该方法研究衰老的皮肤成纤维细胞如何影响健康的成纤维细胞。通过UVB照射诱导细胞衰老，然后将条件培养基施加于正常成纤维细胞。该方法有助于评估靶向皮肤老化过程中异常细胞间通讯的生物活性化合物。
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本文内容
摘要
摘要
皮肤衰老是一个由分子和细胞水平改变驱动的多因素过程，这些改变也被称为衰老的特征。其中一种改变表现为细胞间通讯异常，这会导致皮肤组织功能障碍和结构损伤。本文介绍了一种 体外 通过将健康成纤维细胞与衰老成纤维细胞的条件培养基共孵育，建立了一种模拟这些皮肤老化特征的模型。首先，可分析经UVB辐射后的成纤维细胞中与光老化相关的基因表达变化。其次，收集由UVB诱导的衰老成纤维细胞的条件培养基并转移至健康成纤维细胞，可导致细胞外基质蛋白表达下调以及促炎性细胞因子基因表达上调。上述变化可通过使用一种新型抗氧化剂组合（维生素C + 艾地苯）得以逆转。这些结果表明 体外 该模型可用于评估新型化合物对皮肤真皮细胞衰老特征的影响，从而筛选出可能调控皮肤再生与 rejuvenation 细胞过程的化合物。
引言
皮肤衰老是皮肤功能和特性自然下降的过程，包括失去紧致性和弹性以及松弛程度增加。这一过程会因外界因素（如紫外线（UV）暴露和污染）而加速，这些因素会损伤细胞并引起分子水平的变化1。近期研究已对这些变化进行了充分表征，并将其确定为衰老的标志，包括基因组不稳定性、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、大自噬缺陷、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭、细胞间通讯改变、慢性炎症以及菌群失调2。这些特征解释了亚细胞损伤如何转化为组织功能障碍，从而促进衰老进程。值得注意的是，这些改变并非独立发生，而是形成一个相互依赖的网络特征。初级损伤（如基因组损伤或表观遗传改变）不断积累，最终导致细胞衰老。在皮肤中，这主要由紫外线损伤引起，光老化是皮肤衰老特征的主要驱动因素3。衰老细胞会增加促炎性细胞因子、基质金属蛋白酶和生长因子的产生，这种现象也被称为衰老相关分泌表型（SASP），其中包括 IL6、IL8、MMP1、MMP3、TNFA 和 IL1A 等4,5,6。这些分泌因子不仅影响皮肤的结构特性（如真皮细胞外基质），还会破坏周围细胞的功能。这包括释放刺激黑素细胞活化的细胞因子，从而引发与年龄相关的皮肤色素沉着过度（如干细胞因子或 IL18），以及其他改变邻近健康成纤维细胞功能的有害蛋白，损害其正常功能，并促进衰老表型的进一步放大7,8,9,10,11。因此，慢性炎症和细胞间通讯的改变是将这些分子变化转化为皮肤衰老可见体征（如皱纹、松弛、老年斑或失去紧致性）的关键促进因素。
可通过已知技术研究SASP有害效应的具体蛋白质贡献者，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、Luminex、实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）或蛋白质印迹（Western Blot）等。5,12然而，这种方法适用于从个体角度鉴定特定蛋白质并表征特定的作用机制，但未考虑SASP对邻近细胞的全面影响。在此，一种 体外 提出该方案旨在研究由UVB诱导的衰老真皮成纤维细胞所产生的SASP对邻近健康成纤维细胞的影响，以模拟衰老过程中细胞间通讯改变这一典型特征。如前所述，紫外线是皮肤细胞衰老的主要驱动因素。因此，在构建本模型时，选择紫外线损伤作为细胞衰老的诱因，而非复制性衰老或癌基因诱导的衰老。3为此，使用含有衰老成纤维细胞分泌因子的培养基（条件培养基），并在该培养基中孵育健康成纤维细胞，以定量检测细胞功能相关标志物。根据本方案，先将条件培养基从衰老细胞转移至健康细胞，随后收集经UVB诱导的衰老成纤维细胞，用于分析其分子特征，如参与促炎性及旁分泌信号通路相关基因的表达。其次，收集经衰老成纤维细胞条件培养基处理的健康成纤维细胞，以表征SASP对邻近细胞的影响，定量检测与细胞外基质、生长因子及成纤维细胞活化相关的基因表达。因此，目标化合物（COI）的作用分别在衰老成纤维细胞以及经条件培养基处理的健康成纤维细胞中进行分析。关于这些化合物，先前研究表明抗氧化剂在防护和改善光老化引起的皮肤衰老方面具有显著效果。因此，本研究采用两种抗氧化剂（维生素C和艾地苯）的组合，以逆转UVB在衰老细胞及经衰老细胞条件培养基孵育的健康细胞中所诱导的部分改变。13,14,15
总体而言，本方案旨在研究衰老相关分泌表型（SASP）对皮肤细胞的影响，并鉴定能够恢复异常细胞间通讯的新型分子或干预手段，因此适用于美容医学和再生皮肤科学领域的再生性与生物刺激性产品研究。
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方案
本研究中使用的人类皮肤成纤维细胞购自商业细胞库。由于未涉及原代人类样本、患者数据或in vivo实验，本研究无需机构审查委员会（IRB）批准及知情同意。
1. 使用紫外线B诱导真皮成纤维细胞衰老
- 以 6 × 10⁵ 个细胞/平方厘米的密度接种人真皮成纤维细胞4 6 孔板中每孔的细胞数，使用杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）
- 24小时后，吸除细胞培养基，每孔加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 用25 mJ/cm²的UVB光照照射细胞2.
注意：本实验所用的UVB照射设备的能量已优化（参见材料表），以诱导足以触发细胞衰老的损伤，同时避免过度损伤导致细胞凋亡。使用其他设备时，应相应调整照射能量。
警告：UVB 辐射具有危害性。应使用适当的防护设备和屏蔽措施，避免暴露。 - 吸除 PBS，每孔加入 2 mL 新鲜细胞培养基。
- 72小时后，移除细胞培养基，每孔加入1 mL PBS，并按照步骤1.3所述重复进行UVB照射。
- 72小时后，移除细胞培养基，每孔加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。在37 °C孵育1–2分钟，然后用1.5 mL新鲜细胞培养基收集细胞。
- 以 8 × 10 的密度接种细胞4 每孔接种细胞于6孔板中，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基。此步骤后诱导细胞衰老。
2. 用目标化合物处理衰老细胞
- 24 小时后，移除细胞培养基，并加入 2 mL 含有待测化合物的细胞培养基。
- 再经过 24 小时后，在 6 孔板中接种另一批人源皮肤成纤维细胞（如步骤 1.1 所述）。这些细胞将作为健康的皮肤成纤维细胞，用于条件培养基的转移。
3. 衰老细胞向健康细胞的条件培养基转移
- 在化合物处理衰老细胞后 48 小时，以及接种健康成纤维细胞后 24 小时，从每孔衰老细胞中收集 2 mL 条件培养基，并将其转移至健康成纤维细胞中。
注意：在添加条件培养基前，应立即移除健康成纤维细胞的培养基，以确保有效转移。 - 向衰老细胞中加入 1 mL PBS，并按照步骤 1.6 所述方法用胰蛋白酶消化收集细胞。将这些细胞用于通过 ELISA 试剂盒或 qPCR 检测衰老或炎症标志物。
注意：如果下游实验不立即进行，细胞沉淀可在 −80 °C 保存。 - 将接受条件培养基的健康成纤维细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。
4. 通过基因表达分析收获健康细胞以进行成纤维细胞活化分析
- 使用胰蛋白酶按照步骤1.6所述方法收集经条件培养基孵育24小时后的健康成纤维细胞。通过qPCR分析细胞外基质基因的表达。
- 进行qPCR分析。
- 根据制造商说明书（RNA提取试剂盒）从细胞沉淀中提取RNA。
- 按照制造商说明书（逆转录试剂盒）对200 ng RNA进行逆转录反应。
- 根据制造商说明书（qPCR预混液）扩增cDNA。qPCR反应条件如下：95 °C预变性30 s，随后进行40个循环（95 °C变性5 s，60 °C退火延伸30 s）。所用引物列于表1中。
| 基因 | 上游序列 | 下游序列 |
| CDKN2A | 5’-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3’ | 5’-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3’ |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3' |
| ELN | 5’-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5’-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3' |
| FBN1 | 5’-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGCAG-3' | 5’-ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5’-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3' | 5’-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3' |
| IL-8 | 5’-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT-3' | 5’-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3' |
| CTGF | 5’-GGAAATGCTGTGAGGAGTGGGTGT-3´ | 5´-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5’-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3' | 5’-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
表1：qPCR实验所用引物列表。 针对本模型中研究和定量的各个基因，分别提供了对应的正向和反向序列。
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结果
本实验方案描述了一种模拟衰老过程中细胞间通讯改变这一特征的方法 体外. 图1 展示了协议主要步骤的图解示意图，包括细胞衰老诱导、标志物定量以及皮肤细胞间通讯改变的分析 体外.
图1：实验方案的图示概要，包括主要步骤。 本方案主要步骤的示意图解。首先，通过UVB损伤在健康成纤维细胞中诱导衰老。随后，用待测化合物（COI）处理衰老成纤维细胞，并收集细胞以评估SASP及表观遗传学改变。同时，将条件...
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讨论
在分子水平上理解衰老过程，对于设计能够延缓衰老相关特征、延长细胞和组织寿命及功能的新方法和干预手段至关重要。衰老标志物的定义与识别，为这些干预策略的开发建立了重要的科学框架2,16。在已被确认的衰老标志中，细胞间通讯的改变是一个基本特征，表现为细胞间信号传递受损和功能失调，进而加速与年龄相关的组织退化。在衰老的皮肤中，衰老细胞的积累会促进形成一种促炎性微环境，改变邻近非衰老细胞的功能能力，从而通过降低细胞活性进一步加剧组织损伤。这一现象最终导致细胞外基质蛋白和生长因子的合成减少，同时有害蛋白（如基质金属蛋白酶）水平升高，临床上表现为皮肤衰老的可见体征，包括肤色暗沉、紧致度下降以及皱纹的出现6,17,18。
鉴于全面表征细胞分泌组的复杂性，本文提出一种新方案，用于研究衰老真皮成纤维细...
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披露
所有作者均受雇于 Mesoestetic Pharma Group, S.L.。
致谢
作者谨向本项目中提供帮助与建议的合作者表示感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板 | Fisher Scientific | 10578911 | 在实验过程中用于细胞培养的多孔板（用于衰老诱导和化合物处理） |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36（UVB照射装置） | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | 用于通过UVB照射造成细胞损伤，从而诱导细胞衰老的设备 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Merck Life science | D6046-500ML | 真皮成纤维细胞的标准细胞培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | Fisher Scientific | 17593595 | 作为生长因子、激素、蛋白质和细胞生长所需微量营养素来源的营养补充剂 |
| H3K27me3 ELISA试剂盒 | Epigentek | P-3014T-096 | 一种特异性免疫测定试剂盒，用于检测生物样本中H3K27me3的表观遗传修饰 |
| 人真皮成纤维细胞 | Promocell | C-12302 | 真皮中的主要皮肤细胞，调控皮肤光老化过程 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Merck Life science | D8537-500ML | 模拟生理环境的缓冲溶液，用于清洗细胞而不引起应激或降低细胞活力 |
| PrimeScript RT试剂盒（逆转录试剂盒） | Takara Bio | RR037A | 从细胞中提取的RNA制备cDNA的试剂盒，是RNA纯化后进行qPCR检测的第二步 |
| TB Green Premix Ex Taq （qPCR预混液） | Takara Bio | RR420A | 由cDNA进行聚合酶链式反应以定量基因表达水平的试剂盒，是逆转录后进行qPCR检测的第三步 |
| 总RNA纯化试剂盒（RNA提取试剂盒） | Norgen | 17200 | 从收获的细胞中提取RNA的试剂盒，是细胞收获后进行qPCR检测的第一步 |
| 0.05%胰蛋白酶/EDTA | Merck Life science | T2601-100ML | 在细胞收获/传代过程中用于使细胞从培养板上脱离的酶溶液 |
参考文献
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