近期在骨骼过度生长患者中发现人类纺锤体相关蛋白家族成员4（SPIN4）的遗传变异，这是一种新型发育障碍。本文介绍了一种实验方案及新研究成果，描述了在核小体背景下通过生物化学方法鉴定SPIN4结合底物——修饰组蛋白的过程。
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本文内容
摘要
摘要
人类纺锤蛋白家族成员4（SPIN4） recently被发现是一种新的骨骼生长调控因子。在表现出产前和产后过度生长综合征的患者中鉴定出SPIN4的功能缺失型变异，该综合征以X连锁显性方式遗传。SPIN4包含三个串联重复的Tudor结构域，每个结构域形成一个独立的芳香族笼状结构。基于序列同源性，这些Tudor结构域被认为是组蛋白上甲基化精氨酸和赖氨酸残基的表观遗传“阅读器”结构域。然而，SPIN4确切的结合底物仍不明确。通过昆虫细胞表达系统，成功制备了人源SPIN4的野生型及致病突变型蛋白。利用组蛋白修饰肽段芯片技术，测定了野生型与突变型SPIN4之间的差异结合亲和力。功能验证实验进一步证实，SPIN4是组蛋白H3第4位赖氨酸甲基化（H3K4me）的真实阅读器，这一点通过天然单核小体的生物化学pull-down实验得到了验证。这一整合方法有助于快速鉴定表观遗传阅读器蛋白的结合靶标。
引言
Spindlin 家族成员 4（SPIN4）是一种表观遗传阅读蛋白，最近被发现与过度生长综合征相关，临床表现为产前和产后过度生长以及身材高大1,2。Spin4 基因敲除（KO）小鼠重现了与人类完全一致的表型，支持其致病因果关系。迄今为止，SPIN4 是唯一被鉴定出的特异性负向调控骨骼生长的表观遗传阅读蛋白。然而，作为生长调控中关键的表观遗传阅读蛋白，SPIN4 的生化特性尚未得到表征，导致对该新型发育障碍中基本致病机制的理解存在重要知识空白。SPIN4 包含三个串联重复的 Tudor 结构域，这类结构域通常被认为是识别甲基化精氨酸或赖氨酸组蛋白的蛋白结构域3。最近在一名患有产前和产后骨骼过度生长综合征的患者中发现了一个 SPIN4D82H 错义变异。该突变影响 SPIN4 的第一个 Tudor 结构域，但这些 Tudor 结构域相应的结合底物仍不明确，限制了对 SPIN4 依赖性染色质调控及骨骼发育过程中基因表达调控功能的深入解析。
识别阅读蛋白结构域新的组蛋白结合底物并不依赖于单一的标准化方法。组蛋白的翻译后修饰（PTMs）大多发生在从核心核小体颗粒向外突出的组蛋白尾部。阅读蛋白结构域对组蛋白尾部上PTMs的识别具有高度可变性，通常需要多价、静电相互作用，并涉及核小体DN....
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方案
所有涉及HEK293FT细胞的实验操作均严格遵守弗吉尼亚联邦大学机构生物安全委员会（IBC）的指导方针。
1. 重组人SPIN4的纯化
- 克隆全长野生型 SPIN4 或 SPIN4D82H 带有 N 端 1× FLAG表位标签插入杆状病毒载体6,7.
- 通过将杆状病毒载体转染Sf9细胞来制备杆状病毒，待细胞破裂后收集病毒，分装并储存在−80℃ °C6,7.
- 在500 mL锥形瓶中，加入100 mL培养基和1.5 × 108 Sf9 细胞和 1 mL P1 杆状病毒。
- 在27.5℃下培养细胞 °在黑暗条件下，于125 rpm的轨道摇床培养箱中孵育72小时。
- 使用含蛋白酶抑制剂的BC150裂解缓冲液中的FLAG亲和凝胶纯化FLAG-SPIN4，并用1洗脱蛋白× 0.1 mg/mL 的 FLAG 肽段
- 彻底去除 1× FLAG 肽，将洗脱的 FLAG-SPIN4 在 4 ℃ 下对 BC150 蛋白....
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结果
为了研究人类SPIN4的结合底物，采用Sf9昆虫细胞表达系统重构了野生型SPIN4以及一种与过度生长综合征相关的患者来源突变体。该突变为第82位氨基酸由天冬氨酸（D）到组氨酸（H）的错义突变（D82H），位于SPIN4的第一个Tudor结构域内，提示其在调控SPIN4底物结合中的作用。使用编码单个FLAG标签SPIN4的杆状病毒载体在Sf9细胞中表达蛋白，随后进行一步法FLAG亲和纯化，并用1× FLAG肽进行竞争性洗脱（图1A）。等摩尔浓度的纯化SPIN4蛋白被用于与包含384种独特组蛋白PTM组合的组蛋白肽段微阵列共同孵育。通过FLAG抗体和HRP偶联的二抗检测SPIN4蛋白与特定组蛋白PTM的结合情况（图1B）。化学发光信号被数字化定量。SPIN4可结合H3K4me1/2/3肽段，而顺式存在的其他PTM（如H3R2me2a、H3R2me2s和H3K9me3）会负向影响其结合亲和力（图2A-C）。与野生型SPIN4相比，S.......
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讨论
本文介绍了一种在时间和成本上均高效的方法，用于通过生物化学手段精确定位特定组蛋白翻译后修饰（PTM）作为功能尚未明确的蛋白质的作用靶点，并评估该蛋白质的疾病相关突变如何影响其对靶标的结合亲和力。该方法的优势在于无需进行昂贵且耗时的人工合成核小体重建。该策略利用了商业化组蛋白PTM肽段芯片的便利性，同时采用天然单核小体作为生理相关性更高的结合底物，从而证实SPIN4确实是H3K4me的特异性识别蛋白。该方法的关键步骤是目标蛋白的成功重组，这一过程具有经验性，可能具有挑战性。在某些情况下，可使用候选蛋白的截短形式以克服技术障碍。该方法的一个局限性在于使用了天然核小体，其生化组成未被完全明确定义。然而，通过本方法，在pull-down实验后可对单核小体进一步进行质谱分析，从而全面评估结合特异性，并解析顺式（in cis）存在的多种组蛋白PTM组合，以此弥补上述局限性8。
结果中的一个有趣观察是，H3R2瓜氨酸化（H3R2citr）似乎允许SPIN4结合H3K4me1/2/3，而H3R2me2a/s则会阻断这种相互作用。已有.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢Yu实验室和Jee实验室所有过去和现任成员提供的技术支持。J.-R.Y. 的研究得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所最大化研究人员研究奖（MIRA）R35GM160046的资助。 YH.J 得到了儿童国家医院和儿童研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Sarstedt | 72.690.001 | 常规实验 |
| 15 cm 组织培养皿 | Sarstedt | 83.3903.300 | 常规实验 |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Sarstedt | 62.554.101 | 常规实验 |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Sarstedt | 62.548.004 | 常规实验 |
| 500 mL 锥形瓶 | Stellar Scientific | CT229809 | Sf9 细胞培养 |
| Amersham ImageQuant 800 CCD 成像系统 | Cytiva | IMQ800 | CCD成像系统 |
| Anti-FLAG M2 亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | 生化拉下实验 |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | 蛋白质印迹法 |
| 抑肽酶 | MedChemExpress | HY-P0017 | 蛋白酶抑制剂 |
| 阵列分析软件 | Active Motif | https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip | 修饰肽段芯片数据分析 |
| ASI 琼脂糖LE | Alkali Scientific | A7700 | DNA凝胶 |
| Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 | 赛默飞世尔科技 | 10359016 | 杆状病毒表达 |
| 盐酸苯甲脒 | MedChemExpress | HY-W018781 | 蛋白酶抑制剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9647 | 蛋白质定量标准 |
| 溴酚蓝 | 赛默飞世尔科技 | A18469.08 | Lammeli缓冲液 |
| 考马斯亮蓝 R-250 | 赛默飞世尔科技 | 20278 | 蛋白质凝胶染色 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D5545 | 裂解缓冲液 |
| EDTA | RPI 研究产品 | E58100 | 裂解缓冲液 |
| 增强型化学发光（ECL）底物 | Cytiva | RPN2232 | 蛋白质印迹 |
| ESF 921 昆虫细胞培养基 | 表达系统 | 96-001 | Sf9 细胞培养 |
| 乙醇（200 proof） | Spectrum Chemical | ET107 | DNA沉淀 |
| EVOS M5000 成像系统 | Invitrogen | M5000 | 常规成像 |
| FLAG肽 | MedChemExpress | HY-P7006 | 下拉洗脱 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G77893 | 储存缓冲液 |
| H3K4me1 抗体 | Active Motif | 39300 | 蛋白质印迹 |
| H3K4me2 抗体 | 细胞信号传导 | 9725T | 蛋白质印迹法 |
| H3K4me3 抗体 | 细胞信号传导 | 9751T | 蛋白质印迹法 |
| HEK293FT细胞 | 赛默飞世尔科技 | R70007 | 人胚胎肾成纤维细胞系 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | 裂解缓冲液 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.net/ij/download.html | 基于Java的图像处理程序 |
| 亮抑酶肽半硫酸盐 | MedChemExpress | HY-18234A | 蛋白酶抑制剂 |
| 微球菌核酸酶（MNase） | NEB | M0247S | 染色质消化用内切核酸酶 |
| Model 120 超声波破碎仪 | Fisher Scientific | FB120110 | 超声处理 |
| 修饰组蛋白肽段芯片 | Active Motif | 13005 | 蛋白质结合实验 |
| Pepstatin A | MedChemExpress | HY-P0018 | 蛋白酶抑制剂 |
| 辣根过氧化物酶标记的IgG组分单克隆山羊抗小鼠IgG轻链特异性抗体 | 杰克逊免疫研究实验室 | 115-035-174 | 蛋白质印迹法 |
| pFastBac1-Flag-SPIN4 | 赛默飞世尔科技 | 10360014 | 杆状病毒表达载体 |
| pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H | 赛默飞世尔科技 | 10360014 | 杆状病毒表达载体 |
| 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA纯化 |
| Pierce Rapid Gold BCA 蛋白质定量检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | PIA53226 | 蛋白质定量 |
| Pierce 银染试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 24612 | 蛋白质检测 |
| PMSF蛋白酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 36978 | 蛋白酶抑制剂 |
| 聚丙烯酰胺凝胶 | 自制 | N/A | 蛋白质凝胶 |
| Sf9 昆虫细胞 | ATCC | CRL-1711 | 用于杆状病毒表达的昆虫细胞系 |
| Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，10K 截留分子量（MWCO） | 赛默飞世尔科技 | 69572 | 蛋白质透析 |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S8750 | DNA沉淀 |
| 氯化钠 | Fischer | BP358-1 | 通用缓冲液 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L3771 | 通用缓冲液 |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | 细胞核染色 |
参考文献
- Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
- Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with....
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重印与许可
