本研究探讨了鞘内给予丙戊茶碱对切口性痛觉过敏的缓解作用，并评估该作用是否与大鼠脊髓胶质细胞标志物以及细胞外信号调节激酶1和2磷酸化水平的变化相关。
本文内容
摘要
摘要
脊髓星形胶质细胞、小胶质细胞以及细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）已被认为参与疼痛的调控过程。本研究探讨了术前鞘内注射丙戊茶碱（PPF）是否可减轻大鼠急性切口性痛觉过敏，以及该效应是否与脊髓胶质细胞标志物和ERK1/2的磷酸化相关。66只雄性Sprague–Dawley大鼠被随机分为空白组、切口痛组、生理盐水组、二甲基亚砜组、PPF组和U0126组。在切口前基线以及切口后2、4、8、24和72小时评估机械性和热性痛觉过敏。通过Western blot和免疫荧光检测脊髓神经元与胶质细胞标志物、p-ERK1/2及炎症介质的表达。此外，采用原代脊髓星形胶质细胞实验进一步研究ERK1/2依赖性炎症介质的释放。术前鞘内注射PPF在整个72小时观察期内显著减轻了机械性和热性痛觉过敏，而U0126主要在切口后早期阶段缓解痛觉过敏。术后4小时，两种处理均与脊髓GFAP、Iba-1和p-ERK1/2表达降低以及TNF-α和COX-2免疫反应性减弱相关。在培养的星形胶质细胞中，PPF可减少脂多糖（LPS）诱导的炎症介质释放，而组成性激活的ERK1/2则削弱了这一效应。这些结果支持PPF的抗痛觉过敏作用与切口后脊髓胶质细胞、ERK1/2相关通路及炎症反应的调节有关。
引言
切口痛是手术后常见的一种急性疼痛，通常持续时间不超过7天，但其病理机制复杂，与炎症性疼痛和神经病理性疼痛的机制不同1,2。如果在切口痛发展过程中未能有效控制，可能进一步进展为慢性疼痛综合征，其性质也可能从急性组织损伤性疼痛转变为神经病理性疼痛或混合性疼痛3。通常，使用镇痛药物（如阿片类药物和非甾体抗炎药）是切口术后最常用的镇痛方式。然而，这些药物在持续使用或高剂量使用时可能产生多种不良反应，这一情况凸显了对更安全、更有效的镇痛策略的需求。
可靠的证据表明，丙酮二甲基黄嘌呤（propentofylline, PPF）可在多种疼痛过程中缓解痛觉过敏4,5。此外，PPF的镇痛作用部分通过抑制脊髓中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）如p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases, JNKs）的表达来实现6。尽管PPF对p38和JNK通路的作用已得到证实，但其在急性切口痛中对细胞外信号调节激酶1和2（extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, ERK1/2）通路——另一种参与疼痛信号传导的关键MAPK亚家族——的潜在调控作用仍尚未被探索。鉴于ERK1/2的激活在时间和细胞分布模式上与p38和JNK存在差异，提示其可能带来独特的治疗机会，因此填补这一知识空白尤为重要。
胶质细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞，最初被认为只是神经组织的连接和支持结构。然而，近期研究表明，星形胶质细胞和小胶质细胞在调节突触可塑性和传递疼痛信息方面发挥着重要作用7。作为脑和脊髓中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞可在疼痛过程的极早期被多种细胞外刺激信号激活，随后增殖并释放大量炎症性细胞因子，从而增强疼痛信号从脊髓向大脑的传导8,9。与此同时，活化的星形胶质细胞可上调兴奋性神经递质谷氨酸的释放，并通过增强细胞间通讯，直接向感觉神经元传递信息10。
研究表明，星形胶质细胞的活化发生在切口诱导性疼痛的早期阶段（24小时内），而小胶质细胞的活化则出现得较晚11,12。此外，有研究指出，在切口诱导性疼痛中，活化的小胶质细胞对机械性痛觉超敏的影响有限13。这些发现凸显了关于星形胶质细胞与小胶质细胞在急性疼痛中各自作用的持续疑问。丙戊茶碱（Propentofylline）是一种胶质细胞调节剂，已有报道表明其可通过调节慢性神经压迫性损伤、急性神经损伤及急性组织损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的活化来缓解痛觉超敏4,5。然而，据目前所知，尚无研究探讨丙戊茶碱在急性切口诱导性疼痛中对星形胶质细胞或小胶质细胞活化的影响。
细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）是丝裂原活化蛋白激酶1和2（MEK1/2）下游激活的主要MAPK亚家族，广泛参与伤害性感受信息处理和神经元可塑性14,15。先前研究表明，伤害性刺激可诱导脊髓神经元中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达，在炎症性或神经病理性疼痛状态下，星形胶质细胞和小胶质细胞中也可检测到p-ERK1/216,17,18,19。此外，已有报道显示，药理学抑制MEK1/2–ERK1/2信号通路可在多种疼痛模型中减轻机械性和热性痛觉过敏20,21,22,23,24,25。
然而，急性切口所激活的脊髓ERK1/2在细胞中的分布，特别是在星形胶质细胞和小胶质细胞中的分布，及其在切口所致疼痛中的作用仍不明确。该研究团队先前的研究表明，PPF可通过抑制脊髓JNK和p38信号通路缓解大鼠急性切口性痛觉过敏，但PPF是否也在切口性疼痛过程中调节脊髓胶质细胞中ERK1/2相关信号通路尚不清楚。因此，本研究应被视为对现有疼痛研究中胶质细胞及MAPK框架的延伸，而非一个完全独立的作用机制范式。本研究与以往工作的主要区别在于，其重点关注急性切口性疼痛，以ERK1/2而非p38/JNK作为关注的MAPK组分，并评估PPF治疗条件下脊髓p-ERK1/2在早期的细胞分布特征。
本研究旨在探讨术前鞘内给予PPF是否可在大鼠足底切口模型中减轻切口性痛觉过敏，以及该效应是否与ERK1/2磷酸化或脊髓神经元、胶质细胞标志物及炎症介质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和环氧合酶-2（COX-2）表达的变化相关。更具体而言，本研究与以往报道的不同之处在于将行为学评估与时间序列的Western印迹分析相结合；与MEK1/2抑制剂U0126进行药理学比较；并在急性切口痛模型中对脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中p-ERK1/2进行定性免疫荧光定位。尽管其机制框架基于既往文献中胶质细胞调控与MAPK信号通路在疼痛中的作用，但本研究旨在为脊髓ERK1/2相关胶质反应可能参与切口性痛觉过敏早期阶段提供进一步证据。
与传统的术后镇痛药物相比，靶向信号通路的方法能够验证特定的信号组分，但可能仅提供有限时间的疗效，且常需侵入性给药方式；MEK1/2–ERK1/2 抑制剂在多种实验性疼痛模型中已显示出抗痛觉过敏作用20,21,22,23,24,25。PPF 与单一通路抑制剂不同，因其可调节胶质细胞反应，并与多个 MAPK 相关过程相关联4,5,6。然而，其临床转化仍受限于临床前研究设计、术前鞘内给药、仅使用雄性大鼠，以及在更大规模手术模型中缺乏剂量探索和安全性研究。
方案
本研究经中国甘肃省兰州大学第二附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：2017-070）。所有实验操作均遵循国际疼痛研究协会（International Association for the Study of Pain）的指导原则26。实验共使用66只成年雄性Sprague–Dawley大鼠，大鼠来自经认证的实验动物中心，体重为200–250 g。本研究仅纳入雄性大鼠，以减少与性别相关的激素影响所带来的潜在变异。所有实验方案均严格按照国际疼痛研究协会的指导原则26执行，并已采取必要措施以最大程度减轻动物痛苦。本研究中所用试剂、耗材、仪器及软件的详细信息见《材料表》（Table of Materials）。
动物
手术前大鼠每两只同笼饲养，切口术后单只饲养，自由摄取食物和水。ad libitum。室内保持12小时光照-12小时黑暗循环，温度控制在24 °C ± 2 °C。
鞘内注射与切口痛模型
进行鞘内给药时，使用1.5%–3%七氟烷（通过鼻罩给药）对大鼠实施麻醉，并将其置于俯卧位，使脊柱屈曲。剃除腰背部区域的毛发，并对L5–L6椎间隙处的皮肤进行消毒。通过经皮方式将微量注射器插入L5–L6椎间隙。当进针过程中出现尾巴突然抽动或尾部运动时，提示已成功进入蛛网膜下腔；进一步通过轻柔抽吸观察到脑脊液流出予以确认。若未观察到上述现象，则在注射前调整针头位置。仅在两项确认标准均满足后才进行注射，注射后出现异常神经学体征的动物将被剔除。随后缓慢注入相应溶液，注射完成后再次清洁皮肤。手术过程持续约3分钟，大鼠通常在5–10分钟内从麻醉中恢复。
切口痛的大鼠模型建立方法如先前所述27。麻醉后，用10%聚维酮-碘消毒后肢足底表面。在足底皮肤上做一个1 cm的纵向切口，起始于距足跟约0.5 cm处，并向脚趾方向延伸。切口穿透皮肤和筋膜。用眼科镊子轻轻抬起足底肌肉，并在保持整体组织连续性的前提下进行纵向切开。随后将肌肉复位，施加轻柔压力以实现止血，并使用3-0尼龙线进行两针褥式缝合关闭伤口。伤口闭合后再次对切口部位进行消毒。术后，大鼠单独饲养，置于安静、温暖的环境中恢复，避免强光照射，并可自由获取食物和水。术后对动物进行监测，未达到预设标准的个体被及时剔除。伤口感染的判断依据包括伤口周围发红、肿胀和局部温度升高，伴有异常黄绿色脓性渗出物且有恶臭，伤口愈合延迟并持续开放，出现坏死和扩大，以及全身症状如体温升高、精神萎靡和拒食等。其他剔除标准包括30分钟内未能从麻醉中恢复、术中肌肉完全横断或神经血管损伤、术后自残行为、造模失败以及神经功能缺损（如后肢瘫痪或无法负重，且与切口痛无关）。存在伤口感染或裂开的大鼠被排除在研究之外。
行为学测量
由对分组情况不知情的研究人员测定机械缩足阈值（PWMT）和热缩足潜伏期（PWTL）。测试在安静的环境中于每天相同时间进行，动物至少适应环境10分钟后开始；各组均保持相同的测试箱体、金属网或玻璃地板、环境光照强度以及热源强度。进行PWMT测试时，使用校准的Von Frey纤维丝（0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g和15.0 g），垂直作用于伤口附近的足底表面，直至纤维丝弯曲约1–2 mm。每次刺激间隔2分钟，采用上下法确定50%的PWMT28。进行PWTL测试时，将大鼠分别置于透明测试箱内，箱底为玻璃板，将辐射热源对准伤口旁的足底区域。设定30秒为截止时间以防止组织损伤，每次照射间隔为2分钟，记录三次测量的平均值29。出现抬足、甩足或舔足行为视为阳性缩足反应；若测试过程中出现理毛、移动或热源偏离目标区域的情况，则需重新适应后重复试验。
Western印迹分析
在预设时间点，通过颈椎脱位法处死大鼠，并迅速取出L4–L6腰段脊髓组织，放入含有蛋白酶抑制剂（比例为100:1）的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中。组织经匀浆后置于冰上孵育20分钟，随后在4 °C条件下以15,000 × g离心20分钟。将上清液按3:1的比例与4×上样缓冲液混合，在沸水中加热5分钟，然后储存于−80 °C。取蛋白样品（每道30 µg）在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，并转移至0.45或0.22 µm的聚偏二氟乙烯膜上。通过预染分子量标记物的预期迁移位置以及确认无明显不均匀或中断的转膜区域，来验证转膜成功。膜在室温下用5%脱脂奶粉和3%牛血清白蛋白封闭2小时，随后在4 °C与一抗孵育过夜，所用一抗包括NeuN（1:8,000）、GFAP（1:4,000）、Iba-1（1:3,000）、p-ERK1/2（1:1,000）、t-ERK1/2（1:3,000）或GAPDH（1:2,000）。用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水（pH 7.4）洗涤后，膜在室温下与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5,000）孵育1小时。使用增强型化学发光法显影信号，并在同一目标的相同曝光范围内记录于胶片上。由不了解分组情况的研究人员使用图像分析软件对条带密度进行分析。图像转换为8位灰度图，对每条条带应用相同大小的矩形感兴趣区域，扣除相邻空白区域的局部背景，记录积分密度值。同一印迹上所有泳道均采用相同的区域大小和背景校正方法。NeuN、GFAP、Iba-1和t-ERK1/2的表达水平以GAPDH为内参进行标准化；p-ERK1/2则以t-ERK1/2为内参进行标准化；最终结果以空白组为参照表示为相对表达量。
免疫荧光
在预定时间点，用3%戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）对大鼠进行麻醉，并经心脏灌注300 mL预冷的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4），随后灌注250 mL预冷的4%多聚甲醛。L4–L6节段脊髓组织在4%多聚甲醛中后固定6小时，于4 °C条件下在20%–30%蔗糖-PBS溶液中过夜 cryoprotection（冷冻保护），并在−22 °C下切成10 µm厚的切片。切片用0.01 mol/L PBS洗涤，室温下用10%山羊血清封闭1小时，然后在4 °C下与以下一抗孵育过夜：NeuN（1:100）、GFAP（1:1,000）、Iba-1（1:100）、p-ERK1/2（1:100）、TNF-α（1:200）或COX-2（1:50）。经三次PBS洗涤后，切片在室温下与相应绿色或红色荧光标记的二抗（1:400）孵育1小时，再用PBS进一步洗涤三次，最后用抗荧光淬灭封片剂和盖玻片封片。每批染色均包括未加一抗的阴性对照切片。图像由不知分组情况的研究人员使用荧光显微镜采集。低倍全景图像采用10×物镜获取，而细胞水平的免疫反应性及共定位图像则根据相应图版要求采用20×或40×物镜获取。在同一图及同一批染色中进行比较时，经优化确保未达饱和后，物镜放大倍数、照明强度、曝光时间、探测器增益、相机设置和图像处理参数均保持恒定。不同荧光通道依次单独采集，以最小化通道间串扰。每只动物采集同侧背角三个无重叠视野。荧光强度经图像分析软件定量：先转换为8位图像，使用无细胞区域进行背景扣除，并在每批染色内应用相同的感兴趣区域和阈值；每个动物的多个视野数值取平均，得到单一代表值。出现过曝、组织折叠、撕裂、聚焦不良或背景不均的视野被排除，并在相同非饱和设置下重新采集。当组织结构完整、目标信号显著高于无一抗对照、且无明显折叠、撕裂或饱和区域影响分析时，染色结果方可被接受。
体外原代脊髓星形胶质细胞实验
原代大鼠脊髓星形胶质细胞在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中，于完全培养基中按照标准无菌条件进行培养。当细胞融合度达到约70%–80%时用于实验，并被分配至对照组、LPS刺激组、LPS + PPF组、LPS + U0126组以及ERK1/2挽救组。PPF和U0126的处理浓度均为10 µM。在同一实验中的平行孔之间，LPS刺激、药物处理及收获条件保持一致。对于通路选择性分析，收集细胞裂解液，通过Western blot检测p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-p38、总p38、p-JNK、总JNK以及相应的上样对照。从平行孔收集培养上清液，经离心澄清后，根据制造商说明书采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测TNF-α、PGE2和IL-6的水平。Western blot条带密度分析遵循上述相同的图像分析原则。在挽救实验中，通过siRNA转染抑制内源性ERK1/2表达，并在处理前引入组成型活性ERK1/2（CA-ERK1/2）表达质粒。在解读细胞因子数据前，通过Western blot验证基因敲低和过表达效率。在适用情况下，仅暴露于转染试剂但不含活性siRNA或表达质粒的细胞作为操作对照。
实验设计
实验动物的分组
采用随机数字表法将大鼠分为六组，在行为学测试和组织取材前完成分组。六组分别为空白组（n = 6）、切口痛（IP）组（n = 18）、生理盐水（NS）组（0.9% NS，10 µL；n = 9）、PPF组（10 µg溶于10 µL；n = 12）、二甲基亚砜（DMSO）组（10% DMSO，10 µL；n = 9）和U0126组（10 µg溶于10 µL；n = 12）。空白组大鼠未接受足底切口，也未进行鞘内注射，作为未经处理的对照组。IP组大鼠接受足底切口，但未在术前进行鞘内注射预处理。NS、PPF、DMSO和U0126组大鼠在足底切口前30分钟接受相应药物的鞘内给药。NS组作为PPF的溶剂对照组，DMSO组作为U0126的溶剂对照组。
丙戊茶碱和U0126的剂量
丙戊茶碱是一种胶质细胞调节剂，选择10 µg剂量是因为先前该研究团队的研究表明该剂量可缓解急性痛觉过敏。U0126是一种非三磷酸腺苷竞争性MEK1/2抑制剂，用于阻断ERK1/2的磷酸化。在多种疼痛模型中已报道有效的鞘内给药剂量为1–10 µg30,31,32；本研究采用了10 µg剂量。U0126溶于10%二甲基亚砜，而PPF溶于0.9%生理盐水。最终浓度均为1 µg/µL。药物及溶剂在手术前配制，保存于4 °C，并在12小时内使用。
术前鞘内注射丙戊茶碱或U0126对痛觉过敏的影响
每组随机选取6只大鼠，在手术前24小时进行行为学测量，所得的机械缩足阈值（PWMT）和热缩足潜伏期（PWTL）作为基线值。在手术前30分钟进行鞘内注射。为评估术前鞘内给予PPF和U0126对切口后机械性及热性痛觉过敏的影响，分别在切口后2小时、4小时、8小时、24小时和72小时检测PWMT和PWTL。
评估术前鞘内给予丙戊茶碱或U0126对切口术后脊髓神经元和胶质细胞标志物表达影响的实验设计
为确定切口后用于评估治疗效果的合适时间点，首先在IP组中进行了初步的时间过程分析。具体而言，IP组大鼠在切口后2 h、4 h、24 h和72 h被处死，通过Western blot检测脊髓中细胞标志物NeuN、GFAP和Iba-1的表达水平n = 3 个时间点）。根据这一初步分析，选择术后前 4 小时作为早期观察窗口，因为 NeuN 表达在 4 小时时间点达到最高水平，且早期分子变化被认为与切口性痛觉过敏的初始发生最为相关。然而，4 小时时间点并不旨在代表术后所有时间上的分子变化。
在选定的时间点，对接受鞘内注射的大鼠实施安乐死，以进行不同细胞标志物的蛋白质印迹分析（每组 n = 3）以及不同类型细胞形态的免疫荧光评估（每组 n = 3）。在空白组中，随机处死大鼠，通过蛋白质印迹法检测脊髓中不同细胞标志物（NeuN、GFAP 和 Iba-1）的基础表达水平（n = 3），并通过免疫荧光法观察不同类型细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）的形态（n = 3）。因此，空白组作为未切开、未处理的基线对照组。
治疗对脊髓p-ERK1/2及炎症介质的影响
为了确定评估治疗对 p-ERK1/2 表达及炎症细胞因子水平影响的合适切口后时间点，首先在 IP 组中进行了初步的时间过程分析。具体而言，IP 组大鼠在切口后 2 h、4 h、24 h 和 72 h 被处死，并通过 Western 印迹法检测脊髓中 p-ERK1/2 的表达（每时间点 n = 3）。根据该时间过程实验结果，结合切口后 NeuN 表达达到最高的时间点，选定切口后 4 h 作为后续评估术前鞘内给予 PPF 或 U0126 对脊髓 p-ERK1/2 表达和炎症细胞因子影响的固定时间点。选择该时间点是作为切口后早期机制观察窗口，而非代表切口后所有时间变化的全面反映。
在选定的时间点，对接受鞘内注射的大鼠实施安乐死，用于检测 p-ERK1/2 表达的 Western 印迹分析（每组 n = 3）以及炎症细胞因子的免疫荧光评估（每组 n = 3）。在空白组中，随机处死大鼠，通过 Western 印迹法测定脊髓中 p-ERK1/2 的基础表达水平（n = 3），并通过免疫荧光法检测炎症细胞因子（TNF-α 和 COX-2）的表达水平（n = 3）。因此，空白组作为未切开、未处理的基线对照组。
脊髓中神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞内p-ERK1/2的细胞定位
为了进一步评估切口术后脊髓 p-ERK1/2 的细胞分布情况，在切口术后 4 小时对空白组和 IP 组进行了免疫荧光染色（n = 3）。
统计学分析
数据以均值 ± 标准差表示。样本量参照研究团队先前的研究及预实验确定。行为学数据采用双因素重复测量方差分析（ANOVA），组别作为被试间因素，时间作为被试内因素。时间序列 Western blot 数据采用单因素方差分析（ANOVA）后接 Bonferroni 校正的两两比较。固定时间点的 Western blot 和免疫荧光数据采用单因素方差分析（ANOVA）后接 Bonferroni 校正的计划比较；两组间比较采用 Student t 检验。正态性与方差齐性分别通过 Shapiro–Wilk 检验和 Levene 检验进行评估。双侧 p-值 < 0.05 被视为具有显著性。统计分析使用下表所列的统计分析软件进行。 材料表. 对于 体外 星形胶质细胞实验中，独立的培养实验被视为分析单位；Western blot 条带密度和细胞因子浓度的比较采用单因素方差分析，随后进行经 Bonferroni 校正的计划性比较或 Student’s t 检验 t检验 在适当时，针对预先设定的两组比较。
数据可用性：
本研究发现的支持数据见补充文件1。
结果
切口以及术前鞘内注射丙戊茶碱或U0126对切口术后痛觉过敏的影响
机械性痛觉过敏
术前24小时，六组之间的PWMTs无显著差异（p > 0.05；图1A，B）。在IP组中，切口术后PWMT下降，并在术后2小时至72小时期间持续显著低于基线水平（p < 0.05 vs 基线；图1A）。在NS组和DMSO组中，切口术后各时间点的PWMTs无显著差异（p > 0.05 vs IP组；图1B）。在PPF组中，术后2小时至72小时期间，PWMT显著高于IP组（p < 0.05 vs IP组；图1A）；在术后72小时，PWMT与基线相比已无显著差异（p > 0.05 vs 基线；图1A）。在U0126组中，术后最初24小时内PWMT显著高于IP组（p < 0.05 vs IP组；图1A），但该效应在术后72小时未能维持，此时PWMT仍显著低于基线，且与IP组相比无显著差异（p < 0.05 vs 基线；p > 0.05 vs IP组；图1A）。
热痛觉过敏
6 组在术前 24 h 的 PWTLs 比较差异无统计学意义p > 0.05; 图1C，D）。在IP组中，PWTL从24.85 s下降 ± 操作前1.06秒至4.38秒 ± 1.02 秒（切口后 4 小时），随后部分恢复至 18.37 秒 ± 1.38 秒，于切口后 72 小时，但在整个观察期内仍显著低于基线水平（p < 0.05 与 基线 图1C）。在NS组和DMSO组中，切口后各时间点的PWTL值之间无显著差异。p > 0.05 与 IP组； 图1D）。在PPF组中，72小时观察期内的PWTL显著高于IP组p < 0.05 与 IP 组相比； 图1C)，在切口后72小时，其水平已恢复至与基线相比无显著差异的程度（p > 0.05 与基线相比； 图1C）。在 U0126 组中，切口后最初 24 小时内的 PWTL 显著高于 IP 组p < 0.05 与 IP 组相比； 图1C）；这种效应在切口后72小时不再维持，此时PWTL仍显著低于基线水平，且与IP组相比无显著差异。p < 0.05 与基线相比； p > 0.05 与 IP 组相比； 图1C).
切口术后脊髓细胞标志物表达及细胞外信号调节激酶1和2磷酸化时间变化的Western印迹分析
在PVDF膜上使用特异性抗体检测到多个精确分子量的条带，包括NeuN（48和50 kD）、GFAP（50 kD）、Iba-1（17 kD）、p-ERK1/2（p-ERK1 = 44 kD；p-ERK2 = 42 kD）、t-ERK1/2（t-ERK1 = 44 kD；t-ERK2 = 42 kD）以及GAPDH（36 kD）。其中，GAPDH条带用作NeuN、GFAP、Iba-1和t-ERK1/2的内参对照，t-ERK1/2条带用作p-ERK1/2的内参对照。
IP组脊髓的蛋白质印迹结果显示，切口后出现不同程度的升高（图2A）。神经元特异性核蛋白表达在切口后4小时达到最高值（p < 0.001，与基线相比；图2A），并在切口后72小时仍显著高于基线水平（p < 0.001，与基线相比；图2A）。胶质纤维酸性蛋白水平在72小时观察期内逐渐升高（p < 0.001，与基线相比；图2A），在所测时间点中，72小时时达到最高水平。类似地，Iba-1在切口后4小时也显著升高（p < 0.001，与基线相比；图2A），之后在较小范围内波动。值得注意的是，IP组脊髓的蛋白质印迹结果显示，ERK1/2活化仅在切口后前24小时内升高（p < 0.05，与基线相比；图2B），而在切口后72小时则下降（p < 0.05，与基线相比；图2B）；而t-ERK/2的表达在任何时间点均无显著变化。
术前鞘内注射戊丙茶碱或U0126对脊髓中细胞标志物及磷酸化细胞外信号调节激酶1和2表达影响的蛋白质印迹分析
Western blotting 结果显示，NeuN 表达水平在切口后 4 小时达到最高，此时行为学测量值处于最低阈值。因此，在术前 30 分钟经鞘内给予 PPF 和 U0126 后，于切口后 4 小时评估其对细胞标志物表达及 ERK1/2 磷酸化的影响。
Western blotting 结果显示，与空白组相比，切口后 4 h IP 组脊髓中所有细胞标志物的表达均显著升高（p < 0.05 vs 基线水平；图 3）。与 IP 组相比，术前鞘内给予 PPF 可降低脊髓中 NeuN 的表达（p < 0.05 vs IP 组；图 3A）、GFAP 的表达（p < 0.05 vs IP 组；图 3B）以及 Iba-1 的表达（p < 0.01 vs IP 组；图 3C）。与 IP 组相比，术前鞘内给予 U0126 同样可降低脊髓中 NeuN 的表达（p < 0.01 vs IP 组；图 3D）、GFAP 的表达（p < 0.05 vs IP 组；图 3E）以及 Iba-1 的表达（p < 0.01 vs IP 组；图 3F）。然而，与空白组相比，PPF 组的 NeuN 表达仍显著高于基线水平（p < 0.01 vs 基线水平；图 3A），而 U0126 组的 NeuN 表达则显著低于空白组（p < 0.01 vs 基线水平；图 3D）。对于 GFAP 和 Iba-1，文本现重点强调与 IP 组的比较，如 图 3 所示。术前鞘内注射 NS 和 DMSO 对任何细胞标志物的表达均无显著影响。
Western blotting 结果显示，在切口后 4 h，空白组、IP 组、NS 组和 PPF 组之间的脊髓 t-ERK1/2 表达水平差异无统计学意义（图 4A）。相比之下，与空白组相比，IP 组和 NS 组在切口后 4 h 的 p-ERK1/2 表达显著升高（p < 0.001 vs 空白组；图 4B）。与 IP 组相比，术前鞘内给予 PPF 显著降低了切口后 4 h 的 p-ERK1/2 表达（p < 0.001 vs IP 组；图 4B）。与 NS 组相比，PPF 组的 p-ERK1/2 表达也显著降低（p < 0.01 vs NS 组；图 4B）。然而，与空白组相比，PPF 组在切口后 4 h 的 p-ERK1/2 表达仍显著升高。类似地，在切口后 4 h，空白组、IP 组、DMSO 组和 U0126 组之间的脊髓 t-ERK1/2 表达水平差异无统计学意义（图 4C）。与空白组相比，IP 组和 DMSO 组在切口后 4 h 的 p-ERK1/2 表达显著升高（p < 0.001 vs 空白组；图 4D）。与 IP 组相比，术前鞘内给予 U0126 显著降低了 p-ERK1/2 表达（p < 0.001 vs IP 组；图 4D）。与 DMSO 组相比，U0126 组的 p-ERK1/2 表达也显著降低（p < 0.001 vs DMSO 组；图 4D）。值得注意的是，与空白组相比，U0126 组在切口后 4 h 的 p-ERK1/2 表达与空白组相比差异无统计学意义。与 IP 组相比，NS 或 DMSO 预处理对 p-ERK1/2 表达无显著影响。
脊髓细胞标志物和炎症介质的免疫荧光观察
免疫荧光结果定性显示，切口后4 h同侧背角的NeuN免疫反应性较对侧更强（图5）。在空白组中，代表性图像显示同侧脊髓背角 NeuN、GFAP 和 Iba-1 免疫反应性的基础水平（图6A–C）。在IP组中，NeuN免疫反应性在定性上强于空白组（图 6D 与 图6A），GFAP 免疫反应性也更强（图 6E 与 图6B），同时Iba-1免疫反应性也有所增强（图6F 与 图6C）。同时，IP组中的星形胶质细胞和小胶质细胞呈现肥大形态，细胞体增大，突起更粗且分支更为密集（图6E，F).
在PPF组中，代表性图像显示NeuN免疫反应性弱于IP组（图6G 与图6D相比），GFAP免疫反应性较弱（图6H 与图6E相比），以及Iba-1免疫反应性较弱（图6I 与图6F相比）。在U0126组中，代表性图像同样显示NeuN免疫反应性弱于IP组（图6J 与图6D相比），GFAP免疫反应性较弱（图6K 与图6E相比），以及Iba-1免疫反应性较弱（图6L 与图6F相比）。在PPF组和U0126组中，星形胶质细胞和小胶质细胞的肥大程度均较低，细胞体更小，突起数量更少且更细（图6H、I、K、L）。NeuN、GFAP和Iba-1的相应荧光强度分析结果与代表性免疫荧光观察结果一致（图6M–O，分别对应）。
切口后4小时，与空白组相比，IP组同侧背角的TNF-α和COX-2免疫反应性及相对荧光强度均升高。术前给予鞘内注射PPF或U0126处理后，上述两项指标均降低（图7A–C）。
通过免疫荧光检测脊髓中p-ERK1/2的细胞定位
免疫荧光结果显示，在空白对照组中，脊髓内p-ERK1/2的免疫反应性较弱，且仅在NeuN阳性神经元中观察到（图8A–C）。相比之下，切口处理后4小时，同侧脊髓背角中p-ERK1/2的免疫反应性显著增强，并不仅与神经元共定位，还与GFAP阳性星形胶质细胞以及Iba-1阳性小胶质细胞共定位（图8D–I）。该结果表明，切口刺激诱导了p-ERK1/2更广泛的细胞分布，即从基础状态下的仅存在于神经元，转变为损伤后在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均存在。
体外验证脊髓星形胶质细胞中ERK1/2依赖性机制
为了进一步评估PPF是否能在细胞水平上通过ERK1/2相关信号通路抑制炎症介质的释放，本研究采用LPS刺激原代大鼠脊髓星形胶质细胞，并用PPF或U0126（10 µM）进行处理。Western blot分析显示，PPF可降低LPS诱导的p-ERK1/2表达，而p-p38和p-JNK的磷酸化水平未见明显变化（图9A），表明在此条件下PPF对ERK1/2通路具有相对选择性。同时，与刺激组（Stim group）相比，PPF降低了培养上清液中TNF-α、PGE2（COX-2活性的下游产物）和IL-6的水平；U0126也产生了类似的抑制作用（图9B）。
为检验持续性 ERK1/2 激活是否可能削弱 PPF 的抗炎作用，进行了挽救实验。使用 siRNA 敲低内源性 ERK1/2，随后引入组成型活性 ERK1/2（CA-ERK1/2）表达质粒（图9C）。在表达CA-ERK1/2的星形胶质细胞中，PPF不再降低TNF-α，PGE2 或 IL-6 水平并未降低至相同程度（图9D)，表明ERK1/2磷酸化的抑制有助于PPF在此过程中的抗炎作用 体外 星形胶质细胞系统。
总体而言，这些 体外 研究结果在细胞水平上提供了机制性证据，表明PPF通过ERK1/2依赖性机制抑制脊髓星形胶质细胞中炎症介质的释放，补充了 体内 观察性数据
图 1：术前鞘内注射 PPF 或 U0126 对切口所致机械性和热性痛觉过敏的影响。（A）空白组、IP 组、PPF 组和 U0126 组的 PWMT。（B）IP 组与溶剂对照组的 PWMT。（C）空白组、IP 组、PPF 组和 U0126 组的 PWTL。（D）IP 组与溶剂对照组的 PWTL。数据以均值 ± 标准差表示（每组 n = 6 只大鼠），采用双因素重复测量方差分析进行统计分析。***p < 0.001，与基线比较；#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001，与 IP 组比较。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：切口术后脊髓细胞标志物表达及ERK1/2磷酸化的时间过程。（A）切口术后IP组从基线至72小时NeuN、GFAP和Iba-1的定量分析及代表性Western印迹图。（B）同一时间段内t-ERK1/2和p-ERK1/2的定量分析及代表性Western印迹图。数据以空白组为基准（100%）进行归一化，结果以均值±标准差表示（每时间点n = 3只大鼠）。总体差异采用单因素方差分析，并进行指定的组间比较。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与基线相比。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：术前鞘内注射PPF或U0126对切口术后4小时脊髓神经元及胶质细胞标志物的影响。（A–C）空白组、IP组、生理盐水组和PPF组中的NeuN、GFAP和Iba-1表达。（D–F）空白组、IP组、二甲基亚砜组和U0126组中的NeuN、GFAP和Iba-1表达。右侧显示代表性Western blot结果。数据以空白组为100%进行归一化，结果表示为均值±标准差（每组n = 3只大鼠）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与空白组比较；#p < 0.05，##p < 0.01，与IP组比较；Δp < 0.05，ΔΔp < 0.01，ΔΔΔp < 0.001，与相应溶剂组比较。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：术前鞘内注射PPF或U0126对切口术后4小时脊髓ERK1/2磷酸化的影响。(A,B) 空白组、IP组、生理盐水组和PPF组中t-ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平。(C,D) 空白组、IP组、二甲基亚砜组和U0126组中t-ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平。右侧显示代表性Western blot结果。数据以空白组为100%进行标准化，结果以均值±标准差表示（每组n = 3只大鼠）。**p < 0.01，***p < 0.001，与空白组比较；###p < 0.001，与IP组比较；ΔΔp < 0.01，ΔΔΔp < 0.001，与相应溶剂对照组比较。请点击此处查看本图的放大版本。
图5：切口后同侧与对侧脊髓NeuN免疫反应性。IP组大鼠在切口后4小时的一个代表性腰段脊髓横切面显示了对侧和同侧背角的NeuN染色。该图像代表n = 3只大鼠的结果，用于定性解剖学比较。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：术后4小时PPF和U0126对脊髓神经元和胶质细胞免疫反应性的影响。（A–C）空白组的NeuN、GFAP和Iba-1染色结果。（D–F）IP组相应的染色结果。（G–I）PPF处理后的相应染色结果。（J–L）U0126处理后的相应染色结果。（M–O）NeuN、GFAP和Iba-1的相对荧光强度。数据以均值±标准差表示（每组n = 3只大鼠）；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，表示所示比较的显著性差异。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：切口术后及治疗后脊髓中TNF-α和COX-2的免疫反应性。（A）术后4 h，空白组、IP组、PPF组和U0126组中TNF-α和COX-2的代表性图像。（B）TNF-α相对荧光强度。（C）COX-2相对荧光强度。柱状图表示均值 ± 标准差（每组n = 3只大鼠）；***p < 0.001，表示所示组间比较结果。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看此图的放大版本
图8：切口术后4小时脊髓p-ERK1/2的细胞定位。（A–C）空白组中p-ERK1/2分别与NeuN、GFAP和Iba-1的共染色。（D–F）IP组中相应的共染色；箭头指示典型的共定位细胞。红色表示p-ERK1/2，绿色表示细胞标志物，黄色表示共定位。（G–I）分别与NeuN、GFAP和Iba-1阳性区域相关的相对荧光强度。柱状图表示均值 ± 标准差（每组n = 3只大鼠）；**p < 0.01 和 ***p < 0.001，表示所标注比较的显著性差异。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图9：PPF在大鼠原代脊髓星形胶质细胞中通过ERK1/2依赖途径发挥抗炎作用. (A代表性 Western 印迹结果显示，PPF 可降低 LPS 诱导的 p-ERK1/2，而对 p-p38 或 p-JNK 无明显影响。BTNF-α，LPS、PPF 或 U0126 处理后培养上清液中 PGE2 和 IL-6 的浓度。 (C) Western blot 验证 siRNA 介导的 ERK1/2 沉默及组成型活性 ERK1/2（CA-ERK1/2）的表达。D肿瘤坏死因子-α（TNF-α）α，PGE2 和 IL-6 浓度在表达 CA-ERK1/2 后有无 PPF 处理的变化。柱状图显示均值 ± 独立实验的 SD 体外 实验；***p < 0.001，用于所示比较；ns，无显著性差异。 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充文件1：支持本研究结果的数据。请点击此处下载该文件
讨论
大多数患者在术后会经历急性疼痛，不仅在身体上，有时甚至在心理上也会受到影响33，然而关于术后急性疼痛的详细机制仍有许多未知之处。镇痛药物虽然效果显著，但不可避免地伴随副作用，因此探索更安全、有效的镇痛剂显得尤为重要。本研究基于一种先前已验证的切口型大鼠模型，该模型可用于模拟急性术后疼痛，且制备简便、可行27。本研究评估了切口后脊髓神经元和胶质细胞标志物、ERK1/2 磷酸化水平以及炎症介质的变化，并探讨了术前鞘内给予PPF是否产生抗痛觉过敏作用，以及该作用是否与脊髓ERK1/2磷酸化水平和炎症细胞因子表达的同步变化相关。
切口处理后，IP组大鼠出现了显著的机械性和热痛觉过敏，而溶剂预处理对行为学或分子学结果均未产生可检测到的影响。这些结果支持该模型的稳定性，并表明PPF组和U0126组中观察到的效应不太可能归因于注射操作或溶剂本身。此外，尽管切口后NeuN表达增加，但对此变化应谨慎解读，应视为神经元标志物表达的改变，而非神经元激活的直接证据。综上，这些观察结果为研究切口痛早期发展中胶质细胞及ERK1/2相关反应提供了依据。
研究表明，胶质细胞在突触形成、突触信息传递与整合以及突触可塑性调节中发挥着重要作用。胶质细胞在疼痛处理中的免疫和促炎功能，特别是活化的脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞，可能增强介导痛觉过敏和术后行为改变的中枢敏化过程7,34。脊髓内适应不良的神经变化可能导致机体对有害或无害刺激的反应性增强。大量证据表明，在脊神经损伤模型35、组织型纤溶酶原激活物诱导的疼痛16、切口痛11,12以及骨癌痛19,31中，脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的活化参与了痛觉过敏的发生与维持。因此，脊髓胶质细胞的活化似乎是多种疼痛状态的共同特征，进一步探讨其在切口痛中的作用，有助于拓展当前对术后疼痛机制的理解。
目前的研究结果支持以下观点：脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞参与了切口术后早期的神经炎症反应12。GFAP、Iba-1 和 p-ERK1/2 并未表现出相同的时间模式，而是呈现出部分不同的时间进程，提示不同胶质细胞相关过程可能参与术后疼痛发展的不同阶段31,35。免疫荧光结果进一步支持了这一解释，显示切口术后星形胶质细胞和小胶质细胞出现肥大的形态学改变。结合TNF-α和COX-2免疫反应性的增加，这些观察结果与以下概念一致：胶质细胞相关的炎症信号通路参与了急性切口性痛觉过敏的发生7,36。
丙戊茶碱是一种甲基黄嘌呤衍生物，最初因其抗血小板活性及对长期记忆维持的促进作用而被研究作为脑血管活性药物37然而，PPF 对胶质细胞的调节作用使其作为镇痛药物也具有潜在价值。研究表明，PPF 可通过抑制细胞内环磷酸腺苷的降解并减少细胞外腺苷的再摄取，从而抑制小胶质细胞的活化。4,5. 在一个 体外 研究显示，PPF通过抑制TNF-α诱导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路，抑制星形胶质细胞的增殖6因此，PPF 对胶质细胞的调节作用使其能够参与疼痛过程的调控。
本研究中PPF持续的抗痛觉过敏效应，以及GFAP和Iba-1表达的降低，支持了胶质细胞调节是PPF在此模型中镇痛作用的重要组成部分这一解释。既往研究也提示，PPF可能在疼痛状态下抑制胶质细胞相关的炎症信号通路5,31。此外，TNF-α和COX-2的同步减少表明，PPF可能通过抑制胶质细胞相关炎症反应部分缓解切口疼痛。然而，由于本研究数据为相关性而非机制性结果，这些发现应被视为支持胶质细胞参与的证据，而非直接因果通路的确证。
已证实，ERK1/2（一对重要的细胞内信号调节激酶）通过介导脑和脊髓中的神经元兴奋性和突触可塑性，在多种疼痛过程的发生与维持中发挥重要作用21。例如，有研究显示，注射辣椒素或福尔马林可诱导脊髓中p-ERK1/2短暂而迅速地升高；然而，在注射完全弗氏佐剂或蜂毒后（经过短暂潜伏期），脊髓ERK1/2的激活持续时间明显更长38,39。相反，在另一项研究中，神经损伤诱导的脊髓ERK1/2激活出现极早，并持续一段时间，而痛觉过敏则在p-ERK1/2达到峰值之后才开始发展35。因此，ERK1/2的磷酸化可能在不同疼痛过程的不同阶段发生，脊髓中上调的p-ERK1/2可能对即时诱导效应和长期基因反应均具有重要意义。
本研究中，与空白组相比，切口后24小时内ERK1/2的磷酸化水平显著升高，且p-ERK1/2的表达在切口后4小时达到峰值（如前所述）24，该时间点与NeuN表达最高时相一致。同时，免疫荧光结果显示，切口诱导的ERK1/2磷酸化在同侧脊髓背角的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均有分布，支持ERK1/2相关信号通路与切口后痛觉过敏早期阶段密切相关这一观点。此外，术前鞘内给予U0126可降低切口后4小时脊髓胶质细胞标志物NeuN及p-ERK1/2的表达水平，并缓解切口后早期的机械性和热性痛觉过敏，提示脊髓p-ERK1/2可能参与切口后急性痛觉过敏的早期阶段。然而，由于GFAP、Iba-1、p-ERK1/2及行为学指标表现出不同的时间动态特征，目前的机制解释应局限于代表切口后早期阶段的4小时时间点，而不应推广至整个术后时期。
此外，在本研究中，术前鞘内给予PPF也在切口后4小时减少了ERK1/2的磷酸化，提示观察到的脊髓NeuN、GFAP和Iba-1表达的变化可能至少部分与ERK1/2相关信号通路有关。术前鞘内给予U0126也降低了TNF-α和COX-2的免疫反应性，支持ERK1/2磷酸化与切口后炎性介质表达之间可能存在关联。此外 体外 星形胶质细胞实验如图所示 图9 为ERK1/2依赖性抗炎机制提供了细胞水平的支持，因为持续激活ERK1/2会削弱PPF降低TNF-α、PGE2和IL-6释放的能力。然而，由于这些挽救实验是在培养的星形胶质细胞中进行的，而非在完整的脊髓组织中，且因为 体内 未进行挽救实验或细胞类型特异性操控 体内 结论仍应被解读为支持性证据，而非确定性证据，表明存在依赖ERK1/2的因果机制。
为进一步探讨胶质细胞活化、p-ERK1/2 表达与炎症细胞因子释放之间的可能关系，我们分析了免疫荧光观察到的空间定位模式。切口术后4小时，在脊髓背角中，p-ERK1/2 与GFAP阳性星形胶质细胞以及Iba-1阳性小胶质细胞共表达。结合Western blot和免疫荧光结果，显示PPF和U0126均与p-ERK1/2、TNF-α和COX-2表达的降低相关，这些数据提示，脊髓胶质细胞中ERK1/2的磷酸化可能参与切口术后炎症反应。 体外 原代星形胶质细胞中的数据进一步支持了PPF处理、ERK1/2抑制与炎症介质释放之间存在直接的细胞联系。然而，该 体内 证据表明存在关联性及治疗相关的平行变化，而细胞实验起到补充作用，但不能替代 体内 细胞类型特异性的因果验证。由于免疫荧光分析基于有限数量的动物和视野，这些观察结果应谨慎解读，并结合 Western blot 和 体外 结果
多个操作步骤对可重复性具有显著影响。鞘内注射需要同时具备特征性的尾部反应和脑脊液确认；若注射时出现阻力、缺乏确认证据或出现新的神经功能缺损，应排除该样本，而非在同一部位重复注射。行为学检测对适应环境、饲养条件、刺激物放置以及研究者的预期效应较为敏感，因此必须采用盲法、固定的时间间隔以及一致的环境条件。组织采集时间、蛋白质转膜的均一性、抗体孵育条件以及每批染色中相同的显微镜设置同样至关重要。常见问题包括：因适应不足导致的回撤阈值波动、因转膜不完全或曝光过度引起的微弱或不均一的Western blot条带，以及因洗涤不充分、抗体浓度过高或采集参数饱和导致的高荧光背景。
可根据科学问题对本方案进行修改。当关注晚期胶质细胞反应时，可采用更广泛的时间进程；当优先考虑转化可行性时，可增加剂量范围或替代给药途径。与炎症性或神经病理性疼痛模型相比，足底切口模型相对快速且实用，可重现明确的术后损伤27。结合行为学检测、Western blotting 和细胞相关免疫荧光技术，可提供功能、分子和空间分布方面的互补信息；然而，该方法比单一终点检测更耗费资源，且本身无法确立细胞特异性的因果关系。与U0126进行药理学比较可增强通路解读的可靠性，但仍不如基因操作或细胞类型选择性干预具有特异性20,21,22,23,24,25。
未来的应用包括对两性个体进行测试、更大的手术损伤、临床可行的给药途径、更多的术后时间点，以及针对特定胶质细胞群体的干预措施。该实验流程适用于筛选潜在的镇痛或胶质细胞调节治疗方案，因为切口模型操作简便、行为学终点可重复，且分子检测采用标准的实验室方法。然而，结果的可重复性依赖于预先设定的排除标准、盲法评估结局指标、一致的图像采集过程，以及对原始数据和分析参数的完整报告。
局限性
本研究存在若干局限性。首先，足底切口模型仅代表一种相对较轻的手术损伤，可能无法充分反映开胸手术或剖腹手术等较大规模的外科手术情况。因此，在将本研究结果外推至其他类型的术后疼痛时需谨慎。此外，实验仅纳入了雄性Sprague–Dawley大鼠，限制了研究结果在不同性别间的普遍适用性。鉴于已知在疼痛反应、镇痛效果以及胶质细胞激活模式方面存在性别差异，未来有必要开展包含雌性动物的进一步研究。
主要的分子和组织学观察集中在切口后4小时的时间点。由于不同终点指标（包括GFAP、Iba-1、p-ERK1/2以及行为学结果）在切口后表现出不同的时间变化特征，因此对本研究结果的机制性解释应主要局限于切口后的早期阶段。此外，本研究中的分子实验样本量相对有限，可能降低了这些观察结果的统计学效力。
细胞外信号调节激酶1和2被共同评估为p-ERK1/2；未单独分析它们各自的贡献。因此，本研究未能确定ERK1和ERK2在切口诱导的疼痛处理中的各自作用。此外，荧光强度的定量基于有限数量的动物和视野，未包括体视学细胞计数或正式的共定位系数分析。因此，这些观察结果应结合Western blot结果谨慎解读。
最后，尽管 体外 星形胶质细胞挽救实验为ERK1/2依赖性炎症介质调控提供了机制支持，但切口术后上游调控事件以及完整脊髓组织中的下游事件尚未深入研究。 体外 培养系统也无法完全重现脊髓背角中神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞以及浸润性免疫细胞之间的相互作用。因此，本研究支持ERK1/2相关机制的存在，但并未确立其完整的机制 体内 细胞特异性因果关系
结论
本研究表明，术前鞘内注射PPF可减弱切口诱导的脊髓NeuN、GFAP和Iba-1表达升高。该效应伴随切口后急性机械性和热性痛觉过敏的缓解，以及ERK1/2磷酸化水平和TNF-α、COX-2表达的降低。然而，这些结果仅支持（而非提供确凿的机制性证据）PPF的抗痛觉过敏作用与脊髓胶质细胞中ERK1/2磷酸化减少之间存在关联（同时伴有炎症介质表达的下调）。PPF的抗痛觉过敏作用在切口后整个观察期内持续存在，而MEK1/2抑制剂U0126的作用主要局限于切口后的早期阶段。这些发现提示，ERK1/2信号通路可能在切口痛早期发展中尤为关键。PPF作用持续时间更长，表明其作用机制可能涉及除ERK1/2抑制以外的其他通路。因此，PPF可能是一种潜在的治疗干预手段，而非单纯的生物学靶点，有助于改善急性术后疼痛的管理。
披露
作者声明不存在个人、财务、商业或学术利益冲突。
致谢
作者感谢周海娇和王明在技术方面提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.01 M PBS 缓冲液 | Solarbio | P1020 | |
| 1.0 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 10% 十二烷基硫酸钠 (SDS) | Solarbio | S1010 | |
| 10× TBST 储存液 | Solarbio | T1081 | |
| 30% 丙烯酰胺 | Solarbio | A1010 | |
| 4× 蛋白上样缓冲液 | Solarbio | P1041 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | — | |
| 过硫酸铵 | Solarbio | A1030 | |
| 自动片冰机 | 常熟雪科 | IMS-40 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Solarbio | A8020 | |
| 冷冻切片机 CM150 | Leica | CM150 | |
| 数字 pH 计 | — | PHS-3C | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Solarbio | D8371 | |
| 电子分析天平 | Cany | — | |
| 增强型化学发光 (ECL) 试剂 | Solarbio | PE0010 | |
| 胶片 | Kodak | — | |
| 荧光显微镜 DP71 | Olympus | DP71 | |
| 冷冻切片包埋介质 | Sakura | 4583 | |
| 凝胶电泳装置 | BIO-RAD | — | |
| 甘油 | Solarbio | IG0910 | |
| 甘氨酸 | Solarbio | G8200 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594 二抗 | Proteintech | SA00013-3 | |
| 山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗 | ZSGB-BIO | ZB2305 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗 | Proteintech | SA00013-2 | |
| 山羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗 | ZSGB-BIO | ZB2301 | |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 5 | |
| 高速冷冻离心机 3K15 | Sigma | 3K15 | |
| 水平轨道摇床 TS-1000 | 海门其林贝尔 | TS-1000 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 1.51j8 | |
| 甲醇 | 天津广富 | — | |
| 小鼠抗大鼠 GAPDH 一抗 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 小鼠抗大鼠 p-ERK1/2 一抗 | CST | 9101S | |
| Na2HPO3 | 天津北辰方正 | — | |
| NaH2PO3 | 天津大茂 | — | |
| 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| 病理级显微镜载玻片 | 世泰 | — | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | 碧云天 | ST506 | |
| 足底测试仪 37370 | UGO BASILE | 37370 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Solarbio | — | |
| 丙酮苯二甲酰胺 (PPF) | 陶素 | T19812 | |
| 兔抗大鼠 COX-2 一抗 | Abcam | Ab179800 | |
| 兔抗大鼠 GFAP 一抗 | Proteintech | 16825-1-AP | |
| 兔抗大鼠 Iba-1 一抗 | Proteintech | 10904-1-AP | |
| 兔抗大鼠 NeuN 一抗 | Abcam | Ab279297 | |
| 兔抗大鼠 t-ERK1/2 一抗 | Proteintech | 11257-1-AP | |
| 兔抗大鼠 TNF-α 一抗 | Proteintech | 29652-1-AP | |
| RIPA 裂解缓冲液 | Solarbio | R0010 | |
| SDS | Solarbio | S8010 | |
| 脱脂奶粉 | Solarbio | D8340 | |
| SPSS | IBM | 22 | |
| 四甲基乙二胺 (TEMED) | Solarbio | T8090 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| 吐温 X-100 | Solarbio | T8200 | |
| U0126-EtOH | Selleck | S1102 | |
| 超低温冰箱 | 海尔 | — | |
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参考文献
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