本研究探讨了JNK1/2信号通路在乌头碱诱导的大鼠心肌损伤中的潜在作用。JNK1/2磷酸化水平升高与心肌损伤相关，而药理学抑制JNK通路可部分缓解心肌损伤，提示JNK信号通路可能参与了乌头碱诱导的心脏毒性。
本文内容
摘要
摘要
急性乌头碱（Acon）中毒可导致心律失常和心肌损伤，但其潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨急性Acon中毒诱导心肌损伤的机制。通过经口灌胃建立急性Acon中毒的大鼠模型（n = 51），采用心电图记录心脏节律的变化。通过苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色评估心肌病理损伤及胶原沉积情况。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测静脉血中心脏酶和蛋白的表达水平。通过分子对接技术研究Acon与JNK通路之间的构效关系。采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测磷酸化c-Jun氨基末端激酶1/2（JNK1/2）蛋白的表达水平。本研究中，大鼠经口灌胃给予Acon后出现室性心律失常。心肌组织显示心肌纤维和细胞排列紊乱，并伴有异常的胶原沉积。分子对接结果表明Acon与JNK1/2之间可能存在相互作用。同时，心脏酶、蛋白以及磷酸化JNK1/2的表达水平均显著升高。进一步研究表明，使用JNK抑制剂SP600125处理可在一定程度上逆转Acon诱导的大鼠心肌损伤。这些结果表明，JNK1/2的磷酸化参与了急性乌头碱中毒所致心肌损伤的发生发展。研究结果提示，JNK1/2信号通路的激活在乌头碱诱导的心肌损伤中起重要作用，而抑制JNK1/2通路可能缓解急性乌头碱中毒引起的心肌损伤。
引言
Acon 是从毛茛科乌头属植物中提取的一种天然二萜生物碱。它具有抗炎1，2、镇痛、抗肿瘤、抗风湿、调节免疫代谢以及促进血液循环等作用3，4，5。然而，含 Acon 制剂的不当或过量使用可导致严重的中毒事件。乌头碱中毒引起的症状包括心脏症状6、神经系统症状7和胃肠道症状8。近年来，全球范围内频繁报道乌头中毒甚至死亡的病例9，10，11。Acon 中毒主要表现为心血管系统、神经系统和消化系统的损害。其中，中毒致死的主要原因是心脏毒性。Acon 所致的心脏损伤极为严重，尤其是该综合征起病迅速，使得临床治疗难以及时实施。通常，急性 Acon 中毒会在数小时内出现恶心、腹泻、头晕、胸痛、呼吸困难等首发症状8。目前，急性 Acon 中毒引起心肌损伤的具体机制尚不明确，临床上也尚无能够有效缓解 Acon 中毒所致心肌损伤的有效药物12，13。
急性乌头碱中毒引起的心肌损伤可能有助于探索心肌损伤的机制，从而为基于时间依赖性的研究提供重要手段。此类模型可能为未来治疗急性乌头碱中毒患者提供潜力，并可能早期预防综合征的发生。已有研究推测c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在机体对毒素免疫反应中的作用。JNK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路之一。JNK家族包含三个基因（JNK1/MAPK8、JNK2/MAPK9和JNK3/MAPK10）。JNK1和JNK2可在包括心脏在内的大多数组织中表达，而JNK3主要存在于脑组织中14，且主要与细胞的氧化应激和炎症反应相关15。研究表明，JNK介导的信号通路在脑和心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要作用16,17。给予C66可通过抑制小鼠心脏中JNK的活化，缓解高脂饮食诱导的心肌炎症18。绿原酸通过抑制JNK信号通路，缓解TNF-α诱导的心肌细胞损伤19。松属素通过抑制p38/JNK MAPK信号通路，减轻脂多糖（LPS）引起的心肌损伤和炎症反应，并改善心脏功能障碍和心律失常20。这些研究提示，JNK信号通路（主要是JNK1/2）的变化与心肌损伤密切相关。同时，JNK也是乌头碱引发一系列生物学活动的下游靶点。一项研究发现，高剂量乌头碱暴露可介导JNK酶的激活通路，导致斑马鱼胚胎（幼体）出现发育毒性，如体长缩短、体形弯曲以及脑发育缺陷21。该研究提示乌头碱可能激活JNK信号通路。然而，JNK信号通路在急性乌头碱中毒所致心肌损伤中的作用尚不明确。
本研究通过设置不同的经口灌胃剂量和时间间隔，建立了急性乌头碱中毒致心肌损伤的大鼠模型。此外，探讨了在该模型中乌头碱对心肌组织JNK1/2磷酸化水平及JNK信号通路激活的影响。探索JNK1/2磷酸化在急性乌头碱中毒诱导的大鼠心肌损伤中的作用，为研究急性乌头碱中毒所致心肌损伤机制提供了理论依据。
方案
实验设计和实施方案已获得昆明医科大学动物实验委员会的批准（批准号：Kmmu20220652），批准时间为2022年6月。所有实验均按照《昆明医科大学动物实验指南》进行。本研究中使用的所有材料清单见材料表。
警告：由于乌头碱（Acon）具有高毒性，所有配制和给药操作均须按照机构实验室安全规定进行。操作乌头碱的人员需穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和口罩；涉及乌头碱配制的操作均需采取适当防护措施，以最大限度降低暴露风险。动物在给予乌头碱期间及之后需密切监测是否出现严重毒性反应和痛苦迹象，必要时实施人道终点以减少痛苦。生物废弃物及被乌头碱污染的材料须按照机构生物安全规定进行处置。
动物处理
成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（2月龄，230 g）饲养于昆明医科大学实验动物中心SPF级动物实验楼。所有SD大鼠的饲养条件均按照SPF级大鼠的饲养要求进行。实验前适应性饲养1周，并禁食12小时。将Acon溶于0.05 M醋酸盐缓冲液（Acet）中，根据随机对照原则将SD大鼠分为4组：第1组（Acon-1 mg）以1 mg/kg剂量经灌胃给予Acon；第2组（Acon-2 mg）以2 mg/kg剂量经胃内给予Acon；第3组（Acet）经胃内给予2 mL 0.05 M醋酸盐缓冲液；第4组（对照组，不进行任何处理）。在胃内给药后1、3和6小时采集样本。共研究36只大鼠，每组在1 h、3 h和6 h时间点各3只。在每个指定时间点，首先进行心电图（ECG）记录。随后将大鼠麻醉并采集血液样本用于血清生化分析。采血后处死大鼠，迅速取出心脏组织。部分心肌组织固定后用于组织学分析（HE染色和Masson染色），其余组织保存用于Western blot检测蛋白表达水平。在测试JNK1/2激活剂和抑制剂的实验中，SD大鼠将根据随机对照原则分为5组：模型组经胃内给予2 mg/kg Acon；抑制剂组先腹腔注射6 mg/kg SP60012522，2小时后经灌胃给予2 mg/kg Acon；激动剂组先腹腔注射0.1 mg/kg Anisomycin（Anis）23,24，2小时后经灌胃给予2 mg/kg Acon；DMSO组腹腔注射2 mL含0.8% DMSO的共溶剂混合溶液；对照组不进行任何处理。共研究15只大鼠。所有染色结果均采用盲法分析，以尽量减少观察偏倚。实验期间持续监测大鼠的存活状态及乌头碱给药后是否出现严重毒性反应。在每个预定观察时间点（1 h、3 h和6 h）记录死亡情况。死亡定义为呼吸和心跳完全停止。若动物出现严重痛苦表现，包括持续性呼吸困难、翻正反射丧失、无法行走或濒死状态，则视为达到人道终点，立即在深度麻醉下实施安乐死以减轻痛苦。各组大鼠的死亡数量见（表1–4）。
大鼠心电图（ECG）记录
每组大鼠均进行心电图描记。具体方法如下：以30 mg/kg剂量的戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位固定于动物实验台。计算机连接BL-420N生物信号采集与分析系统，并将心电图导联线插头插入BL-420N系统的三通道输入端口。将针状电极分别皮下插入大鼠右前肢内侧、右后肢和左后肢。操作前针状电极需在75%酒精中浸泡消毒，注意避免刺入肌肉组织。随后将心电图导联线电极夹连接至各肢体的针状电极。打开BL-420N生物信号采集与分析系统的电源开关并启动系统软件。选择第3通道进行信号采集，信号类型设置为大鼠心电图。参数设置如下：采样率1 kHz，量程2.0 mV，时间常数（高通滤波）200 ms（0.80 Hz），低通滤波100 Hz，扫描速度200.0 ms/div，关闭50 Hz陷波滤波器。记录II导联心电图，观察心电图变化。待心电图稳定后，持续监测并记录3分钟，数据按组保存以供后续分析。心电图记录完成后，移除电极夹和针状电极，将大鼠放回笼中。注意保温，并持续监测其呼吸，直至完全从麻醉中恢复，以防窒息死亡。在给药前第1天进行基础心电图记录。第2天，大鼠经口灌胃给予Acon，随后在给药后1 h、3 h和6 h按照相同方法进行心电图记录。
苏木精-伊红（HE）染色与马松染色
将心脏在水平短轴平面切开，收集SD大鼠心尖部位的心肌组织，并在室温下用4%多聚甲醛固定24小时。固定后的组织经脱水、二甲苯透明处理后，进行石蜡包埋。随后按照标准流程制备4 µm厚的切片，并进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色。HE染色过程中，先用苏木精染色2分钟，随后将样本置于温水中浸泡1分钟，再用伊红染色30秒。Masson染色过程中，先用Weigert铁苏木精溶液染色5分钟，再用Masson蓝溶液染色3–5分钟，最后用苯胺蓝溶液染色1–2分钟。染色切片在普通光学显微镜下观察。每张切片在相同放大倍数下随机选取五个无重叠的显微视野，避开较大的血管和明显的人工假象。胶原容积分数（CVF）使用ImageJ软件，根据公式（1）计算：
(1)
酶联免疫吸附测定（ELISA）
记录心电图后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后行正中开腹术以采集静脉血。使用一次性静脉采血针穿刺下腔静脉采集血样。血液在4 °C下孵育过夜，然后在1000 × g 条件下离心20分钟，收集上清液。采用ELISA试剂盒测定CK-MB、AST、LDH、cTn-1和h-FABP的浓度。ELISA操作按照试剂盒说明书进行。使用酶标仪在450 nm处测定各孔的光密度（OD）值。
Western印迹分析
使用蛋白提取试剂盒从心肌组织中提取总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。取10 µL待测蛋白样品，通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜，并用5%脱脂奶粉封闭30分钟。随后，将膜与JNK1/2（1:500）、p-JNK1/2（1:1000）和GAPDH（1:4000）一抗在4℃孵育过夜。次日，所有膜用PBST洗涤3次，再与相应的二抗（1:5000）室温孵育1小时。最后，使用增强型化学发光试剂进行信号检测：将显色液均匀滴加于PVDF膜条上，孵育10秒后进行曝光、显影和成像。采用ImageJ软件对Western blot条带灰度值进行定量分析。
分子对接验证
乌头碱的SDF三维分子结构从PubChem数据库下载，并使用OpenBabel软件将SDF结构转换为mol2格式。从UniProt和蛋白质数据库（Protein Data Bank）下载了JNK1和JNK2的最高分辨率和最长的PDB蛋白结构。对大分子蛋白进行了加氢、配体移除和完全加氢处理，对小分子化合物进行了完全加氢和电子加载处理，并设定了扭转键。通过AutoDock Vina进行分子对接实验，定义结合亲和力≤ -7.0 kcal/mol为强配体-蛋白相互作用。使用PyMol可视化对接复合物的三维结构，使用Discovery Studio可视化对接复合物的二维结构。
统计分析
所有实验均独立重复三次。使用 GraphPad Prism 8 对所有数据进行统计分析并绘图。数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。两组之间的比较采用 Student t 检验。同一时间点多个组之间的比较或同一组内的时间序列分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。p< 0.05 被认为具有统计学显著性25。
结果
大鼠经口灌胃 Acon 后的 ECG 结果
既往研究表明，乌头碱的毒性作用发生在早期，通常在给药后数小时内出现26,27。因此，为了捕捉在此时间窗口内急性心脏毒性的早期发生和发展过程，我们选择了三个时间点：1 h、3 h 和 6 h 进行实验。心电图结果显示，在乌头碱作用 1 h、3 h 和 6 h 后，对照组和 Acet 组未出现心律失常，心电图变化不明显。Acon-1mg 组大鼠出现室性早搏、成对室性早搏、室性三联律、短阵室性心动过速、单形性室性心动过速、双向性室性心动过速中的一种或多种室性心律失常。Acon-2 mg 组大鼠出现室性早搏以及一种或多种室性心律失常，包括成对室性早搏、短阵室性心动过速和双向性室性心动过速（图 1，补充图 1–2）。乌头碱可促进心肌病理损伤，并增加大鼠心肌组织中的胶原染色。
采用HE染色法对心肌组织进行评估。结果显示，与对照组和Acet组相比，Acon处理1 h、3 h和6 h后，Acon-1 mg组SD大鼠心肌组织出现部分心肌纤维断裂，心肌细胞排列紊乱，心肌间质增宽，心肌间质发生水肿，多数心肌细胞肿胀，细胞核深染且固缩，大量心肌细胞发生变性，心肌纤维胞质内可见圆形空泡（箭头所示）。Acon-2 mg组SD大鼠心肌组织中心肌纤维横纹模糊或消失；肌束排列疏松且紊乱，肌纤维间隙增宽，大量细胞核深染，出现核固缩，细胞间水肿，心肌细胞肿胀并变性。心肌纤维胞质内可见圆形空泡（箭头所示）（图2A，补充图3A，补充图4A）。
采用Masson染色法评估心肌组织中的胶原沉积。在对照组和Acet组中，心肌细胞呈现正常形态，心肌间质中仅观察到极少的胶原沉积。在Acon-1 mg组中，部分间质区域可见轻度增加的蓝色染色胶原。在Acon-2 mg组中，蓝色染色区域更为广泛，弥漫分布于整个心肌组织，同时伴有肌原纤维排列紊乱及正常心肌结构的破坏。Acon-2 mg组的胶原染色程度高于Acon-1 mg组。定量分析显示，与对照组和Acet组相比，Acon-1 mg组和Acon-2 mg组的胶原容积分数（CVF）均显著升高（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。值得注意的是，在灌胃给药后6 h，Acon-2 mg组的CVF值达到最高水平（图2B，补充 图3B，补充 图4B）。考虑到较短的观察期（1–6 h），这些结果更可能反映的是急性间质性改变，例如水肿或胶原染色模式的变化，而非已形成的典型心肌纤维化。此外，在给予Acon-1 mg或Acon-2 mg处理后1 h、3 h和6 h，各组之间的心脏重量无显著差异（表5）。
Acon 可促进大鼠静脉血中心脏酶和心脏蛋白水平
为评估乌头碱（Acon）诱导的心肌损伤，我们检测了血清中心肌损伤标志物的水平，包括CK-MB、AST、LDH、cTn-I和h-FABP。与对照组（Control）和醋酸（Acet）组相比，Acon-1 mg组和Acon-2 mg组在给药后1 h、3 h和6 h时CK-MB、AST、LDH、cTn-I及h-FABP水平均显著升高（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。此外，在相同时间点，Acon-2 mg组上述标志物的升高幅度较Acon-1 mg组更为显著（p < 0.05）（图3）。
分子对接结果
为了进一步研究乌头碱（Acon）对大鼠心肌损伤信号通路的影响，我们采用分子对接方法鉴定与乌头碱相关的通路蛋白。对接结果显示，乌头碱可通过多种非共价相互作用稳定结合于JNK1和JNK2的活性口袋中。在JNK1中，乌头碱与ALA267和SER299形成了两个常规氢键，键长分别为2.0 Å和2.1 Å，表明存在较强的定向相互作用，有助于配体的锚定。此外，乌头碱与周围残基之间存在广泛的范德华相互作用，促进了结合口袋内的空间互补性。疏水相互作用（包括与ILE304的烷基/π-烷基相互作用）进一步稳定了配体在疏水微环境中的构象。还检测到碳-氢键，形成协同作用网络，支持配体的结合（图4A–C）。在JNK2中，乌头碱与LEU302形成一个常规氢键（2.1 Å），作为关键的锚定作用。与JNK1类似，范德华相互作用、疏水相互作用和碳-氢键共同促进了配体-蛋白复合物的稳定性（图4D–F）。测试化合物的对接结果以结合能得分（kcal/mol）表示，并列于表6中。总体而言，氢键提供了特异性和锚定作用，疏水相互作用增强了配体的嵌入性和结合亲和力，范德华相互作用则有助于整个复合物的稳定性。这些结果表明，乌头碱能够与JNK1和JNK2形成稳定的复合物，支持其作为靶向剂的潜力。
Acon 上调 JNK 磷酸化水平
为了进一步研究乌头碱（Acon）对心肌组织中JNK信号通路的影响，通过Western blotting检测了JNK1/2磷酸化的表达水平。与对照组（Control）和醋酸组（Acet）相比，乌头碱-1 mg组和乌头碱-2 mg组的p-JNK1/2水平显著升高（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。此外，乌头碱-2 mg组的JNK1/2磷酸化水平显著高于乌头碱-1 mg组（p < 0.05）（图5A）。在乌头碱-2 mg组内，不同时间点之间的比较显示，p-JNK1/2水平在1 h、3 h和6 h均显著升高，其中6 h时达到最高水平（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）（图5B）。根据这些结果，后续实验选择乌头碱-2 mg组在6 h的时间点进行。
JNK抑制剂可缓解大鼠心肌组织的心肌病理损伤和胶原染色
为进一步评估JNK信号通路的调控作用，通过Western blot检测心肌组织中p-JNK1和p-JNK2的表达水平。与对照组和DMSO组相比，Acon组中p-JNK1和p-JNK2的表达水平显著升高（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。与Acon组相比，Acon+SP600125组中p-JNK1和p-JNK2的表达水平显著降低（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。相反，与Acon+SP600125组相比，Acon + Anis组中p-JNK1和p-JNK2的表达水平显著升高（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）（图6）。
进一步研究了Anis和SP600125对心肌损伤的影响。HE染色结果显示，与Acon组相比，Acon+SP600125组心肌组织间质水肿减轻，部分心肌细胞肿胀消失，胞质均匀；肌间隙充盈，肌束间隙变窄，部分心肌纤维排列紧密且有序，少数细胞核染色加深，心肌纤维胞质中可见少量圆形小空泡，心肌病理损伤得到缓解。与Acon+SP600125组相比，Acon + Anis组出现心肌纤维断裂、肌间隙增宽、心肌纤维排列松散且紊乱、心肌细胞肿胀变性、核染色质深染以及细胞间水肿（图7A）。
采用Masson染色法评估心肌组织中的胶原染色情况。在Acon+SP600125组中，心肌间质可见中等程度的蓝色染色区域。与Acon组相比，Acon+SP600125组的胶原容积分数（CVF）显著降低，提示SP600125可减轻乌头碱诱导的间质改变。相反，在Acon + Anis组中，心肌间质中蓝色染色的胶原区域较Acon+SP600125组更为广泛，并伴有CVF的显著升高（每组n = 3只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）（图7B）。此外，各组之间心脏重量差异无统计学意义（表5）。考虑到较短的观察期（1–6小时），这些变化更可能反映的是急性间质性改变，例如水肿或胶原染色模式的变化，而非已形成的心肌纤维化。这些结果表明，在本实验条件下，SP600125可缓解乌头碱引起的心肌损伤，而茴香霉素则进一步加重了心肌损害。
JNK 抑制剂可缓解大鼠血清中心脏酶和心脏蛋白的表达
ELISA 结果显示，与 Acon 组相比，Acon + SP600125 组中 CK-MB、AST 和 LDH 的表达显著降低，而 Anis 作用后，CK-MB、AST 和 LDH 的表达升高（每组 n = 3 只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。此外，与 Acon 组相比，Acon + SP600125 组中 cTn-I 和 h-FABP 的表达显著降低（每组 n = 3 只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）。与 Acon + SP600125 组相比，Acon + Anis 组中 cTn-I 和 h-FABP 的表达显著升高（每组 n = 3 只大鼠，单因素方差分析， p < 0.05）（图 8A–8B）。
数据可用性：
本研究中使用的所有原始数据均可在随附于论文的补充文件中获取。
图1：大鼠心律失常的心电图表现（乌头碱作用6小时后）。从上至下依次为对照组、Acet组、Acon-1 mg组和Acon-2 mg组。Acon-1mg-A-gavage和Acon-2 mg-A-gavage中的心律失常类型（按心律失常发生顺序从上至下排列）：Acon-1mg-A-gavage：室性早搏；室性二联律；双向性室性心动过速。Acon-2 mg-A-gavage：室性早搏；室性二联律；短暂性室性心动过速爆发。 缩写：B-gavage = 乌头碱灌胃前；A-gavage = 乌头碱灌胃后。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：通过HE染色和Masson染色显示的大鼠心肌组织中的心肌损伤与胶原染色情况。 （A）通过HE染色检测大鼠心肌组织的病理变化（黄色箭头指示受损心肌细胞形成的圆形空泡）；比例尺 = 100 µm。（B）通过Masson染色检测大鼠心肌组织中的胶原沉积；比例尺 = 50 µm。数据以均值 ± 标准差表示，n = 3。所有 P-值均采用独立单因素方差分析计算。*p < 0.05，**p < 0.01。放大倍数分别为40倍和400倍。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：大鼠血清中 CK-MB、AST、LDH、cTn-I 和 h-FABP 的水平反映心肌损伤情况。（A–F）使用 ELISA 试剂盒检测 CK-MB、AST、LDH、cTn-I 和 h-FABP 的水平。数据以均值±标准差表示，n = 3。所有 p 值均通过独立单因素方差分析计算得出。*p < 0.05，**p < 0.01。缩写：CK-MB = 肌酸激酶同工酶 MB；AST = 天冬氨酸氨基转移酶；LDH = 乳酸脱氢酶；cTn-I = 心肌肌钙蛋白 I；h-FABP = 心型脂肪酸结合蛋白。 请点击此处查看该图的高清版本。
图4：Acon与JNK通路分子对接结果。（A–B）和（D–E）为Acon与JNK1/2蛋白的二维相互作用图解。（C）和（F）为Acon与JNK1/2蛋白的三维相互作用图解。缩写：JNK = c-Jun N-末端激酶。请点击此处查看此图的放大版本。
图5Acon 上调 JNK 磷酸化水平。 (A–B) 表达水平 大鼠心肌组织中 p-JNK1/2 和 JNK1/2 的表达水平通过 Western blotting 检测。数据以均值 ± 标准差表示，n = 3。所有 p采用单因素独立方差分析计算 *P* 值。p < 0.05, *p < 0.01. 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：JNK抑制剂抑制Acon诱导的JNK磷酸化。通过Western印迹法检测大鼠心肌组织中p-JNK1/2和JNK1/2的表达水平。数据以均值±标准差表示，n = 3。所有p值均采用单因素方差分析进行计算。*p < 0.05，**p < 0.01。请点击此处查看该图的高清版本。
图7：JNK抑制剂可减轻大鼠心肌病理损伤和胶原染色。（A）通过HE染色检测大鼠心肌组织的病理变化（黄色箭头显示受损心肌细胞形成的圆形空泡）；比例尺 = 100 µm。（B）通过Masson染色检测大鼠心肌组织中的胶原沉积；比例尺 = 50 µm。数据以均值±标准差表示，n = 3。所有p值均采用单因素方差分析计算。*p < 0.05，**p < 0.01。放大倍数分别为40倍和400倍。请点击此处查看该图的高清版本。
图8：JNK抑制剂下调大鼠血清中CK-MB、AST、LDH、cTn-I和h-FABP的水平。（A–B）采用ELISA试剂盒检测CK-MB、AST、LDH、cTn-I和h-FABP的表达水平。所有p值均通过独立的单因素方差分析计算得出。数据以均值±标准差表示，n = 3。*p < 0.05，**p < 0.01。缩写：CK-MB = 肌酸激酶同工酶MB；AST = 天冬氨酸氨基转移酶；LDH = 乳酸脱氢酶；cTn-I = 心肌肌钙蛋白I；h-FABP = 心型脂肪酸结合蛋白。请点击此处查看该图的高清版本。
| 对照 | 乙酸盐 | 顺乌头酸酶-1 mg | 顺乌头酸酶-2 mg | |
| 大鼠数量 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| 大鼠死亡数量 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表1：乌头碱作用1小时后大鼠死亡数量。给予乌头碱1小时后，对照组、醋酸组、乌头碱-1 mg组和乌头碱-2 mg组均无大鼠死亡。（每组最终纳入分析的动物数量为3只，死亡大鼠未予替换）。
| 对照 | 乙酸组 | 顺乌头酸酶抑制剂-1 mg | 顺乌头酸酶抑制剂-2 mg | |
| 大鼠数量 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| 大鼠死亡数量 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表2：乌头作用3小时后大鼠死亡数量。 给予乌头后3小时，对照组、醋酸组、乌头-1 mg组和乌头-2 mg组均无大鼠死亡。（每组最终纳入分析的动物数量为3只，死亡大鼠未被替换）。
| 对照 | 乙酸组 | 顺乌头酸-1 mg | 顺乌头酸-2 mg | |
| 大鼠数量 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| 大鼠死亡数量 | 0 | 0 | 4 | 4 |
表3：乌头作用6小时后大鼠死亡数量。 给予乌头后6小时，乌头-1 mg组9只大鼠中有4只死亡，乌头-2 mg组9只大鼠中也有4只死亡。（每组最终纳入分析的动物数量为3只，死亡大鼠未被替换）。
| 对照 | DMSO | Acon | Acon + SP600125 | Acon + Anis | |
| 大鼠数量 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| 大鼠死亡数量 | 0 | 0 | 3 | 1 | 3 |
表4：Anis和SP600125作用后大鼠死亡数量。 不同处理组间大鼠死亡数量存在差异：Acon-2 mg组中，9只大鼠中有3只死亡；Acon+SP600125组中，9只大鼠中有1只死亡；Acon + Anis组中，9只大鼠中有3只死亡。（每组最终纳入分析的动物数量为3只，死亡大鼠未予替换）。
| 组别 | 心脏重量 (g) |
| 对照组 | 0.71 ± 0.03 |
| Acet | 0.73 ± 0.02 |
| Acon-1mg (1 h) | 0.73 ± 0.06 |
| Acon-2mg (1 h) | 0.75 ± 0.02 |
| Acon-1mg (3 h) | 0.71 ± 0.04 |
| Acon-2mg (3 h) | 0.77 ± 0.03 |
| Acon-1mg (6 h) | 0.72 ± 0.03 |
| Acon-2mg (6 h) | 0.77 ± 0.02 |
| DMSO | 0.70 ± 0.03 |
| Acon + SP600125 | 0.74 ± 0.03 |
| Acon + Anis | 0.75 ± 0.04 |
表5：大鼠的心脏重量。 各组之间的心脏重量无显著差异。
| 配体 | JNK1 | JNK2 |
| Acon | -7.8 Kcal/mol | -8.41 Kcal/mol |
表6：分子对接研究结果。Acon与JNK1之间的对接得分为-7.8 kcal/mol，Acon与JNK2之间的对接得分为-8.41 kcal/mol。
补充图1：乌头碱作用1小时后大鼠心律失常的心电图示意图。 从上到下依次为对照组、乙酸组、乌头碱-1 mg组和乌头碱-2 mg组。乌头碱-1 mg-A-灌胃组与乌头碱-2 mg-A-灌胃组中的心律失常类型（按心律失常发生顺序从上到下排列）：室性早搏；室性早搏二联律；室性早搏三联律；短暂性室性心动过速；单形性室性心动过速；双向性室性心动过速。乌头碱-2 mg-A-灌胃组：双向性室性心动过速。缩写：B-灌胃 = 乌头碱灌胃前；A-灌胃 = 乌头碱灌胃后。 请点击此处下载该文件。
补充图2：乌头碱作用3小时后大鼠心律失常的心电图示例。 从上至下分别为对照组、乙酸组、乌头碱1 mg组和乌头碱2 mg组。乌头碱1 mg-A-灌胃组与乌头碱2 mg-A-灌胃组中出现的心律失常类型（按自上而下心律失常发生顺序）：室性早搏；短暂性室性心动过速；双向性室性心动过速。乌头碱2 mg-A-灌胃组：室性早搏；双向性室性心动过速。 缩写：B-灌胃 = 乌头碱灌胃前；A-灌胃 = 乌头碱灌胃后。 请点击此处下载该文件。
补充图3：Acon在作用1小时后促进心肌损伤和胶原染色。（A）通过HE染色检测大鼠心肌组织的病理变化（注：黄色箭头指示受损心肌细胞形成的圆形空泡）；比例尺 = 100 µm。（B）通过Masson染色检测大鼠心肌组织中的纤维化；比例尺 = 50 µm。数据以均值 ± 标准差表示，n = 3。所有p值均采用独立单因素方差分析计算。*p < 0.05，**p < 0.01，放大倍数分别为40倍和400倍。请点击此处下载该文件。
补充图4：Acon在作用3小时后促进心肌损伤和胶原染色。 （A）通过HE染色检测大鼠心肌组织的病理变化（黄色箭头显示受损心肌细胞形成的圆形空泡）；比例尺 = 100 µm。（B）通过Masson染色检测大鼠心肌组织中的胶原沉积；比例尺 = 50 µm。数据以均值 ± 标准差表示，n = 3。所有p值均采用单因素方差分析进行计算。*p < 0.05，**p < 0.01。放大倍数分别为40倍和400倍。请点击此处下载该文件。
讨论
乌头碱可诱发心律失常和心肌损伤；然而，乌头碱诱导心肌损伤的潜在机制尚不明确。本研究成功建立了急性乌头碱中毒伴心肌损伤的大鼠模型。结果表明，JNK信号通路的激活可能是急性乌头碱中毒所致心肌损伤的关键下游机制。具体而言，在乌头碱诱导心律失常及心肌损伤的大鼠中，JNK1/2的磷酸化水平显著升高。此外，抑制JNK通路可部分逆转急性乌头碱中毒引起的心肌损伤。这些发现提示，JNK通路的激活在乌头碱诱导的心肌损伤发病机制中发挥着重要作用。
急性乌头碱中毒致死的主要原因是心脏毒性。既往研究表明，大鼠经乌头碱处理后，心肌纤维出现变性、排列紊乱，细胞核染色加深，伴有中性粒细胞浸润，并出现圆形空泡28。本研究结果与此一致。HE染色显示，乌头碱处理组的心肌组织出现病理性改变，包括肌束排列紊乱、肌间隙增宽以及肌纤维断裂。此外，在正常情况下，血清中心肌酶CK-MB、AST、LDH及心肌蛋白cTn-I和h-FABP含量极低29。当心肌细胞受损时，这些标志物会大量释放入血30,31,32,33。
本研究结果显示，经灌胃给予Acon后，各观察时间点大鼠静脉血清中的CK-MB、AST、LDH、cTn-I和h-FABP均不同程度升高，其中在灌胃给药后6 h表达水平最高。该发现与既往研究结果一致34，上述研究发现Acon可导致大鼠H9C2心肌细胞损伤，并使AST水平升高。同时，已有研究利用Acon诱导大鼠心肌损伤，以探讨解毒剂对心肌损伤的影响35，发现心肌损伤大鼠血清中LDH和CK-MB水平均显著升高。综上所述，通过联合检测心肌损伤标志物的实验结果表明，采用1–2 mg/kg剂量的Acon灌胃后1、3和6 h，可成功建立急性Acon中毒诱导的大鼠心肌损伤模型，其中以2 mg/kg剂量灌胃6 h的造模效果最佳，符合后续实验的要求。
研究发现，乌头碱（Acon）对Na+和Ca2+离子通道的作用可导致细胞内钙离子浓度升高，进而激活P38-MAPK信号通路，并随后触发JNK级联反应36,37,38。JNK的激活会促进心肌损伤39,40。这一结果与本实验的发现一致。在本研究中，我们发现乌头碱（Acon）可促进心肌细胞中JNK1/2的磷酸化，并激活JNK信号通路。这表明JNK的激活可能是介导乌头碱诱导心肌损伤的下游信号响应之一。然而，乌头碱（Acon）促进JNK1/2磷酸化的分子机制及药代动力学机制仍需进一步研究。
研究表明，当大量 JNK1/2 被磷酸化时，JNK 信号通路被激活，进而介导心肌细胞核内基因的失控性表达，并破坏细胞周期。抑制 JNK 信号通路可减轻心肌损伤41,42。在 HE 染色结果中，JNK 通路抑制剂 SP600125 可显著减轻乌头碱（Acon）诱导的心肌组织病理学改变。同时，既往研究证实，在冠状动脉结扎诱导的急性心肌梗死大鼠模型中，心肌组织中蓝色染色的胶原纤维及胶原沉积明显增加，并伴有 JNK 信号通路的激活。使用中药颗粒治疗可通过抑制 JNK 信号通路减少心肌胶原沉积43,44。
在糖尿病心肌损伤大鼠中，胶原纤维含量（蓝色染色）和胶原容积分数（CVF）显著升高。同时，JNK信号通路被激活。已有报道表明，低剂量乙醇可抑制JNK通路的激活，从而减轻大鼠心肌组织中胶原纤维沉积和CVF的增加45。在本研究中，分子对接分析表明，乌头碱可能通过多种非共价相互作用与JNK1和JNK2结合；然而，这些结果仅可作为支持性证据，并不能构成生理条件下直接结合的证明。此外，体内实验表明，乌头碱作为一种应激刺激物，可上调JNK1/2的磷酸化水平，从而激活JNK信号通路。该激活过程伴随着大鼠心肌组织中胶原沉积（蓝色染色）增加和CVF升高，最终导致心肌损伤。然而，加入JNK抑制剂SP600125后，显著抑制了乌头碱的毒性作用，降低了心肌组织CVF值的升高。心肌损伤会破坏正常心肌细胞膜的完整性，导致细胞内物质释放至细胞外空间，表现为血液中心肌酶水平升高46,47。这些结果表明，大鼠血液中心肌酶水平的升高也提示乌头碱引起了心肌损伤。同时，JNK抑制剂抑制了心肌酶的释放，提示JNK抑制剂可在一定程度上缓解乌头碱所致的心肌损伤。
本研究存在若干局限性，需予以说明。首先，各时间点的样本量相对较小（每组 n = 3），可能限制了分析的统计学效能，且在确定样本量之前未进行正式的效能分析。此外，仅评估了单一的乌头碱剂量范围和相对较短的观察期（1–6 h），这限制了对长期病理变化及剂量-效应关系的评估。其次，尽管JNK1/2磷酸化水平升高以及药理学干预结果提示JNK信号通路参与了乌头碱诱导的心肌损伤，但乌头碱暴露与JNK激活之间的上游机制尚未得到充分研究。已知乌头碱主要影响电压门控Na⁺通道和细胞内Ca2⁺稳态，这可能促进下游JNK的激活。然而，本研究未直接检测相关的信号事件，包括氧化应激和钙超载通路。第三，分子对接分析仅提供了乌头碱与JNK1/2之间潜在相互作用的支持性证据，并不代表直接的生理结合。未进行表面等离子共振或pull-down实验等额外的实验验证。此外，本研究仅考察了JNK1/2，而JNK3在乌头碱诱导的心脏毒性中的潜在作用仍不明确。最后，在SP600125或茴香脑干预后未进行心电图评估。因此，JNK通路的调控是否直接影响乌头碱诱导的室性心律失常，仍有待进一步研究。
综上所述，乌头碱可通过增加JNK1/2的磷酸化水平激活JNK信号通路，这可能导致心肌损伤，表现为大鼠心肌组织中胶原沉积增加和心肌酶释放升高。考虑到乌头碱诱导的心脏毒性涉及多种上游事件，包括Na⁺通道激活、Ca2⁺超载和氧化应激，JNK通路的激活可能是导致心肌损伤的关键下游信号事件。
披露
本手稿在同行评审和出版考虑之前，已作为预印本发布在Research Square上。该预印本可通过以下链接获取：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4218950/v148。作者声明不存在竞争利益。
致谢
本工作由国家自然科学基金（82260387）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | HJ203501 | 组织固定 |
| 乌头碱（Acon） | 成都德斯特生物科技有限公司 | drk-0335-960330 | 灌胃模型用毒性化合物 |
| 苯胺蓝溶液 | 北京索莱宝科技有限公司 | G1350 | Masson 染色 |
| 茴香霉素（Anis） | MedChemExpress 有限公司 | 153154 | JNK 通路激活剂/对照 |
| AST ELISA 试剂盒 | 武汉华美生物技术有限公司 | CSB-E13023r | 心肌酶检测 |
| AutoDock Vina | 开源软件 | N/A | 分子对接 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | 未注明 | 蛋白质定量 |
| 离心机 | 东莞市_cnzcn_有限公司 | TD5M-WS | 1000 × g 离心 |
| Chem3D 软件 | PerkinElmer | N/A | 配体能量最小化 |
| CK-MB ELISA 试剂盒 | 武汉华美生物技术有限公司 | CSB-E14403r | 心肌酶检测 |
| cTn-I ELISA 试剂盒 | 武汉华美生物技术有限公司 | CSB-E08594r | 心肌蛋白检测 |
| 一次性静脉采血针 | 肯特医疗器械有限公司 | https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html | 血液采集 |
| 增强型化学发光（ECL）试剂 | Millipore 有限公司 | 21302A4 | Western blot 显影 |
| 伊红 | 北京索莱宝科技有限公司 | 20200905 | H&E 染色 |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | N/A | 统计分析 |
| 苏木精 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | CR2203066 | H&E 染色 |
| h-FABP ELISA 试剂盒 | 武汉华美生物技术有限公司 | CSB-E16184r | 心肌蛋白检测 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | N/A | Western blot 定量分析 |
| JNK1/2 一抗 | 华安生物技术（杭州）有限公司 | ET1609-42 | Western blot 抗体 |
| LDH ELISA 试剂盒 | 上海酶联生物科技有限公司 | ml003416 | 心肌酶检测 |
| Masson 蓝染液 | 北京索莱宝科技有限公司 | 20220303 | Masson 染色 |
| 酶标仪 | 赛默飞世尔科技公司 | ME001000C | ELISA 吸光度测定（450 nm） |
| 光学显微镜（Olympus C33） | Olympus（日本东京） | C33 | 组织学成像 |
| 石蜡 | Leica 有限公司 | 2110068 | 组织包埋 |
| PBST 缓冲液 | 迈伦生物有限公司 | MA0015-Apr-27G2 | 洗涤缓冲液 |
| p-JNK1/2 一抗 | 华安生物技术（杭州）有限公司 | ET1601-28 | 磷酸化 JNK 抗体 |
| 蛋白质数据库（PDB） | RCSB | https://www.rcsb.org/ | 蛋白质结构来源 |
| 蛋白质提取试剂盒 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | C510003-0050 | 组织蛋白提取 |
| PubChem 数据库 | NIH | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov | 配体结构来源 |
| PVDF 膜 | Millipore 有限公司 | R1PB81493 | Western blot 转膜膜 |
| PyMOL | Schrödinger, Inc. | https://pymol.org/ | 对接结果可视化 |
| SDS-PAGE 凝胶（10%） | 北京索莱宝科技有限公司 | 817X031 | 蛋白质电泳 |
| 脱脂奶粉 | 北京索莱宝科技有限公司 | http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/ | 封闭剂（5%） |
| 戊巴比妥钠 | 赛默飞世尔科技公司 | 57-33-0 | 动物实验用麻醉剂 |
| SP600125（JNK 抑制剂） | MedChemExpress 有限公司 | 112518 | JNK 通路抑制剂 |
| SPF 级动物饲养设施 | 昆明医科大学 | N/A | 动物饲养条件 |
| SD 大鼠（雄性，2 月龄，约 230 g） | 北京华阜康生物科技股份有限公司 | http://www.hfkbio.com/ | 实验动物（n = 51） |
| Weigert 铁苏木精 | 广州威佳科技有限公司 | 18092001 | Masson 染色 |
| 二甲苯 | 天津天津市化学试剂销售有限公司 | 20220208 | 组织透明化 |