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研究文章

丙苯呋林通过调节脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞中ERK1/2的磷酸化缓解切口性痛觉过敏

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DOI：

10.3791/70927

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2026年8月14日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

本文内容

摘要

本研究探讨了鞘内给予丙戊茶碱对切口性痛觉过敏的缓解作用，并评估该作用是否与大鼠脊髓胶质细胞标志物以及细胞外信号调节激酶1和2磷酸化水平的变化相关。

摘要

脊髓星形胶质细胞、小胶质细胞以及细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）已被认为参与疼痛的调控过程。本研究探讨了术前鞘内注射丙戊茶碱（PPF）是否可减轻大鼠急性切口性痛觉过敏，以及该效应是否与脊髓胶质细胞标志物和ERK1/2的磷酸化相关。66只雄性Sprague–Dawley大鼠被随机分为空白组、切口痛组、生理盐水组、二甲基亚砜组、PPF组和U0126组。在切口前基线以及切口后2、4、8、24和72小时评估机械性和热性痛觉过敏。通过Western blot和免疫荧光检测脊髓神经元与胶质细胞标志物、p-ERK1/2及炎症介质的表达。此外，采用原代脊髓星形胶质细胞实验进一步研究ERK1/2依赖性炎症介质的释放。术前鞘内注射PPF在整个72小时观察期内显著减轻了机械性和热性痛觉过敏，而U0126主要在切口后早期阶段缓解痛觉过敏。术后4小时，两种处理均与脊髓GFAP、Iba-1和p-ERK1/2表达降低以及TNF-α和COX-2免疫反应性减弱相关。在培养的星形胶质细胞中，PPF可减少脂多糖（LPS）诱导的炎症介质释放，而组成性激活的ERK1/2则削弱了这一效应。这些结果支持PPF的抗痛觉过敏作用与切口后脊髓胶质细胞、ERK1/2相关通路及炎症反应的调节有关。

引言

切口痛是手术后常见的一种急性疼痛，通常持续时间不超过7天，但其病理机制复杂，与炎症性疼痛和神经病理性疼痛的机制不同1,2。如果在切口痛发展过程中未能有效控制，可能进一步进展为慢性疼痛综合征，其性质也可能从急性组织损伤性疼痛转变为神经病理性疼痛或混合性疼痛3。通常，使用镇痛药物（如阿片类药物和非甾体抗炎药）是切口术后最常用的镇痛方式。然而，这些药物在持续使用或高剂量使用时可能产生多种不良反应，这一情况凸显了对更安全、更有效的镇痛策略的需求。

可靠的证据表明，丙酮二甲基黄嘌呤（propentofylline, PPF）可在多种疼痛过程中缓解痛觉过敏4,5。此外，PPF的镇痛作用部分通过抑制脊髓中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）如p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases, JNKs）的表达来实现6。尽管PPF对p38和JNK通路的作用已得到证实，但其在急性切口痛中对细胞外信号调节激酶1和2（extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, ERK1/2）通路——另一种参与疼痛信号传导的关键MAPK亚家族——的潜在调控作用仍尚未被探索。鉴于ERK1/2的激活在时间和细胞分布模式上与p38和JNK存在差异，提示其可能带来独特的治疗机会，因此填补这一知识空白尤为重要。

胶质细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，最初被认为只是神经组织的连接和支持结构。然而，近期研究表明，星形胶质细胞和小胶质细胞在调节突触可塑性和传递疼痛信息方面发挥着重要作用7。作为脑和脊髓中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞可在疼痛过程的极早期被多种细胞外刺激信号激活，随后增殖并释放大量炎症性细胞因子，从而增强疼痛信号从脊髓向大脑的传导8,9。与此同时，活化的星形胶质细胞可上调兴奋性神经递质谷氨酸的释放，并通过增强细胞间通讯，直接向感觉神经元传递信息10。

研究表明，星形胶质细胞的活化发生在切口诱导性疼痛的早期阶段（24小时内），而小胶质细胞的活化则出现得较晚11,12。此外，有研究指出，在切口诱导性疼痛中，活化的小胶质细胞对机械性痛觉超敏的影响有限13。这些发现凸显了关于星形胶质细胞与小胶质细胞在急性疼痛中各自作用的持续疑问。丙戊茶碱（Propentofylline）是一种胶质细胞调节剂，已有报道表明其可通过调节慢性神经压迫性损伤、急性神经损伤及急性组织损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的活化来缓解痛觉超敏4,5。然而，据目前所知，尚无研究探讨丙戊茶碱在急性切口诱导性疼痛中对星形胶质细胞或小胶质细胞活化的影响。

细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）是丝裂原活化蛋白激酶1和2（MEK1/2）下游激活的主要MAPK亚家族，广泛参与伤害性感受信息处理和神经元可塑性14,15。先前研究表明，伤害性刺激可诱导脊髓神经元中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达，在炎症性或神经病理性疼痛状态下，星形胶质细胞和小胶质细胞中也可检测到p-ERK1/216,17,18,19。此外，已有报道显示，药理学抑制MEK1/2–ERK1/2信号通路可在多种疼痛模型中减轻机械性和热性痛觉过敏20,21,22,23,24,25。

然而，急性切口所激活的脊髓ERK1/2在细胞中的分布，特别是在星形胶质细胞和小胶质细胞中的分布，及其在切口所致疼痛中的作用仍不明确。该研究团队先前的研究表明，PPF可通过抑制脊髓JNK和p38信号通路缓解大鼠急性切口性痛觉过敏，但PPF是否也在切口性疼痛过程中调节脊髓胶质细胞中ERK1/2相关信号通路尚不清楚。因此，本研究应被视为对现有疼痛研究中胶质细胞及MAPK框架的延伸，而非一个完全独立的作用机制范式。本研究与以往工作的主要区别在于，其重点关注急性切口性疼痛，以ERK1/2而非p38/JNK作为关注的MAPK组分，并评估PPF治疗条件下脊髓p-ERK1/2在早期的细胞分布特征。

本研究旨在探讨术前鞘内给予PPF是否可在大鼠足底切口模型中减轻切口性痛觉过敏，以及该效应是否与ERK1/2磷酸化或脊髓神经元、胶质细胞标志物及炎症介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和环氧合酶-2（COX-2）表达的变化相关。更具体而言，本研究与以往报道的不同之处在于将行为学评估与时间序列的Western印迹分析相结合；与MEK1/2抑制剂U0126进行药理学比较；并在急性切口痛模型中对脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中p-ERK1/2进行定性免疫荧光定位。尽管其机制框架基于既往文献中胶质细胞调控与MAPK信号通路在疼痛中的作用，但本研究旨在为脊髓ERK1/2相关胶质反应可能参与切口性痛觉过敏早期阶段提供进一步证据。

与传统的术后镇痛药物相比，靶向信号通路的方法能够验证特定的信号组分，但可能仅提供有限时间的疗效，且常需侵入性给药方式；MEK1/2–ERK1/2 抑制剂在多种实验性疼痛模型中已显示出抗痛觉过敏作用20,21,22,23,24,25。PPF 与单一通路抑制剂不同，因其可调节胶质细胞反应，并与多个 MAPK 相关过程相关联4,5,6。然而，其临床转化仍受限于临床前研究设计、术前鞘内给药、仅使用雄性大鼠，以及在更大规模手术模型中缺乏剂量探索和安全性研究。

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方案

本研究经中国甘肃省兰州大学第二附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：2017-070）。所有实验操作均遵循国际疼痛研究协会（International Association for the Study of Pain）的指导原则26。实验共使用66只成年雄性Sprague–Dawley大鼠，大鼠来自经认证的实验动物中心，体重为200–250 g。本研究仅纳入雄性大鼠，以减少与性别相关的激素影响所带来的潜在变异。所有实验方案均严格按照国际疼痛研究协会的指导原则26执行，并已采取必要措施以最大程度减轻动物痛苦。本研究中所用试剂、耗材、仪器及软件的详细信息见《材料表》（Table of Materials）。

动物

手术前大鼠每两只同笼饲养，切口术后单只饲养，自由摄取食物和水。ad libitum。室内保持12小时光照-12小时黑暗循环，温度控制在24 °C ± 2 °C。

鞘内注射与切口痛模型

进行鞘内给药时，使用1.5%–3%七氟烷（通过鼻罩给药）对大鼠实施麻醉，并将其置于俯卧位，使脊柱屈曲。剃除腰背部区域的毛发，并对L5–L6椎间隙处的皮肤进行消毒。通过经皮方式将微量注射器插入L5–L6椎间隙。当进针过程中出现尾巴突然抽动或尾部运动时，提示已成功进入蛛网膜下腔；进一步通过轻柔抽吸观察到脑脊液流出予以确认。若未观察到上述现象，则在注射前调整针头位置。仅在两项确认标准均满足后才进行注射，注射后出现异常神经学体征的动物将被剔除。随后缓慢注入相应溶液，注射完成后再次清洁皮肤。手术过程持续约3分钟，大鼠通常在5–10分钟内从麻醉中恢复。

切口痛的大鼠模型建立方法如先前所述27。麻醉后，用10%聚维酮-碘消毒后肢足底表面。在足底皮肤上做一个1 cm的纵向切口，起始于距足跟约0.5 cm处，并向脚趾方向延伸。切口穿透皮肤和筋膜。用眼科镊子轻轻抬起足底肌肉，并在保持整体组织连续性的前提下进行纵向切开。随后将肌肉复位，施加轻柔压力以实现止血，并使用3-0尼龙线进行两针褥式缝合关闭伤口。伤口闭合后再次对切口部位进行消毒。术后，大鼠单独饲养，置于安静、温暖的环境中恢复，避免强光照射，并可自由获取食物和水。术后对动物进行监测，未达到预设标准的个体被及时剔除。伤口感染的判断依据包括伤口周围发红、肿胀和局部温度升高，伴有异常黄绿色脓性渗出物且有恶臭，伤口愈合延迟并持续开放，出现坏死和扩大，以及全身症状如体温升高、精神萎靡和拒食等。其他剔除标准包括30分钟内未能从麻醉中恢复、术中肌肉完全横断或神经血管损伤、术后自残行为、造模失败以及神经功能缺损（如后肢瘫痪或无法负重，且与切口痛无关）。存在伤口感染或裂开的大鼠被排除在研究之外。

行为学测量

由对分组情况不知情的研究人员测定机械缩足阈值（PWMT）和热缩足潜伏期（PWTL）。测试在安静的环境中于每天相同时间进行，动物至少适应环境10分钟后开始；各组均保持相同的测试箱体、金属网或玻璃地板、环境光照强度以及热源强度。进行PWMT测试时，使用校准的Von Frey纤维丝（0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g和15.0 g），垂直作用于伤口附近的足底表面，直至纤维丝弯曲约1–2 mm。每次刺激间隔2分钟，采用上下法确定50%的PWMT28。进行PWTL测试时，将大鼠分别置于透明测试箱内，箱底为玻璃板，将辐射热源对准伤口旁的足底区域。设定30秒为截止时间以防止组织损伤，每次照射间隔为2分钟，记录三次测量的平均值29。出现抬足、甩足或舔足行为视为阳性缩足反应；若测试过程中出现理毛、移动或热源偏离目标区域的情况，则需重新适应后重复试验。

Western印迹分析

在预设时间点，通过颈椎脱位法处死大鼠，并迅速取出L4–L6腰段脊髓组织，放入含有蛋白酶抑制剂（比例为100:1）的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中。组织经匀浆后置于冰上孵育20分钟，随后在4 °C条件下以15,000 × g离心20分钟。将上清液按3:1的比例与4×上样缓冲液混合，在沸水中加热5分钟，然后储存于−80 °C。取蛋白样品（每道30 µg）在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，并转移至0.45或0.22 µm的聚偏二氟乙烯膜上。通过预染分子量标记物的预期迁移位置以及确认无明显不均匀或中断的转膜区域，来验证转膜成功。膜在室温下用5%脱脂奶粉和3%牛血清白蛋白封闭2小时，随后在4 °C与一抗孵育过夜，所用一抗包括NeuN（1:8,000）、GFAP（1:4,000）、Iba-1（1:3,000）、p-ERK1/2（1:1,000）、t-ERK1/2（1:3,000）或GAPDH（1:2,000）。用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水（pH 7.4）洗涤后，膜在室温下与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5,000）孵育1小时。使用增强型化学发光法显影信号，并在同一目标的相同曝光范围内记录于胶片上。由不了解分组情况的研究人员使用图像分析软件对条带密度进行分析。图像转换为8位灰度图，对每条条带应用相同大小的矩形感兴趣区域，扣除相邻空白区域的局部背景，记录积分密度值。同一印迹上所有泳道均采用相同的区域大小和背景校正方法。NeuN、GFAP、Iba-1和t-ERK1/2的表达水平以GAPDH为内参进行标准化；p-ERK1/2则以t-ERK1/2为内参进行标准化；最终结果以空白组为参照表示为相对表达量。

免疫荧光

在预定时间点，用3%戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）对大鼠进行麻醉，并经心脏灌注300 mL预冷的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4），随后灌注250 mL预冷的4%多聚甲醛。L4–L6节段脊髓组织在4%多聚甲醛中后固定6小时，于4 °C条件下在20%–30%蔗糖-PBS溶液中过夜 cryoprotection（冷冻保护），并在−22 °C下切成10 µm厚的切片。切片用0.01 mol/L PBS洗涤，室温下用10%山羊血清封闭1小时，然后在4 °C下与以下一抗孵育过夜：NeuN（1:100）、GFAP（1:1,000）、Iba-1（1:100）、p-ERK1/2（1:100）、TNF-α（1:200）或COX-2（1:50）。经三次PBS洗涤后，切片在室温下与相应绿色或红色荧光标记的二抗（1:400）孵育1小时，再用PBS进一步洗涤三次，最后用抗荧光淬灭封片剂和盖玻片封片。每批染色均包括未加一抗的阴性对照切片。图像由不知分组情况的研究人员使用荧光显微镜采集。低倍全景图像采用10×物镜获取，而细胞水平的免疫反应性及共定位图像则根据相应图版要求采用20×或40×物镜获取。在同一图及同一批染色中进行比较时，经优化确保未达饱和后，物镜放大倍数、照明强度、曝光时间、探测器增益、相机设置和图像处理参数均保持恒定。不同荧光通道依次单独采集，以最小化通道间串扰。每只动物采集同侧背角三个无重叠视野。荧光强度经图像分析软件定量：先转换为8位图像，使用无细胞区域进行背景扣除，并在每批染色内应用相同的感兴趣区域和阈值；每个动物的多个视野数值取平均，得到单一代表值。出现过曝、组织折叠、撕裂、聚焦不良或背景不均的视野被排除，并在相同非饱和设置下重新采集。当组织结构完整、目标信号显著高于无一抗对照、且无明显折叠、撕裂或饱和区域影响分析时，染色结果方可被接受。

体外原代脊髓星形胶质细胞实验

原代大鼠脊髓星形胶质细胞在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中，于完全培养基中按照标准无菌条件进行培养。当细胞融合度达到约70%–80%时用于实验，并被分配至对照组、LPS刺激组、LPS + PPF组、LPS + U0126组以及ERK1/2挽救组。PPF和U0126的处理浓度均为10 µM。在同一实验中的平行孔之间，LPS刺激、药物处理及收获条件保持一致。对于通路选择性分析，收集细胞裂解液，通过Western blot检测p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-p38、总p38、p-JNK、总JNK以及相应的上样对照。从平行孔收集培养上清液，经离心澄清后，根据制造商说明书采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测TNF-α、PGE2和IL-6的水平。Western blot条带密度分析遵循上述相同的图像分析原则。在挽救实验中，通过siRNA转染抑制内源性ERK1/2表达，并在处理前引入组成型活性ERK1/2（CA-ERK1/2）表达质粒。在解读细胞因子数据前，通过Western blot验证基因敲低和过表达效率。在适用情况下，仅暴露于转染试剂但不含活性siRNA或表达质粒的细胞作为操作对照。

实验设计

实验动物的分组

采用随机数字表法将大鼠分为六组，在行为学测试和组织取材前完成分组。六组分别为空白组（n = 6）、切口痛（IP）组（n = 18）、生理盐水（NS）组（0.9% NS，10 µL；n = 9）、PPF组（10 µg溶于10 µL；n = 12）、二甲基亚砜（DMSO）组（10% DMSO，10 µL；n = 9）和U0126组（10 µg溶于10 µL；n = 12）。空白组大鼠未接受足底切口，也未进行鞘内注射，作为未经处理的对照组。IP组大鼠接受足底切口，但未在术前进行鞘内注射预处理。NS、PPF、DMSO和U0126组大鼠在足底切口前30分钟接受相应药物的鞘内给药。NS组作为PPF的溶剂对照组，DMSO组作为U0126的溶剂对照组。

丙戊茶碱和U0126的剂量

丙戊茶碱是一种胶质细胞调节剂，选择10 µg剂量是因为先前该研究团队的研究表明该剂量可缓解急性痛觉过敏。U0126是一种非三磷酸腺苷竞争性MEK1/2抑制剂，用于阻断ERK1/2的磷酸化。在多种疼痛模型中已报道有效的鞘内给药剂量为1–10 µg30,31,32；本研究采用了10 µg剂量。U0126溶于10%二甲基亚砜，而PPF溶于0.9%生理盐水。最终浓度均为1 µg/µL。药物及溶剂在手术前配制，保存于4 °C，并在12小时内使用。

术前鞘内注射丙戊茶碱或U0126对痛觉过敏的影响

每组随机选取6只大鼠，在手术前24小时进行行为学测量，所得的机械缩足阈值（PWMT）和热缩足潜伏期（PWTL）作为基线值。在手术前30分钟进行鞘内注射。为评估术前鞘内给予PPF和U0126对切口后机械性及热性痛觉过敏的影响，分别在切口后2小时、4小时、8小时、24小时和72小时检测PWMT和PWTL。

评估术前鞘内给予丙戊茶碱或U0126对切口术后脊髓神经元和胶质细胞标志物表达影响的实验设计

为确定切口后用于评估治疗效果的合适时间点，首先在IP组中进行了初步的时间过程分析。具体而言，IP组大鼠在切口后2 h、4 h、24 h和72 h被处死，通过Western blot检测脊髓中细胞标志物NeuN、GFAP和Iba-1的表达水平n = 3 个时间点）。根据这一初步分析，选择术后前 4 小时作为早期观察窗口，因为 NeuN 表达在 4 小时时间点达到最高水平，且早期分子变化被认为与切口性痛觉过敏的初始发生最为相关。然而，4 小时时间点并不旨在代表术后所有时间上的分子变化。

在选定的时间点，对接受鞘内注射的大鼠实施安乐死，以进行不同细胞标志物的蛋白质印迹分析（每组 n = 3）以及不同类型细胞形态的免疫荧光评估（每组 n = 3）。在空白组中，随机处死大鼠，通过蛋白质印迹法检测脊髓中不同细胞标志物（NeuN、GFAP 和 Iba-1）的基础表达水平（n = 3），并通过免疫荧光法观察不同类型细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）的形态（n = 3）。因此，空白组作为未切开、未处理的基线对照组。

治疗对脊髓p-ERK1/2及炎症介质的影响

为了确定评估治疗对 p-ERK1/2 表达及炎症细胞因子水平影响的合适切口后时间点，首先在 IP 组中进行了初步的时间过程分析。具体而言，IP 组大鼠在切口后 2 h、4 h、24 h 和 72 h 被处死，并通过 Western 印迹法检测脊髓中 p-ERK1/2 的表达（每时间点 n = 3）。根据该时间过程实验结果，结合切口后 NeuN 表达达到最高的时间点，选定切口后 4 h 作为后续评估术前鞘内给予 PPF 或 U0126 对脊髓 p-ERK1/2 表达和炎症细胞因子影响的固定时间点。选择该时间点是作为切口后早期机制观察窗口，而非代表切口后所有时间变化的全面反映。

在选定的时间点，对接受鞘内注射的大鼠实施安乐死，用于检测 p-ERK1/2 表达的 Western 印迹分析（每组 n = 3）以及炎症细胞因子的免疫荧光评估（每组 n = 3）。在空白组中，随机处死大鼠，通过 Western 印迹法测定脊髓中 p-ERK1/2 的基础表达水平（n = 3），并通过免疫荧光法检测炎症细胞因子（TNF-α 和 COX-2）的表达水平（n = 3）。因此，空白组作为未切开、未处理的基线对照组。

脊髓中神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞内p-ERK1/2的细胞定位

为了进一步评估切口术后脊髓 p-ERK1/2 的细胞分布情况，在切口术后 4 小时对空白组和 IP 组进行了免疫荧光染色（n = 3）。

统计学分析

数据以均值 ± 标准差表示。样本量参照研究团队先前的研究及预实验确定。行为学数据采用双因素重复测量方差分析（ANOVA），组别作为被试间因素，时间作为被试内因素。时间序列 Western blot 数据采用单因素方差分析（ANOVA）后接 Bonferroni 校正的两两比较。固定时间点的 Western blot 和免疫荧光数据采用单因素方差分析（ANOVA）后接 Bonferroni 校正的计划比较；两组间比较采用 Student t 检验。正态性与方差齐性分别通过 Shapiro–Wilk 检验和 Levene 检验进行评估。双侧 p-值 < 0.05 被视为具有显著性。统计分析使用下表所列的统计分析软件进行。 材料表. 对于 体外 星形胶质细胞实验中，独立的培养实验被视为分析单位；Western blot 条带密度和细胞因子浓度的比较采用单因素方差分析，随后进行经 Bonferroni 校正的计划性比较或 Student’s t 检验 t检验 在适当时，针对预先设定的两组比较。

数据可用性：

本研究发现的支持数据见补充文件1。

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结果

切口以及术前鞘内注射丙戊茶碱或U0126对切口术后痛觉过敏的影响

机械性痛觉过敏

术前24小时，六组之间的PWMTs无显著差异（p > 0.05；图1A，B）。在IP组中，切口术后PWMT下降，并在术后2小时至72小时期间持续显著低于基线水平（p < 0.05 vs 基线；图1A）。在NS组和DMSO组中，切口术后各时间点的PWMTs无显著差异（p > 0.05 vs IP组；图1B）。在PPF组中，术后2小时至72小时期间，PWMT显著高于IP组（p < 0.05 vs IP组；图1A）；在术后72小时，PWM...

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讨论

大多数患者在术后会经历急性疼痛，不仅在身体上，有时甚至在心理上也会受到影响33，然而关于术后急性疼痛的详细机制仍有许多未知之处。镇痛药物虽然效果显著，但不可避免地伴随副作用，因此探索更安全、有效的镇痛剂显得尤为重要。本研究基于一种先前已验证的切口型大鼠模型，该模型可用于模拟急性术后疼痛，且制备简便、可行27。本研究评估了切口后脊髓神经元和胶质细胞标志物、ERK1/2 磷酸化水平以及炎症介质的变化，并探讨了术前鞘内给予PPF是否产生抗痛觉过敏作用，以及该作用是否与脊髓ERK1/2磷酸化水平和炎症细胞因子表达的同步变化相关。

切口处理后，IP组大鼠出现了显著的机械性和热痛觉过敏，而溶剂预处理对行为学或分子学结果均未产生可检测到的影响。这些结果支持该模型的稳定性，并表明PPF组和U0126组中观察到的效应不太可能归因于注射操作或溶剂本身。此外，尽管切口后NeuN表达增加，但对此变化应谨慎解读，应视为神经元标志物表达的改变，而非神经元激活的直接证据。综上，这些观察结果为研究切口痛早期发展中胶质细...

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披露

作者声明不存在个人、财务、商业或学术利益冲突。

致谢

作者感谢周海娇和王明在技术方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M PBS 缓冲液SolarbioP1020
1.0 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.8)SolarbioT1010
10% 十二烷基硫酸钠 (SDS)SolarbioS1010
10× TBST 储存液SolarbioT1081
30% 丙烯酰胺SolarbioA1010
4× 蛋白上样缓冲液SolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
过硫酸铵SolarbioA1030
自动片冰机常熟雪科IMS-40
牛血清白蛋白 (BSA)SolarbioA8020
冷冻切片机 CM150LeicaCM150
数字 pH 计—PHS-3C
二甲基亚砜 (DMSO)SolarbioD8371
电子分析天平Cany—
增强型化学发光 (ECL) 试剂SolarbioPE0010
胶片Kodak—
荧光显微镜 DP71OlympusDP71
冷冻切片包埋介质Sakura4583
凝胶电泳装置BIO-RAD—
甘油SolarbioIG0910
甘氨酸SolarbioG8200
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594 二抗ProteintechSA00013-3
山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗ZSGB-BIOZB2305
山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗ProteintechSA00013-2
山羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗ZSGB-BIOZB2301
山羊血清SolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
高速冷冻离心机 3K15Sigma3K15
水平轨道摇床 TS-1000海门其林贝尔TS-1000
ImageJ美国国立卫生研究院1.51j8
甲醇天津广富—
小鼠抗大鼠 GAPDH 一抗Proteintech60004-1-Ig
小鼠抗大鼠 p-ERK1/2 一抗CST9101S
Na2HPO3天津北辰方正—
NaH2PO3天津大茂—
多聚甲醛BiosharpBL539A
病理级显微镜载玻片世泰—
苯甲基磺酰氟 (PMSF)碧云天ST506
足底测试仪 37370UGO BASILE37370
聚偏二氟乙烯膜Solarbio—
丙酮苯二甲酰胺 (PPF)陶素T19812
兔抗大鼠 COX-2 一抗AbcamAb179800
兔抗大鼠 GFAP 一抗Proteintech16825-1-AP
兔抗大鼠 Iba-1 一抗Proteintech10904-1-AP
兔抗大鼠 NeuN 一抗AbcamAb279297
兔抗大鼠 t-ERK1/2 一抗Proteintech11257-1-AP
兔抗大鼠 TNF-α 一抗Proteintech29652-1-AP
RIPA 裂解缓冲液SolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
脱脂奶粉SolarbioD8340
SPSSIBM22
四甲基乙二胺 (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
吐温 X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
超低温冰箱海尔—
超低温冰箱Sanyo—
超纯水净化系统Heal Force—
von Frey 纤维丝North Coast Medical—

参考文献

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

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