循环稀有细胞的高效分离与多重鉴定 通过 连续离心式微流控与水凝胶免疫细胞化学

摘要

本研究介绍了一种连续离心式微流控工作流程，用于高效分离和鉴定循环稀有细胞。该系统可实现精确的液体控制并最大限度减少细胞损失，能够同时分析多种循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤相关成纤维细胞（cCAF）等结直肠癌亚型，从而提高诊断准确性。

摘要

循环稀有细胞（CRCs），包括循环肿瘤细胞（CTCs）和循环癌相关成纤维细胞（cCAFs），是癌症诊断与预后评估中具有前景的生物标志物。然而，由于其丰度极低且表型具有高度异质性，高效分离并进行多参数分析在技术上仍具挑战性。本文介绍一种基于连续离心式微流控技术的工作流程，可实现从全血中依次分离并鉴定CRCs。该芯片包含五个相互连接的腔室，并设有可控阀门，可在离心过程中精确操控密度梯度介质与血液层的分布。在先前已验证的富集平台基础上，本工作流程整合了基于水凝胶的细胞固定技术与多重免疫细胞化学染色方法，从而支持对多种CRC亚型（包括CTCs和cCAFs）进行下游鉴定与表征。分离后，细胞被固定于水凝胶基质中，以确保在多次免疫染色及基于成像的分析过程中保持细胞的稳定留存。利用该工作流程，可从同一样本中同时鉴定出CTCs和cCAFs，证明了在单一液体活检工作流程中对多种循环稀有细胞群体进行整合分析的可行性。该平台为液体活检应用中的稀有细胞下游表征提供了一种实用且可重复的技术方案。

引言

循环稀有细胞（CRCs）是指与红细胞、白细胞和血小板等正常血液成分相比，在血液中以极低频率存在的细胞。 这些细胞来源于多种途径，例如生物过程的副产物、组织重塑、伤口愈合或血管损伤。典型的例子包括循环内皮细胞、循环胎儿细胞、巨核细胞、成红血细胞以及各种祖细胞或干细胞^1,2。尽管循环稀有细胞的存在本身并不一定反映病理状态，但其水平升高通常提示存在异常的生理或病理状况^3,4。因此，对循环稀有细胞进行高灵敏度的检测和表征，可为体内发生的动态生理和病理过程提供重要信息。

在结直肠癌（CRC）亚型中，循环肿瘤细胞（CTCs）和循环癌相关成纤维细胞（cCAFs）是癌症的主要生物标志物。CTCs可直接证明肿瘤细胞的播散，已被广泛研究⁵。CTCs数量的变化常与早期检测、预后评估以及治疗反应的监测相关⁶。与此同时，cCAFs代表了进入血液循环的间质成分，反映了肿瘤微环境的相互作用以及转移前微环境的形成⁷。然而，与CTCs相比，针对cCAFs的研究仍较为有限，其临床应用价值尚处于初步探索阶段⁸。

循环肿瘤细胞（CTCs）和循环癌相关成纤维细胞（cCAFs）在液体活检中可能提供互补的生物学信息：CTCs 反映肿瘤细胞的播散及转移特性，而 cCAFs 可能代表间质重塑及与肿瘤微环境相关的进展信号。因此，对这两种循环稀有细胞群体进行联合分析，相较于单独分析任一群体，有助于更全面地理解癌症进展过程。然而，由于它们在外周血中极为稀少、缺乏普遍公认的 cCAFs 标志物，以及不同细胞亚群间标志物表达存在显著异质性，这些因素共同阻碍了其可靠识别，从而严重限制了其临床应用和转化价值。因此，在富集和鉴定过程中最大限度减少细胞损失，对于确保分析的稳健性和可靠性至关重要。此外，对 CTCs 和 cCAFs 的功能多样性及标志物异质性进行全面表征，对于阐明其在转移中的作用以及开发具有临床意义的生物标志物至关重要^8,9。

本文介绍一种同时分离cCAFs和CTCs^10,11的方法，并结合使用水凝胶包埋稀有细胞免疫细胞化学（ICC）进行多标志物鉴定¹²。目前结直肠癌（CRC）细胞的分离方法常面临技术局限性，包括多步骤操作过程中的细胞丢失、对表型异质性细胞捕获能力有限，以及基于标志物富集策略所导致的选择偏倚。相比之下，本研究采用的连续离心式微流控平台基于全面的富集框架，从而降低了对传统阳性选择标志物的依赖。该富集平台的分析性能与工作流程已在我们先前的研究中有所描述⁹。

在该已验证平台的基础上，本研究重点整合基于水凝胶的细胞固定技术与多重免疫细胞化学方法，以实现对多种循环稀有细胞群体（包括循环肿瘤细胞CTCs和循环癌相关成纤维细胞cCAFs）在统一工作流程中的全面分离与鉴定。通过结合细胞富集、稳定的细胞滞留以及可重复染色的分析方法，本方案为液体活检样本中稀有细胞的整合分析提供了切实可行的技术框架。

方案

所有涉及患者和健康供体人血样本的操作均按照延世医院机构审查委员会（IRB）的指南进行。本研究方案已获得延世医院机构审查委员会批准（IRB编号：4-2013-0059）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 设备准备

1. 按下电源开关以启动仪器。
2. 启动激光联锁开关，然后打开激光电源开关。
3. 启动操作软件，并确认系统正常初始化。
4. 在主软件界面中，选择设备操作，并选择用于标准EDTA全血样本的预设程序。

2. 设备操作 - 1^st 步骤

注意：进样口位置和卡盒结构的详细信息见图1A。

1. 从入口 6 向初始腔室中加入 2 mL 试剂 A（密度梯度介质）。
2. 从入口 8 向耗竭腔室中加入 875 µL 试剂 A。
3. 将 cartridge 安装至圆盘架上，确保离心时保持适当平衡。
4. 按下 CTCeptor 上的 Door 按钮以打开安装位，然后将圆盘架安装到 CTCeptor 上，并使用固定螺钉将其固定。
5. 按下 Door 按钮关闭安装位，然后通过 CTCeptor 软件运行 Spin Down 步骤（约 30 秒）。
6. 确认试剂 A 已转移至初始腔室下部后，松开固定螺钉，在保持 cartridge 安装状态的情况下将圆盘架从仪器中取出。

3. 设备操作 - 2^nd 步骤

1. 处理血液样本前，须在经认证的生物安全柜中进行所有操作，并根据机构生物安全指南穿戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。
2. 将 cartridge 从仪器中取出后，通过入口 6 向初始腔室注入 3 mL 血液。
3. 将碟架安装到 CTCeptor 上，并使用固定螺钉将其固定。
4. 使用 CTCeptor 软件运行 RBCs Removal 步骤（约 40 分钟）。在此步骤中，离心作用使 cartridge 内的血浆、红细胞（RBCs）和外周血单个核细胞（PBMCs）分离，并将含有 PBMCs 的组分转移至下一腔室，以进行后续白细胞耗竭。
5. 完成 RBCs Removal 步骤后，将碟架从仪器中取出。

4. 设备操作 - 3^rd 步骤

1. 仔细消毒工作区域，以保持无菌状态。
2. 涡旋振荡试剂B（白细胞分离珠），确保形成均匀悬浮液。
3. 通过将无Ca²⁺/Mg²⁺的DPBS与0.1% BSA和2 mM EDTA（pH 7.4）混合，制备洗涤缓冲液。
4. 将所需体积的试剂B转移至1.5 mL离心管中（例如，每根 cartridge 使用50 µL）。
5. 加入相当于试剂B体积五倍的洗涤缓冲液，并用移液器轻轻吹打混匀。
6. 将离心管置于磁力架上静置1分钟，使试剂B中的磁珠聚集，然后小心弃去上清液。
7. 用与初始磁珠体积相等的洗涤缓冲液重新悬浮磁珠。
8. 将磁珠悬浮液于4 °C保存，直至使用。
9. 使用前立即取50 µL预处理的磁珠与50 µL DPBS混合，并将100 µL混合液加入入口7中。
10. 将圆盘架安装到CTCeptor仪器上，并用固定螺钉固定。
11. 使用CTCeptor软件运行WBCs Removal步骤（约50分钟）。在此程序化步骤中，加载的白细胞分离磁珠通过振荡与含PBMC的组分混合，以促进磁珠与白细胞的结合，随后通过离心去除与磁珠结合的白细胞组分。
12. 完成WBCs Removal 步骤后，从仪器上取下圆盘架。

5. 样品回收

1. 将移液枪头插入最终腔室的9号出口，重悬其中内容物，然后将收集的样品转移至15 mL离心管中。
2. 向9号出口注入2 mL DPBS，通过移液充分冲洗腔室，并将洗涤液转移至同一15 mL离心管中。
3. 重复洗涤步骤两次。
4. 用DPBS将15 mL离心管中收集的液体体积调至14 mL，盖紧管盖，并轻轻倒置混匀。
5. 在室温下以380 × g 离心4分钟。
6. 小心吸除上清液，保留约1 mL，将剩余的悬浮液用于后续分析。

6. 结直肠癌细胞的鉴定

1. 配制预水凝胶聚合物时，按80:20:1的比例混合无Ca^2⁺/Mg^2⁺的DPBS、水凝胶薄层免疫细胞化学（HypICC）溶液A（预聚物）和光引发剂。
2. 将870 µL CRC悬液与270 µL预水凝胶聚合物混合。
3. 将混合物转移至HypICC 腔室中，在500 × g条件下离心5 分钟，使细胞沉降到平台表面。
4. 将厚度控制器插入HypICC腔室，以设定水凝胶的厚度。
5. 从底部用紫外光（365 nm）照射样品20–30秒，使水凝胶层交联。
6. 移除厚度控制器，并用DPBS洗涤水凝胶包封的细胞三次。
7. 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟，然后用DPBS洗涤样品三次，每次10分钟。
8. 在室温下用0.05% Triton X-100对细胞进行透化处理10分钟，随后用DPBS洗涤样品三次，每次10分钟。
9. 在室温下用2% BSA封闭样品1小时。
10. 在4 °C条件下与一抗孵育过夜。
11. 用DPBS洗涤样品五次，每次20分钟。
12. 在室温下用Hoechst染色细胞核10分钟，然后用DPBS洗涤样品三次，每次10分钟。
13. 如需要，可在与一抗孵育相同的过夜条件下进行二抗孵育。
14. 进行荧光显微镜成像并鉴定CRCs。

7. 结直肠癌的多重免疫染色

1. 免疫染色和成像后，CRC 可在淬灭后进行新一轮的抗体染色。
2. 配制淬灭溶液，其中含 4.5% H₂O₂ 和 24 mM NaOH 的 PBS 溶液。
3. 从 HypICC 腔室中移除 DPBS，并加入淬灭溶液。
4. 在室温下，白光环境中振荡孵育 1 小时。
5. 更换淬灭溶液，并在相同条件下继续孵育 1 小时。
6. 用 DPBS 洗涤样品四次，每次洗涤 10 分钟。
7. 从封闭步骤开始重新进行免疫染色流程，使用 2% BSA 进行封闭。

结果

图1A 显示了用于稀有细胞分离的单个 cartridge 的图像。该 cartridge 由五个独立腔室组成，腔室之间通过微流通道和可调控液体流动的阀门连接。cartridge 的结构如下：（1）血浆腔室，用于收集从全血中分离出的血浆；（2）初始腔室，用于将全血分离为血浆、红细胞和外周血单个核细胞（PBMC）层；（3）混合腔室，用于将分离出的 PBMC 与白细胞分离磁珠混合；（4）耗竭腔室，用于去除白细胞；（5）最终腔室，用于收集富集的稀有细胞组分；（6）用于加载全血的进样口；（7）用于引入白细胞分离磁珠的进样口；（8）用于引入密度梯度介质的进样口；以及（9）作为收集富集细胞出口的收集孔。

初始腔室具有倾斜结构，旨在基于密度分离后防止红细胞（RBC）污染（图1B）。处理过程中，首先将密度梯度介质加入初始腔室，执行沉降步骤（图1C-i），随后注入全血（

讨论

循环肿瘤细胞（CRCs）是重要的生物标志物，在癌症诊断和预后方面具有潜在价值。然而，为了提高CRC分析的临床实用性，重要的是要捕获表型更为多样的CRC群体，并支持并行的多参数表征¹³。此外，肿瘤免疫学领域的越来越多证据表明，免疫组分和肿瘤微环境在决定治疗反应中发挥关键作用，这凸显了需要超越仅以肿瘤细胞为中心的信息¹⁴。综合来看，这些因素支持开发整合性的CRC分析工作流程，以更真实地反映与癌症进展和治疗反应相关的复杂细胞相互作用。

CRC 分离方法通常针对单一目标细胞群进行优化，或难以在一个工作流程中便捷地配置用于多种循环稀有细胞亚群的整合下游分析。本研究中使用的连续离心微流控富集平台，此前已验证可用于自动化的稀有细胞富集性能。在此既定平台基础上，本研究重点在于实现水凝胶介导的细胞固定化与多重免疫细胞化学技术的实用化整合，以支持对循环肿瘤细胞（CTC）和循环癌相关成纤维细胞（cCAF）进行同步识别与表征。因此，本工作的主要贡献并非重新建立平台层面的基准性能评估，而是展示一种统一的下游工作流...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	SPL	50015
16% 甲醛（w/v），无甲醇	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
牛血清白蛋白	GenDepot	A0100-010
CD45 抗体	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	离心盘
CTCD 架	CTCELLS	CTDR-CM3	离心盘架
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S 试剂 A	CTCELLS	CTR-S1001	密度梯度介质
CTR-S 试剂 B	CTCELLS	CTR-S1002	白细胞分离微珠
FAP 抗体	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC 光引发剂	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC 溶液 A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC 装置	CTCELLS	CTH-V01	HypICC 反应室
乳胶手套	Ansell	93743080
磁力架			使用 3D 打印机自行制备
手动移液器  (0.5–10 µL)	Eppendorf	3120000020
手动移液器  (100–1000 µL)	Eppendorf	3120000062
手动移液器  (10–100 µL)	Eppendorf	3120000046
手动移液器  (20–200 µL)	Eppendorf	3120000054
手动移液器  (2–20 µL)	Eppendorf	3120000038
广谱细胞角蛋白抗体	Invitrogen	53-9003-82
PBS（磷酸盐缓冲液）	Welegene	LB001-02
SMA 抗体	Invitrogen	PA5-18292
吸头，10 µL	TipOne	9104020333
吸头，1250 µL	TipOne	9104020740
吸头，200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
全血			以 EDTA 抗凝采集后，于 4–8 °C 保存
β 肌动蛋白抗体	abcam	ab8226