染。运输时间应控制在2小时以内，以保持细胞活性。

2. 组织预处理（在冰上进行）

1. 将样本转移至预冷的无菌培养皿中，去除运输培养基，并用含有5%青霉素-链霉素溶液的改良PBS缓冲液洗涤组织。洗涤操作如下：向培养皿中加入5 mL预冷的洗涤液，轻轻敲击组织5–7次，然后完全吸除液体。重复此洗涤步骤3次，以去除血细胞和组织碎片。
2. 使用无菌显微剪将组织剪切成约1–2 mm³大小的片段。
   注意：此步骤中应保持组织湿润，用钝头镊子固定组织，并尽量缩短剪切时间，以维持细胞活性。

3. 酶解消化

1. 将机械解离的组织转移至15 mL离心管中，加入3 mL预热（37 °C）的复合消化缓冲液（含0.125%胰蛋白酶和10 U/mL DNase I），保持3:1的酶与组织体积比。将离心管置于37 °C水浴中，轻柔振荡孵育20分钟。每5分钟检查一次样品，以监测消化进程并防止组织结块。
2. 加入等体积的终止液（添加10%胎牛血清的DMEM/F12/HEPES基础培养基）以终止消化反应。轻轻吹打混合液10次，确保充分混匀，并使酶与抑制成分有效接触。
   ​注意：血清中的α1-抗胰蛋白酶可有效中和胰蛋白酶活性。

4. 单细胞悬液的制备

1. 将一个40 µm细胞筛置于50 mL离心管上方。使用剪裁过的1 mL移液器吸头，将15 mL管中的消化组织和液体转移至筛网上。用移液器吸头轻轻搅动滤膜上的物质以促进其通过，然后用额外的1–2 mL终止液冲洗细胞筛。待所有液体通过筛网后，将50 mL管中的滤液转移至一个新的15 mL离心管中。
2. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟。观察管底明显的细胞沉淀，并小心吸除上清液，保留约100 µL以避免扰动或损失细胞沉淀。

三维培养系统的建立

1. 无需用培养基重悬细胞沉淀，直接使用预冷的低吸附性枪头将细胞沉淀与Matrigel混合，使细胞密度精确达到10,000个细胞/µL。将40 µL该细胞-Matrigel混合物加入24孔板的每个孔中，20 µL加入每个玻璃底共聚焦培养皿中。将培养板置于37 °C孵育30分钟，使Matrigel聚合并形成三维支架结构。
2. Matrigel凝固后，沿孔壁轻轻加入500 µL无血清嗅鞘神经干细胞培养基，避免破坏凝胶。将培养物置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养，每3天更换一次新鲜预热的培养基。
   ​注意：嗅鞘神经干细胞培养基由DMEM/F12/HEPES添加以下成分组成：R-spondin 1（200 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、Wnt3a（50 ng/mL）、EGF（50 ng/mL）、Y-27632（10 µM）、一种主要抗菌剂（100 µg/mL）、N2补充剂（1%）、B27补充剂（2%）和L-谷氨酰胺（1%）。

6. 传代与分化

1. 使用前将类器官回收液置于冰上预冷10分钟；吸除孔板中的培养基，然后每孔加入1 mL预冷的回收液。将孔板倾斜至45°角，轻柔地反复吹吸溶液5–7次，以使类器官从基底膜基质中脱离，并将所得悬液转移至15 mL离心管中。将离心管置于冰上孵育3–5分钟，随后在4 °C下以300 × g离心5分钟，小心吸除上清液，保留约100 µL液体以防止沉淀丢失。
2. 向细胞沉淀中直接加入1 mL类器官解离试剂，将离心管置于37 °C、220 rpm轻柔振荡条件下孵育5分钟。立即加入等体积的终止液终止消化反应，并轻柔吹打混合液5次以确保均匀。在4 °C下以300 × g离心5分钟，收集解离后的细胞。
3. 将细胞沉淀重悬于Matrigel中，24孔板每孔40 µL，共聚焦玻璃底培养皿每孔20 µL；使用预冷的低吸附性枪头充分混匀，确保形成均匀悬液。接种至相应孔板或培养皿后，将样品在37 °C孵育30分钟，以促进Matrigel聚合及三维支架形成。随后沿孔壁轻柔加入500 µL专用于嗅觉神经干细胞的无血清球体培养基，避免扰动凝胶。将培养物置于37 °C、5% CO₂、95%相对湿度的培养箱中维持培养。
4. 传代后约7天，当新一代嗅觉上皮类器官重新形成球状结构时，吸除玻璃底共聚焦培养皿中的扩增培养基，并更换为分化培养基。每3天更换一次新鲜的预温分化培养基。分化培养约7天后，显微镜下通常可观察到形态上可区分的嗅觉神经元。
   注：分化培养基由DMEM/F12/HEPES组成，添加R-Spondin 1（200 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、Wnt3a（50 ng/mL）、EGF（50 ng/mL）、Y-27632（10 µM）、LY411575（5 µM）、CHIR99021（3 µM）、视黄酸（RA, 1 µM）、一种主要抗菌剂（100 µg/mL）、N2补充剂（1%）、B27补充剂（2%）和L-谷氨酰胺（1%）。

7. 免疫荧光

1. 吸去培养基，用 500 µL PBS 轻柔洗涤样品一次。去除 PBS 后，加入 500 µL 4% 多聚甲醛，在室温下固定样品 15 分钟。吸去并弃去固定液，然后用 PBS 洗涤固定后的样品（3 × 500 µL），并在 4 °C 下保存最多 48 小时。
2. 吸去 PBS，加入 500 µL 通透化溶液（含 0.2% Triton X-100 的 PBS），在室温下孵育 15 分钟，然后吸去并弃去溶液。用 0.02% PBST（含 0.02% Triton X-100 的 PBS；3 × 500 µL）洗涤样品。
3. 加入 500 µL 封闭液（含 3% BSA 的 PBS），在室温下孵育 1 小时。
4. 吸去封闭液，更换为 500 µL 一抗溶液，该溶液是将适当的一抗（例如 anti-GAP43 以 1:160 稀释、anti-OMP 以 1:50 稀释或 anti-SOX2 以 1:50 稀释）用封闭液稀释而成，在 4 °C 下孵育过夜。次日，吸去一抗溶液，并用 0.02% PBST 洗涤样品（3 × 500 µL）。
5. 加入 500 µL 二抗溶液，其中含有以 1:500 比例用封闭液稀释的 Alexa Fluor 488 或 Alexa Fluor 555 标记的二抗，在避光条件下室温孵育 1 小时。吸去二抗溶液，并用 0.02% PBST 进行额外洗涤（3 × 500 µL）。
6. 加入 500 µL DAPI 工作液（将 DAPI 稀释于 PBS 中），在避光条件下孵育 10 分钟以染色细胞核。吸去 DAPI 溶液，并用 0.02% PBST 洗涤样品（3 × 500 µL）。染色后的样品可在成像前于 4 °C 下保存最多 48 小时。

8. 共聚焦显微镜成像

1. 对直径≤100 µm的类器官，使用1 µm的Z轴步长进行共聚焦显微镜成像；对直径大于100 µm的类器官，则使用0.5 µm的Z轴步长。以多通道逐次扫描模式采集图像，扫描顺序依次为：DAPI、FITC、TRITC和Cy5。将获得的Z轴层扫图像序列文件导入三维重建软件（例如Imaris）。利用三维体积重建功能生成类器官完整的三维模型。通过观察该重建模型，可视化特定细胞标记物（如SOX2、GAP43和OMP）的空间分布情况，并定性确认嗅觉上皮类器官的层级结构及神经元分化状态，作为最终的实验终点。

结果

嗅觉上皮组织的分离与原代嗅觉上皮类器官培养
为建立嗅觉上皮类器官的培养体系，我们从人上鼻甲组织中分离出嗅觉上皮，并将其包埋于三维Matrigel基质中（图1）。在Ren等人报道的明确培养条件基础上，我们验证并优化了关键生长因子EGF、Noggin、Wnt3a和R-spondin 1，以及ROCK抑制剂Y-27632的浓度。该组合可有效支持嗅觉上皮类器官的克隆扩增与增殖。在此条件下，单个嗅觉上皮细胞可在Matrigel中存活，并在原代培养7–12天内发育为典型的球形类器官（图2）。培养12天的类器官经固定后进行免疫荧光染色，检测SOX2（一种对维持神经干细胞再生能力至关重要的转录因子）以及GAP43和OMP（分别为未成熟和成熟嗅觉感觉神经元的标志物）。结果显示，采用本方案生成的类器官共表达SOX2与GAP43，以及SOX2与OMP。GAP43在类器官中分布相对均匀，而OMP主要定位于外周细胞。这些结果表明，培养的类器官保留了干细胞特性，并呈现出空间有序的中间分化状态（

讨论

类器官代表了一种独特的体外模型，因为其自组织的三维结构能够高度模拟天然人体组织的结构，某些情况下在组织学上与真实器官难以区分。¹⁴ 因此，建立人类类器官模型对于研究人类疾病至关重要。本文介绍了一种从原代人嗅觉上皮细胞建立类器官培养体系的方案，该体系可稳定分化为成熟的嗅觉感觉神经元。该方法克服了传统方法仅依赖小鼠嗅觉上皮进行类器官生成的局限性^{21,22,23,24,25,26}，为研究人类嗅觉障碍及其潜在的病理机制提供了一个可靠的平台。

既往研究报道，包埋在Matrigel中的类器官在固定过程中需要极高浓度的一抗才能实现有效的蛋白...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALEXA FLUOR 488 驴抗	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 驴抗	Thermo	A31572	1:500
抗GAP43抗体	Abcam	ab75810	1:160
抗OMP抗体	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
抗Sox-2抗体	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27添加剂	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax（L-谷氨酰胺添加剂）	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel（基底膜基质）	Corning	356231	4% (体积/体积)
N-2添加剂	Gibco	17502048	1%
类器官解离试剂	Precedo	PRS-ODR	/
类器官恢复溶液	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin（广谱抗菌剂）	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
重组人EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
重组人Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
重组人RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
重组人Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
视黄酸	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM