通过肽阵列和原生核小体拉下法，鉴定修饰组蛋白作为人类Spindlin家族成员4（SPIN4）的结合底物

摘要

最近在骨过度生长（一种新型发育障碍）患者中发现了人类Spindlin Family Member 4（SPIN4）中的遗传变异。提出了一种方案和新结果，描述了在核小体背景下对改造组蛋白作为SPIN4结合底物的生化鉴定。

摘要

人类斯宾德林家族成员4（SPIN4）刚刚作为一种新的骨骼生长调节因子出现。在表现出产前和产后过度生长综合征的患者中发现了SPIN4功能丧失变异，该综合征以X染色体显性方式遗传。SPIN4包含三个串联的都铎结构域重复，每个重复序列形成一个独立的芳香笼。这些都铎结构域被认为是基于序列同源性，用于组蛋白中甲基化精氨酸和赖氨酸残基的表观遗传读读域。然而，SPIN4的具体结合底物仍不明确。人类SPIN4，无论是野生型还是致病突变体，都通过昆虫细胞表达系统成功生成。通过组蛋白修饰肽阵列，确定了野生型与突变型SPIN4之间的结合亲和力差异。功能验证进一步证明SPIN4是组蛋白H3赖氨酸4甲基化（H3K4me）的真实读者，这一点通过生化拉低原生单核小体为证据。这种综合方法促进了表观遗传读读蛋白的快速结合靶点识别。

引言

Spindlin家族成员4（SPIN4）是一名表观遗传学读者，最近被发现患有过度生长综合征，表现出一系列出生前和产后过度生长以及高个子的星座^1,2。Spin4敲除（KO）小鼠重现了人类的精确表型，支持了因果关系。迄今为止，SPIN4是唯一被确认的独特表观遗传读读器，且能负向调控骨骼生长。然而，SPIN4作为生长关键表观遗传读读器，其生化特性尚未被鉴定，导致对这一新型发育障碍的基本致病机制的理解存在关键知识空白。SPIN4包含三个串联的都铎结构域重复序列，这些结构域通常被认为是甲基化的精氨酸或赖氨酸组蛋白读读蛋白结构域³。最近在一名产前产后骨过度生长综合征患者中发现了SPIN4^D82H错义变异。该突变影响SPIN4的第一个都铎域;然而，这些都铎结构域的相关结合底物尚不明确，限制了对SPIN4依赖性染色质调控和基因表达的功能性剥离。

识别读者蛋白结构域中新的组蛋白结合底物并不依赖单一的标准化方法。组蛋白的翻译后修饰（PTMs）主要发生在从核心核小体颗粒向外突出的组蛋白尾部。读者蛋白结构域识别组蛋白尾部PTM的过程变化很大，通常需要多价静电相互作用，涉及核小体DNA、连接DNA及/或其他组蛋白结构域，以整体稳定读者与靶点的^{相互作用。}目前，组蛋白尾肽的PTM已以微阵列形式构建并由多个厂商商业化。虽然基于组蛋白尾肽的PTM筛选读本蛋白结构域结合靶点具有高通量，但在缺核小体的情况下常常出现假阳性。此外，此类筛选的实验条件高度经验化，且不同蛋白间差异显著，技术上难以应对。基于核小体的合成PTM筛选或下拉能提供更为稳健的读数，但成本更高且通量低，因为重构携带多种PTM组合的核小体本身具有挑战性。

该方案描述了一种快速识别核小体中组蛋白PTM作为SPIN4结合靶点的方法。重组SPIN4被重构并与商业组蛋白PTM肽阵列进行筛选，以识别潜在结合靶点。随后，从活细胞中生成了含有多种内源组蛋白PTM的天然单核小体。单核小体的SPIN4拉近实现了初步筛选后基于抗体的组蛋白PTMs靶向验证。这一综合生化策略展示了一种原理验证方法，能够高效且高效地发现靶点，并可轻松应用于鉴定其他表观遗传读者蛋白的结合底物。

方案

所有涉及HEK293FT细胞的实验程序均遵循弗吉尼亚联邦大学机构生物安全委员会（IBC）指南。

1. 重组人类SPIN4的纯化

1. 克隆全长野生型SPIN4或SPIN4^D82H，带有N端1×FLAG表位标签，克隆为梭状病毒载体^6,7。
2. 通过转染Sf9细胞以杆状病毒载体制备杆菌病毒，细胞破裂时采集病毒，分割，并将病毒储存在−80°C ^6,7。
3. 在一个500毫升的埃伦迈耶瓶中，加入100毫升培养基、1.5×10个^8个Sf9 细胞和1毫升P1杆状病毒。
4. 在27.5°C的轨道摇床培养器中，温度设定为125转/分钟，在黑暗中孵育72小时。
5. 在含有蛋白酶抑制剂的BC150裂解缓冲液中，使用FLAG亲和力凝胶纯化FLAG-SPIN4，并以0.1 mg/mL的1×FLAG肽洗脱该蛋白。
6. 为完全去除1× FLAG肽，需在4°C下对BC150蛋白储存缓冲液进行洗脱，顺序如下：
   1. 第一次透析：1公升，1小时。
   2. 第二次透析：2升，过夜。
   3. 第三次透析：1公升，1小时。
7. 将透析蛋白浓缩至所需体积（SPIN4的浓度为600微升至150微升）。
8. 使用双辛戊酸（BCA）测定蛋白质浓度，并据此计算摩尔浓度。
9. 每次纯化步骤回收的粗蛋白量及相应估计产率汇总于 补充表1。从250毫升Sf9培养物中进行纯化，使用400微升抗FLAG亲和凝胶浆液。
10. 在BC150蛋白储存缓冲液中稀释浓缩SPIN4×10×（补充表2）。将1、2、5、10和20微升装入15%SDS–PAGE凝胶，并通过Coomassie蓝染色进行可视化（见图1A）。
11. 使用图像分析软件量化波段强度，确定负载相同体积的通道之间的相对信号强度。
12. 将强度比除以每种蛋白质的分子量，得到摩尔比。
13. 使用该摩尔比来修正步骤1.8中估算的摩尔浓度。
14. 将纯化蛋白分割，速冻于液氮中，储存于−80°C。 短期使用时，在进行下一个实验前，在4°C下储存一夜。

2. 组蛋白肽阵列

1. 通过将5克牛血清白蛋白（BSA）溶解于BC150蛋白储存缓冲液中，制备肽阵列阻断缓冲液，最终体积为100毫升。
2. 可选地用疏水标记笔勾勒肽阵列上的反应区域，以减少试剂消耗。
3. 将几张滤纸放入15厘米的培养皿中，并用水润湿。
4. 将肽阵列放置在湿润的滤纸上。
5. 小心地添加300微升的阻断缓冲区，完全覆盖每个阵列区域。
6. 盖上培养皿，在室温下孵育1–3小时。
7. 将FLAG-SPIN4置于阻隔缓冲液中，最终浓度为1微米。
8. 将1× FLAG肽置于阻断缓冲液中，最终浓度为1微米。
9. 为了提高信噪比并减少不需要的背景，可以在冷室中执行以下步骤。在添加蛋白质之前，先把封闭的胚胎（带培养皿）移到冷藏室。
10. 移除数组中的多余阻塞缓冲区。
11. 小心地将所需的FLAG-SPIN4蛋白或FLAG肽作为对照添加到每个块上。
12. 盖好培养皿，在冷藏室中孵育一夜。
13. 将约50毫升肽阵洗缓冲液加入Western blot洗盒，并带入冷藏室。
14. 丢弃蛋白质溶液，立即将阵列转移到洗涤液中，反应面朝上。
15. 将阵列洗涤五次，方法如下：前两次洗涤各1分钟，剩下三次洗涤各5分钟。
16. 用肽阵阻断缓冲液冲洗阵列以去除残留洗涤剂，然后将它们放回培养皿。
17. 制备1：2000稀释的抗FLAG抗体溶液，每块添加300微升。
18. 在室温下孵育1小时。
19. 重复步骤2.14到2.16来清洗阵列。
20. 以1：6000稀释制备HRP结合的山羊抗小鼠IgG（二级抗体）溶液，并每块添加300微升。
21. 在室温下孵育1小时。
22. 重复步骤2.14到2.16来清洗阵列。
23. 将阵列放入透明保护套内。
24. 加入约1毫升增强化学发光（ECL）底物，确保反应表面均匀覆盖。
25. 去除气泡，使用合适的成像系统（如数字成像仪或自放射摄影胶片）捕捉化学发光和明场图像（见图1B）。
26. 根据肽阵列软件及相关在线工具分析信号强度（图2A–C）。

3. FLAG-SPIN4 在拉下分析中的大规模表达

1. 在一个500毫升的Erlenmeyer瓶中，加入125毫升ESF921培养基、1.8×10个^8个Sf9 细胞，以及1.2毫升表达FLAG-SPIN4或FLAG-SPIN4^D82H的P1杆状病毒。
2. 在轨道摇动器培养箱（125转/分钟）下，27.5°C下孵育72小时。
3. 文化的分类如下：
   1. 将4毫升培养液放入15毫升的试管进行滴定。
   2. 将30毫升培养液分装在四根50毫升的管子中。
4. 以600 ×克 离心机离心15分钟，丢弃上清液。
5. 将颗粒迅速冷冻于液氮中，储存在−80°C下直到使用。

4. FLAG-SPIN4和FLAG-SPIN4^D82H的珠子与裂解液比的滴定

1. 在第3节第3.1步描述的5毫升Sf9培养中，每粒Sf9沉淀中加入1毫升BC150溶解缓冲液。
2. 对裂解液进行超声处理以确保完全破坏：振幅30%，开5秒/关闭5秒，总超声处理时间为15秒。
3. 在 20,000×克、4摄氏度离心10分钟，然后将上清液转移到新的1.5毫升管中。
4. 每次拉下反应准备20微升抗FLAG亲和力凝胶浆（3次滴定为60微升）
5. 用BC150裂解缓冲液清洗珠子：
   1. 加入1毫升BC150裂解缓冲液，短暂吸入漩涡。
   2. 离心机在 3000×克 下离心1分钟。
   3. 抽吸并丢弃上清液。
6. 每拉下一次反应（3次滴定120微升），将珠子重新悬浮在40微升BC150裂解缓冲液中。
7. 将裂解液放入含有BC150溶解缓冲液和珠悬浮液的1.5 mL管内（补充表3）
8. 将管子置于设定为15转/分钟、4°C的管子旋转器上孵育1.5小时。
9. 用3000 克× 离心1分钟，抽取上清液。
10. 将珠子洗三次，步骤如下：
    1. 短暂将珠子重新悬浮在500微升的BC150裂解缓冲液中，并短暂地进行涡旋。
    2. 离心机在 3000克× 克下循环1分钟。
    3. 抽吸上清液。
11. 将珠子重新悬浮于20微升1×Laemmli缓冲液中，并在95°C下孵育5分钟。
12. 离心机在3000 克× 离心机1分钟。
13. 将上清液用15% SDS–PAGE凝胶检测，并用Coomassie blue染色以估算蛋白质产量。
14. 根据数据，选择一个使珠子上抗体结合位点饱和的裂解液与珠子比例。实验中，每20微升珠子中300微升的裂解液≥足以达到完全结合能力。
    注意：“抗体结合位点饱和度”定义为增加裂解液体积后，目标蛋白的恢复率不再更大。
    注意：在相同摩尔浓度下，SPIN4^D82H 对FLAG亲和力凝胶的结合亲和力低于野生型对应物。
    注：在本实验环境中，从600万个Sf9细胞中提取了1毫升裂解液（计算为1.5 × 10个⁶ 细胞/mL ×4 mL），表明从~600万个Sf9细胞表达的SPIN4足以饱和20微升抗FLAG亲和凝胶浆液。

5. 大规模制备抗FLAG亲和力凝胶结合的FLAG-SPIN4作为诱饵

1. 每种待检测蛋白，收集两个30毫升培养物的沉淀。将每个沉淀重新悬浮于6 mL BC150裂解缓冲液中，转移至15 mL离心管，并用BC150溶解缓冲液将总体积调整为13 mL。
2. 在冰上以100%振幅对每个样品进行超声波处理，开启15秒/关闭30秒，总超声检测时间为2分钟。
3. 将裂解液转移到预冷的高速离心管中，并在 20,000×克（4°C）下离心15分钟。
4. 在1.5毫升离心管中加入200×（样品数+1）×1.1微升抗FLAG亲和力凝胶浆液。
5. 用>5柱体积（CV）的BC150溶解缓冲液清洗一次珠子。
6. 将珠子重新置于400 ×（样品数+1）×1.1微升BC150裂解缓冲液中。
7. 将获得的上清液转移到第4至15毫升离心管中。
8. 每根管子加入500微升Step 5.7珠悬浮液。
9. 在一管中加入3毫升BC150裂解液和60微升1×FLAG肽（100 mM）作为阴性对照。
10. 将样品置于设定为120转/分钟、4°C的管式旋转器上孵育1.5小时。
11. 在2000克下离心5分钟 × 然后丢弃上清液。
12. 将珠子重新悬浮在适量的上清液中，转移到1.5毫升的管子中。
13. 用 3000×克 离心1分钟，抽取上清液。
14. 用BC150裂解缓冲液清洗微珠五次，步骤如下：
    1. 将珠子重新悬浮于1毫升BC150裂解缓冲液中。
    2. 第4和第5次洗涤时，将样品放置在设定为20转/分钟、4°C的管式旋转器上，持续10分钟。
    3. 用3000克×离心1分钟，抽取上清液。
15. 将珠子重新悬浮于200微升BC150裂解缓冲液中。
16. 取9微升珠/缓冲液悬浮液，先用15% SDS–PAGE分析蛋白质含量，随后进行Coomassie蓝染色。
17. 由于蛋白质输入超过珠子结合能力，每珠体积中蛋白质结合量应在不同样品间相近。通过数字图像分析半量化能带强度，并调整后续反应的珠子数量。

6. 从HEK293FT细胞制备单核小体

1. 在15厘米组织培养皿中，使用10%胎牛血清（FBS）在DMEM培养基中HEK293FT，5%_CO2 加湿培养箱中，使用10%胎牛血清（FBS）培养基，培养至约90%的汇聚度。
2. 早期传代HEK293FT细胞通过商业化获得并通过STR剖析进行鉴定。
   注：一个15厘米的盘子产生约2700万个细胞，足以进行1至2次拉下反应。针对六个反应（包括负向对照组），准备至少三个15厘米的盘子。如果目标组蛋白翻译修饰（PTM）稀有或不稳定，应相应增加细胞数2–10×。
3. （可选） 根据感兴趣的组蛋白修饰，向培养基添加适当的PTM抑制剂（补充表2），并潜伏24小时。
   注意：如果存在丰富的组蛋白PTM，这一步骤可省略。
4. 当细胞接近100%汇聚时，收集如下方法：
   1. 吸入培养基。
   2. 用10毫升冰冷的PBS轻轻冲洗细胞，然后抽吸。
   3. 加入5毫升冰镇PBS。
   4. 将细胞在冰上刮取，转移到50毫升的管子上（所有盘子都可以混合使用）。
   5. 离心机在 13,000×克，4摄氏度，离心10分钟。
   6. 丢弃上清液。
5. （可选） 要么立即进行，要么将细胞颗粒冷冻以备后用：
   1. 估算颗粒体积。
   2. 将缓冲液G重新悬浮于9×颗粒体积中，达到最终20%的甘油浓度。
   3. 在液氮中速冻，并以−80°C储存。
6. 如果继续冷冻沉淀，先在冰上解冻沉淀，以1300 ×克、4摄氏度离心5分钟，然后丢弃上清液。
7. 将（新鲜或解冻的）沉淀重新悬浮在10×沉淀体积的TMSD缓冲液中（40 mM Tris-HCl，pH 7.5,5 mM MgCl 2,250 mM 蔗糖，1 mM DTT），含蛋白酶抑制剂，使用血清学移液管。
8. 在TMSD缓冲液中新鲜制备10%NP-40，并加入0.11×总反应体积，以达到最终NP-40浓度~1%。
9. 将悬挂置于设定为120转/分钟、4°C的管式旋转器上，孵化5分钟。
10. 将10微升悬浮液与10微升的锥蓝混合，在显微镜下观察以监测核染色。确保细胞核与细胞质完全隔离（见图3A）。
11. 当约95%的核为锥蓝阳性时，进入下一步。对于HEK293FT细胞，通常只需1%的NP-40培养5分钟即可。对于其他细胞类型，请验证并调整孵育时间。
12. 在1300 ×克、4摄氏度离心5分钟后，丢弃上清液。
13. 将沉淀重新悬浮在10×沉淀体积的TMSD缓冲液中。
14. 重复步骤6.12至6.13五次，完全去除残留的NP-40。
15. 将沉淀重新悬浮在5×体积的缓冲液B中。
16. 每10,000个核加入1单位微球菌核酸酶（MNase），并在37°C的水浴中培养。培养过程中偶尔搅动管子，保持细胞核均匀悬浮
17. 在指定时间点（0.5、1和2.5小时），将50微升反应取入1.5毫升管内，立即加入1微升0.5 M EDTA-Na（pH 8.0），并进行漩涡处理。
18. 按照以下程序从每个时间点提取DNA：
    1. 加入80微升H₂O、30微升10%SDS和20微升5米氯化钠;漩涡。
    2. 加入200微升酚/氯仿;彻底地旋转。
    3. 离心机温度 20,000克，复活，3分钟，恢复×克。
    4. 小心地将上清液转移到新的1.5毫升管上。
    5. 加入1毫升100%乙醇和20微升3毫升醋酸钠（pH值5.2）;漩涡。
    6. 离心机20,000克 ×，RT，5分钟。
    7. 去除上清液，加入1毫升70%乙醇。
    8. 离心机20,000 克×，RT，1分钟。
    9. 取出上清液，打开盖子，在55°C下将沉淀晾干10分钟。
    10. 将沉淀重新悬浮于50微升TE缓冲液中。
19. 在1%TBE琼脂糖凝胶上运行样本以确认单核小体DNA尺寸（147碱基对）（见图3B）。
20. （可选） 微球菌核酸酶（MNase）的消化效率因细胞类型而异，如有需要，可于反应中加入额外MNase以完全去除多核小体。例如，如果1小时和2小时样本相似，3小时时增加更多MNase。
21. 当观察到主要的~147 bp带，或当额外的MNase/延长培养不再改变片段大小时，通过将0.5 M EDTA-Na（pH8.0）加入至最终浓度2 mM，停止反应。
22. 离心机温度为1300 ×克，4摄氏度，离心5分钟。收集上清液（S1）。
23. 将沉淀重新悬浮于10×沉淀体积的TE缓冲液+蛋白酶抑制剂中，并在设定为20转/分钟、4°C的管旋转器上孵育至少30分钟。
    注意：单核小体提取效率因细胞类型而异。0-300 mM 的 NaCl 可用于高效提取核小体。
24. 离心机温度为1300 ×克，4摄氏度，离心5分钟。收集上清液（S2）。
25. 将S1和S2各50微升转移到不同的1.5 mL管。
26. 通过琼脂糖凝胶电泳分析所有组分（步骤6.17至6.18），以评估DNA尺寸分布和提取效率。大多数单核小体存在于S2组分（图3C）。
27. 将S2转移到高速离心管中，以 20,000×克、4摄氏度旋转10分钟以去除不溶物质。
28. 收集上清液并对BC150溶解缓冲液（无抑制剂）进行透析：
    1. 第一次透析：1公升，1小时。
    2. 第二次透析：2升，过夜。
29. 透析后，再次以20,000 ×克、4摄氏度离心10分钟，去除残留的不溶性碎屑。
30. 收集最后的上清液。
31. 将5微升上清液与35微升BC150溶解缓冲液和10微升5×Laemmli缓冲液混合，在95°C加热5分钟，然后在15%SDS–PAGE凝胶上加载1、2、5、10和20微升。
32. 在Laemmli缓冲液中装入1、2和5微升0.1 mg/mL的BSA，作为产量估计的参考。
33. 用Coomassie blue染色，并使用图像分析软件半定量估计核小体产率（见图3D）。

7. 修正性核小体拉低

1. 将1克BSA溶解在BC150裂解液中，制成2×珠阻滞缓冲液，最终体积为10毫升，然后进行漩涡溶解直到完全溶解。
2. 将含有等效摩尔量蛋白质的FLAG-SPIN4-WT和FLAG-SPIN4^D82H 珠子（来自第5节步骤5.16至5.17）转移到单独的1.5毫升管中。
3. 向FLAG-SPIN4-WT样本中加入等量的负对照珠（来自第5节第10步）。
4. 使用BC150裂解缓冲液调整所有珠子样本的总体积，使其保持一致。
5. 在每个装有珠子和BC150裂解缓冲液的管子中加入等量的2×珠阻断缓冲液。
6. 将样品置于设定为20转/分钟、4°C（O/N）的管式旋转器上孵育一夜。
7. 在冰上解冻从HEK293FT细胞提取的适当量1×核小体。所需体积取决于所需的核小体与SPIN4摩尔比值。在初期优化时，使用核小体与SPIN4的1：1摩尔比。
8. 充分混合1×核小体与等量的2×珠阻滞缓冲液。
9. 将第7.8步的混合物与预封闭的珠子混合在15毫升管中。
10. 将混合物置于设定为20转/分钟、4°C的管式旋转器上孵育4小时或过夜。
11. 离心机温度为3000 ×克，4摄氏度，离心3分钟。
12. 小心地丢弃上清液。
13. 将珠子重新悬浮在1 mL BC150裂解缓冲液中，转移到1.5 mL管中。
14. 将珠子洗三次，步骤如下：
    1. 在3000克 ×离心，1分钟，抽取上清液。
    2. 将珠子重新悬浮于1毫升BC150裂解缓冲液中。
    3. 偶尔搅动管子，保持珠子均匀悬挂。
15. 珠子再洗两次，步骤如下：
    1. 离心 3000克×1分钟，抽取上清液。
    2. 将珠子重新悬浮于1 mL BC150裂解缓冲液中。
    3. 以20转/分钟、4摄氏度旋转10分钟。
16. 清洗后，将珠子重新悬浮在9柱体积（CV）的BC150溶解缓冲液中。
17. 从每个样品取160微升，混合40微升5×/64的Laemmli缓冲液，在95°C加热5分钟。
    注意：建议对蛋白-核小体复合体进行FLAG肽洗脱，这样可以获得更干净且背景更少的结果。
18. 离心机温度为 3000×克，室温，5分钟。
19. 将5微升上清液装入15%SDS–PAGE凝胶，进行银染色（见图4A）。
20. 再将5微升上清液装入15% SDS–PAGE凝胶，转移到PVDF膜上，并用针对目标组蛋白PTMs的特异性原抗和次级抗体探针（见图4B）。

结果

为研究人类SPIN4的结合底物，野生型SPIN4和一种与过度生长综合征相关的患者源性突变体，利用Sf9昆虫细胞表达系统重组。具体来说，这是一种天冬氨酸（D）与组氨酸（H）在残基82（D82H）处的错义突变，位于SPIN4的第一个都铎结构域内，暗示其在调控SPIN4底物结合中的作用。使用编码单一FLAG标记SPIN4的杆状病毒载体在Sf9细胞中表达蛋白，随后进行单步FLAG亲和力纯化和1×FLAG肽竞赛洗脱（见图1A）。随后，将纯化后的SPIN4蛋白的等摩尔浓度置于由384个独特组蛋白PTM组合组成的组蛋白肽阵列中培养。结合特定组蛋白PTM的SPIN4蛋白被FLAG抗体和HRP结合的二级抗体检测到（见图1B）。化学发光信号通过数字方式量化。SPIN4与H3K4me1/2/3肽结合，而这种结合亲和力会受到其他顺式PTMs（如H3R2me2a、H3R2me2s和H3K9me3）的负面影响（见图2A-C

讨论

提出了一种既省时间又经济的方法，用于生化地定位特定组蛋白PTM作为该蛋白的靶点，并评估其疾病相关突变如何影响靶点的结合亲和力。该方法的优点是无需昂贵或耗时的合成核小体重组。该方法利用了商业化组蛋白PTM肽阵列的便利性，同时通过使用天然单核小体作为生理相关结合底物，确保SPIN4是真正的H3K4me读读器。该方法的关键步骤是成功重建感兴趣的蛋白质。它是一个实证性的，也可能具有挑战性。在某些情况下，候选蛋白的截断版本可以用来克服技术难题。该方法的一个局限是使用未被生化定义的天然核小体。然而，按照该方法，单核小体在拉下作用后，可以通过质谱进一步检查，从而获得结合特异性的全局视角，并解剖顺式组蛋白PTMs组合，从而克服这一^限制8。

结果中一个有趣的观察是，H3R2瓜氨酸化（H3R2citr）似乎允许SPIN4与H3K4me1/2/3结合，而H3R2me2a/s则阻断这种相互作用。H3R2me2a/s已被充分记录，有助于抑制读片蛋白对H3K4me的识别，因为H...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL微离心管	萨斯泰特	72.690.001	一般实验
15厘米组织培养皿	萨斯泰特	83.3903.300	一般实验
15 mL 锥形离心管	萨斯泰特	62.554.101	一般实验
50毫升锥形离心管	萨斯泰特	62.548.004	一般实验
500毫升埃伦迈耶瓶	恒星科学	CT229809	Sf9细胞培养
阿默舍姆ImageQuant 800 CCD成像仪	西提瓦	IMQ800	CCD成像系统
Anti-FLAG M2亲和力凝胶	西格玛-奥尔德里奇	A2220	生化拉下
抗FLAG M2抗体	西格玛-奥尔德里奇	F1804	西部污点
阿普罗肽	医疗化学快递	HY-P0017	蛋白酶抑制剂
数组分析软件	主动主题	https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip	MOD化肽阵列数据分析
ASI 琼脂糖法学部	碱科学	A7700	DNA凝胶
Bac-Bac 杆状病毒表达系统	热力科学	10359016	基囊病毒表达
盐酸苯并胺	医疗化学快递	哈W018781	蛋白酶抑制剂
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥尔德里奇	A9647	蛋白质定量标准
溴酚蓝	热力科学	A18469.08	拉梅利缓冲器
库马西明亮蓝R-250	热力科学	20278	蛋白凝胶染色
二硫代特醇（DTT）	西格玛-奥尔德里奇	D5545	裂解缓冲液
EDTA	RPI研究产品	E58100	裂解缓冲液
增强化学发光（ECL）底物	西提瓦	RPN2232	西部污点
ESF 921 昆虫细胞培养基	表达系统	96-001	Sf9细胞培养
乙醇（200 proof）	光谱化学	ET107	DNA沉淀
EVOS M5000成像系统	Invitrogen	M5000	一般成像
FLAG肽	医疗化学快递	HY-P7006	下拉洗脱
甘油	西格玛-奥尔德里奇	G77893	存储缓冲区
H3K4me1抗体	主动主题	39300	西部污点
H3K4me2抗体	细胞信号传导	9725T	西部污点
H3K4me3抗体	细胞信号传导	9751T	西部污点
HEK293FT细胞	热力科学	R70007	人类胚胎肾纤维母细胞系
天哪	西格玛-奥尔德里奇	H3375	裂解缓冲液
图片J	美国国立卫生研究院	https://imagej.net/ij/download.html	基于Java的图像处理程序
Leupeptin半硫酸盐	医疗化学快递	HY-18234A	蛋白酶抑制剂
微球菌核酸酶（MNase）	NEB	M0247S	染色质消化中的内切核酸酶
120型声波驱散器	费舍尔科学	FB120110	超声处理
改组组蛋白肽阵列	主动主题	13005	蛋白质结合测定
肽A型	医疗化学快递	HY-P0018	蛋白酶抑制剂
过氧化物酶IgG分数单克隆山羊抗小鼠IgG，轻链特异性	杰克逊免疫研究	115-035-174	西部污点
pFastBac1-Flag-SPIN4	热力科学	10360014	梭状病毒表达载体
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H	热力科学	10360014	梭状病毒表达载体
酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）	西格玛-奥尔德里奇	P2069	DNA纯化
Pierce Rapid Gold BCA 蛋白质检测套件	热力科学	PIA53226	蛋白质量化子
皮尔斯银色染色套件	热力科学	24612	蛋白质检测
PMSF蛋白酶抑制剂	热力科学	36978	蛋白酶抑制剂
聚丙烯酰胺凝胶	内部制作	无	蛋白质凝胶
Sf9昆虫细胞	空军交通管制委员会	CRL-1711	用于杆状病毒表达的昆虫细胞系
Slide-A-Lyzer MINI透析装置，10K MWCO	热力科学	69572	蛋白质透析
醋酸钠	西格玛-奥尔德里奇	S8750	DNA沉淀
氯化钠	Fischer	BP358-1	一般缓冲区
十二烷基硫酸钠（SDS）	西格玛-奥尔德里奇	L3771	一般缓冲区
锥虫蓝溶液（0.4%）	热力科学	15250061	核染色