铁过载降低了胰腺组织中 MEG3 的表达。 MEG3 可能在对抗铁诱导的胰岛 β 细胞凋亡中发挥保护作用，其机制可能涉及对 NF-ĸB 通路的调控。该机制可能参与了伴有铁过载的 β-地中海贫血患者中胰岛功能障碍的发生。
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铁过载降低了胰腺组织中 MEG3 的表达。 MEG3 可能在对抗铁诱导的胰岛 β 细胞凋亡中发挥保护作用，其机制可能涉及对 NF-ĸB 通路的调控。该机制可能参与了伴有铁过载的 β-地中海贫血患者中胰岛功能障碍的发生。
重型β-地中海贫血（β-TM）患者常表现为葡萄糖代谢异常，铁过载、慢性贫血、激素失衡、肝功能障碍以及与炎症相关的胰岛素抵抗等因素被认为是导致胰岛功能障碍的重要原因。长链非编码核糖核酸（lncRNA）在细胞凋亡和葡萄糖稳态调控中的作用日益受到关注。本研究探讨lncRNA——母源表达基因3（MEG3）在铁诱导的胰岛β细胞损伤中的功能。通过腹腔注射右旋糖酐铁建立铁过载小鼠模型，采用普鲁士蓝染色和苏木精-伊红染色评估胰腺中铁沉积及组织损伤情况，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）定量检测MEG3的表达水平。体外实验中，将MEG3小干扰RNA转染至MIN6细胞，通过流式细胞术检测细胞凋亡，采用蛋白质印迹法（Western blotting）评估NF-κB信号通路活性。组织学染色结果显示，铁过载小鼠胰腺组织中存在显著的铁沉积和结构损伤。RT-PCR分析显示，铁过载小鼠胰腺中MEG3表达显著降低（p < 0.05），且体外铁处理亦导致MIN6细胞中MEG3表达下调。沉默MEG3可加重铁诱导的MIN6细胞凋亡，并激活NF-κB信号通路。上述结果提示，MEG3在铁诱导的胰岛β细胞损伤中可能发挥保护作用，其机制可能与调控NF-κB通路相关。 关键词：β-地中海贫血，铁过载，胰岛β细胞，MEG3，长链非编码RNA，细胞凋亡，NF-κB信号通路，葡萄糖代谢紊乱<0.05）。体外实验中，与对照组相比，MEG3 沉默显著增加了 MIN6 细胞的凋亡。Western blot 分析显示 NF-ĸB 水平升高，表明在 MEG3 沉默的细胞中 NF-ĸB 信号通路被激活。这些结果提示，在铁过载条件下，MEG3 下调可能通过 NF-ĸB 信号通路促进胰岛 β 细胞凋亡。 MEG3 基因可能在抵抗铁诱导的胰岛 β 细胞凋亡中发挥保护作用，其机制可能涉及对 NF-ĸB 通路的调控。该机制可能参与了伴有铁过载的 β-地中海贫血患者中胰岛功能障碍的发生。
β-地中海贫血是一组遗传性血液系统疾病，其特征是β-珠蛋白链的生成减少或缺失，导致慢性贫血和无效红细胞生成1。在输血依赖型β-地中海贫血重型（β-TM）患者中，反复输血和溶血常引起全身性铁过载，可损伤多个器官，并导致一系列内分泌并发症，包括葡萄糖代谢异常2。此外，慢性贫血可增加胰腺负担，激素失衡影响葡萄糖调节，肝功能障碍损害葡萄糖代谢，以及炎症过程诱导的胰岛素抵抗，这些因素均可能促成β-TM患者出现高血糖。因此，β-TM患者的葡萄糖代谢紊乱具有多因素性质2,3。最近一项荟萃分析报道，β-TM患者中空腹血糖受损、糖耐量异常（IGT）和糖尿病（DM）的患病率分别为17.21%、12.46%和6.54%，表明该人群葡萄糖代谢障碍的负担正在增加3。
尽管β-地中海贫血（β-TM）中异常葡萄糖代谢的临床相关性日益增加，但其潜在机制仍不甚清楚。既往研究表明，慢性铁过载（主要源于反复输血和溶血）可导致铁在胰腺中过度沉积，尤其是在胰岛β细胞内。这种铁的积聚会促进活性氧（ROS）的生成，加剧氧化应激，进而引发线粒体功能障碍，损害胰岛素的合成与分泌，最终导致β细胞凋亡和胰岛素缺乏4,6。此外，铁过载还可能通过氧化应激介导的炎症反应以及干扰胰岛素信号通路，导致外周胰岛素抵抗。然而，铁过载与β细胞损伤及全身性葡萄糖代谢紊乱之间的分子通路十分复杂，尚未被完全阐明。长链非编码核糖核酸（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的转录本，近年来被发现是多种生物学过程的重要调控因子，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌以及氧化应激反应7,8,9。已知胰腺胰岛β细胞表达超过1,000种lncRNA，提示其在维持内分泌功能方面可能具有重要的调控作用10。
然而，关于长链非编码RNA（lncRNA）在铁过载诱导的胰岛β细胞损伤中的表达谱及其功能作用，目前了解甚少，尤其是在β-地中海贫血（β-TM）背景下。近期研究发现，长链非编码RNA MEG3（MEG3）可促进胰岛素分泌并抑制胰腺β细胞凋亡11。然而，其在铁过载条件下对胰腺β细胞的影响仍不明确。在其他病理状态下，lncRNA已被证实可与NF-kappa（ĸ）B、JNK和Nrf2等关键信号通路相互作用，而这些通路也参与了氧化应激及铁过载相关的细胞损伤过程12,13,14。其中，NF-ĸB是一种在氧化应激条件下被激活的核心转录因子，已被证实参与铁过载状态下的β细胞凋亡15,16,17。因此，本研究探讨了在铁过载条件下，MEG3的下调可能通过NF-ĸB信号通路加剧胰岛β细胞凋亡。该研究可能为深入理解β-TM中葡萄糖代谢异常的分子机制提供新的视角。
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本研究中采用的实验方案已获得海南省人民医院伦理委员会的批准（方案编号：2021-239）。所有实验操作均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》和《赫尔辛基宣言》。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 动物模型与实验设计
本研究使用了36只雄性C57BL/6J小鼠（4周龄，体重约20 g）。所有小鼠均饲养在标准实验室条件下（20–25 °C，相对湿度50%–65%，12小时光照/黑暗循环），并可自由摄食和饮水。经过7天的适应性饲养后，小鼠被随机分为两组（每组n=18）：铁过载组（模型组），每周两次腹腔注射铁右旋糖酐（0.2 g/kg），持续4周；对照组则通过腹腔注射给予等体积的生理盐水。4周后，处死小鼠并采集胰腺组织用于后续分析。
2. 血清铁测定
在动情间期，于1%戊巴比妥麻醉下从小鼠眶后窦采集血液样本。血液在室温下静置1小时后，于4 °C、3,000 rpm离心15分钟。分离血清并储存在-80 °C。根据制造商说明书，使用铁离子比色法检测试剂盒测定血清铁浓度。
3. 组织学分析
胰腺组织标本经4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋，再制备组织切片。获取厚度为4–5 µm的连续组织切片，并按照标准程序进行脱蜡和水化处理。随后采用苏木精-伊红染色进行组织形态学观察，同时依据常规组织学染色方案，通过普鲁士蓝染色评估胰腺组织中的铁沉积情况。
4. 细胞培养与小干扰核糖核酸转染
MIN6 小鼠胰岛β细胞在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中培养，培养基中添加 15% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、10 mM HEPES、50 mM 丙酮酸钠和 50 µmol/L β-巯基乙醇。所有实验均在细胞融合度达到 80% 时进行。每次细胞培养时取 6–8 ml 培养基。细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养。在功能研究中，处于对数生长期的 MIN6 细胞使用 Lipofectamine 2000 按照制造商说明书转染针对长链非编码 RNA（lncRNA）的特异性小干扰 RNA（siRNA）（根据微阵列结果选定靶向 lncRNA；抑制组）或阴性对照 siRNA（抑制阴性对照组）。转染 24 小时后，通过定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）或蛋白质印迹法（western blot）检测基因敲低效率。该 siRNA 的靶序列如下：siMEG3：GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT；siNC：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT。每个实验均设置三个重复，并独立重复三次。
5. 逆转录聚合酶链式反应检测
使用市售的基于苯酚的RNA提取试剂，按照制造商说明书从胰腺组织样本和MIN6细胞中提取总RNA。使用逆转录试剂盒在20 µL的总反应体系中合成互补DNA（cDNA）。逆转录完成后，根据样本定量分析结果，大多数样本的cDNA浓度约为1 µg/µL。随后，取1 µL cDNA模板用于定量实时PCR扩增。qRT-PCR采用基于SYBR Green的PCR检测试剂盒，扩增条件如下：95 °C 预变性30 s，90 °C 变性15 s，60 °C 退火34 s，68 °C 延伸30 s。相对基因表达水平采用比较阈值循环法（2-ΔCT法）进行计算。GAPDH作为内参基因用于实时PCR数据的标准化。所有实验操作均按照相应制造商的操作规程进行，每项实验均独立重复至少三次。本研究中使用的引物序列列于补充表1和表2中。
6. 细胞计数试剂盒-8 检测
根据制造商的说明书，使用细胞计数试剂盒-8检测细胞增殖能力。简言之，将转染si-MEG3或si-NC的MIN6细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种于96孔培养板中，培养24小时。在指定的时间点，向每孔加入10 µL细胞活力试剂，将培养板置于37 °C孵育2小时。随后使用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。细胞活力以对照组的百分比表示。
7. 通过流式细胞术检测细胞凋亡
根据制造商说明书，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测MIN6细胞的凋亡变化。siRNA转染48小时后，收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤两次，并重悬于结合缓冲液中。随后，细胞在避光条件下于室温与5 µL Annexin V-FITC和5 µL碘化丙啶孵育15分钟。染色后立即通过流式细胞术分析样品。使用流式细胞分析软件定量早期和晚期凋亡细胞群体。随后计算各组间凋亡细胞的比例。每个实验独立重复三次。
8. 蛋白质印迹分析
Western blot 实验按照先前报道的方案进行18。细胞首先用胰蛋白酶消化，收集后在冰上使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液进行裂解。定量蛋白质浓度后，取等量蛋白质在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，随后转移至聚偏二氟乙烯膜上。膜封闭后，样品在指定稀释比例下与以下一抗孵育：NF-κB（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、Bax（1:1000）、caspase-3（1:1000）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1:2000），随后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。使用化学发光系统检测蛋白信号，并用 ImageJ 软件进行定量。以 GAPDH 作为内参对照，蛋白表达水平以相对于对照组的倍数变化表示。
9. 统计分析
数据以均值 ± 标准差（SD）表示。组间比较采用Mann–Whitney U检验19进行统计分析。当p值<0.05时，认为差异具有统计学意义。
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铁过载小鼠模型的评估及胰腺组织中母源性表达基因3表达水平的检测
为了研究 MEG3 在体内的作用，我们通过腹腔注射右旋糖酐铁在小鼠中建立了铁过载模型。与对照组相比，模型组小鼠的血清铁水平显著升高（p<0.05）（图 1A）。组织学检查显示，苏木精-伊红染色和普鲁士蓝染色均表明胰腺组织中存在明显的铁沉积。此外，透射电子显微镜观察到胰腺腺泡细胞出现结构损伤，包括线粒体肿胀，提示模型构建成功并存在胰腺损伤（图 1B）。
我们采用RT-PCR检测铁过载小鼠胰腺组织中MEG3的表达水平，发现其表达较对照组小鼠显著下调（图2A）。这提示MEG3可能参与了铁过载的β-地中海贫血患者胰岛功能障碍的发生或发展过程。
通过敲低母源性表达基因3抑制胰岛β细胞增殖...
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异常葡萄糖代谢是β-地中海贫血（β-TM）患者中常见且严重的并发症，常表现为糖耐量受损（IGT）或糖尿病（DM）。本研究发现，铁过载导致胰腺损伤，并显著降低胰腺组织中长链非编码RNA MEG3的表达，同时伴随胰岛β细胞凋亡增加。此外，在MIN6细胞中敲低MEG3可促进β细胞凋亡，并与NF-ĸB通路的激活相关，提示MEG3与铁过载诱导的β细胞功能障碍之间存在潜在的分子机制联系。这些结果表明，在铁过载条件下，MEG3可能在胰腺β细胞中发挥保护作用，并参与β-TM中异常葡萄糖代谢的发病机制。β-TM中的葡萄糖代谢紊乱在机制上不同于经典的1型或2型糖尿病20。在β-TM中，主要致病因素是铁在胰腺中的沉积，导致胰岛细胞损伤和胰岛素分泌不足21,22。既往研究已证实，胰腺铁过载是导致β细胞功能障碍和β-TM患者异常葡萄糖代谢的主要因素。然而，其分子调控机制尚未完全阐明。
最近的研究进展表明，长链非编码RNA（lncRNA）在包括β...
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作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金海南省联合基金（822QN445）和海南省教育厅基金（Hnky2024-30）资助。
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