一种优化的小鼠女性尿道上皮分离方法用于单细胞及免疫荧光分析

摘要

本方案介绍了一种优化的小鼠成年雌性尿道上皮层分离方法，可用于后续分析，包括流式细胞术、免疫染色和类器官培养。实验结果表明，该方法可获得富集且具有活性的尿道上皮细胞，流式细胞术分析、整体组织成像以及高效的类器官形成均证实了这一点。

摘要

尿道由上皮细胞衬覆，是尿液排出体外的通道。尿道上皮层包含多种具有特定基因表达特征的细胞类型，提示其在抗菌和免疫防御中发挥作用。嵌于尿道上皮层中的常驻巨噬细胞代表一种转录上独特的亚型，据称参与免疫监视和抗原呈递。尿路病原体经尿道上行至膀胱。对尿道上皮层及其相关免疫细胞的研究将有助于阐明下尿路的宿主防御机制。本方案的核心目标是提供优化的方法，用于分离雌性小鼠尿道并获取上皮层，以进行后续分析。该方案描述了一种通过温和的酶解和机械分离方法，从雌性小鼠尿道中分离上皮组织的优化流程。在完成上皮分离后，进一步介绍了通过温和酶消化法处理分离的尿道上皮组织及其相关免疫细胞，以获得高存活率的单细胞悬液的技术。本方案还详细说明了对分离的小鼠尿道上皮细胞及上皮相关免疫细胞进行流式细胞术分析的方法。此外，本文提供了由分离的上皮细胞生成分层三维尿道上皮类器官的方法。方案中还详述了一种用于尿道上皮片整体免疫染色的优化方法，可用于观察小鼠尿道上皮及其相关免疫细胞的形态学和分子结构。总体而言，本文所述的小鼠尿道上皮细胞的分离与单细胞消化方法，可支持包括免疫染色、流式细胞术、类器官生成以及单细胞RNA测序在内的多种下游分析。

引言

小鼠下尿路（LUT）由两部分组成：膀胱和尿道。在胚胎发育阶段，下尿路的结构起源于泄殖腔，泄殖腔是一种短暂存在的内胚层来源结构，位于后肠尾端。泄殖腔的腹侧部分即尿生殖窦，其前部形成膀胱，后部形成尿道¹。膀胱内衬已有深入研究，其通过顶端由尿斑蛋白（uroplakin proteins）组成的结晶斑形成一道紧密屏障，以抵御尿液成分的渗透^2,3,4。尽管膀胱内衬为移行上皮，但从膀胱颈部至远端尿道开口，尿道的上皮结构与膀胱存在差异。此外，尿道在上皮结构和细胞架构方面表现出性别二态性。雄性小鼠尿道在膀胱颈部为移行上皮，随后为柱状上皮和复层上皮；雌性小鼠尿道在膀胱颈部由移行上皮衬覆，向远端则逐渐过渡为多层复层非角化上皮，并分布有通向分泌腺体的小导管⁵。

女性更容易发生尿路感染（UTIs），这主要由尿路致病性细菌引起，这些细菌从肠道经尿道上行感染膀胱⁶。尿道是下尿路（LUT）中首先与上行性尿路病原体接触的表面。尿道上皮细胞的功能，尤其是其作为主动免疫屏障的作用，迄今研究尚不充分。同一研究团队近期发表了成年雌性小鼠尿道的单细胞分辨率空间图谱⁵，揭示了尿道衬层具有基底细胞、中间细胞和顶细胞组成的三层结构。在上皮衬层中还零星分布着少量神经内分泌细胞^5,7。在尿道中段区域，一些小导管从尿道主干分支而出，末端连接成群的分泌腺体，这些腺体嵌于尿道的间质区。转录组学数据显示，尿道上皮细胞表达多种免疫调节和抗菌基因，可能在宿主防御中发挥重要作用⁵。深入研究尿道上皮细胞在防御潜能及免疫调节功能方面的特性，可能为防治尿路感染提供新的策略。

利用小鼠研究尿道上皮可实现对时间动态过程及性别二态性的探究。鉴于小鼠与人类在膀胱和尿道细胞结构方面具有相似性¹，小鼠已被广泛用于下尿路胚胎发育的研究^1,8,9。此外，小鼠也被应用于经尿道灌注模型，以研究由尿路病原体引起的尿路感染^10,11,12 。在临床患者中，除非因癌症或其他疾病接受切除手术，否则难以获取下尿路组织。持续且健康的正常人类组织来源极为有限，因此小鼠为研究下尿路组织的稳态维持、损伤修复以及对炎性刺激的反应提供了有价值的模型。雌性小鼠与人类的尿道内衬在膀胱颈部位均由移行上皮构成，向远端则逐渐转变为复层非角化、非鳞状上皮。在人类女性尿道的远端可观察到鳞状上皮，但随着年龄增长，人类女性尿道内衬存在个体差异^5,13。尽管目前尚未在转录组水平上对人类与小鼠尿道内衬进行系统比较，小鼠仍是一个有效的模型，可用于研究尿道上皮的模式形成、上皮-免疫相互作用以及对感染的响应。

在本研究中，作者描述了完整分离成年雌性小鼠尿道、分离尿道上皮组织以及通过温和酶消化制备单细胞悬液的方法。这是首个针对雌性小鼠尿道上皮组织的分离与消化的详细实验方案。优化后的方案可获得富含上皮细胞的单细胞群体，可用于多种下游分析。如研究中所示，作者对尿道上皮细胞分离物的单细胞悬液进行了流式细胞术分析，结果显示存在大量存活的单细胞，且主要为上皮细胞。此外，这些上皮细胞能够在三维培养中形成类器官，其结构类似于分层的小鼠尿道上皮衬里。作者还展示了尿道上皮片的整体染色方法，用于研究与上皮相关联的免疫细胞（特别是巨噬细胞）与尿道上皮细胞之间的相互关系。本文所描述的方法将有助于开展关于尿道上皮及其在免疫防御中作用的研究。

方案

所有小鼠实验均经班加罗尔干细胞科学与再生医学研究所（BRIC-Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine）的机构动物伦理委员会（INS-IAE 2022/01(R 1 M2)）和机构生物安全委员会（inStem/G-141(3)-22/DBJ）批准。本研究使用饲养于班加罗尔生命科学集群（Bangalore Life Sciences Cluster, BLiSC）国家生物科学中心（NCBS）动物护理与资源中心（ACRC）的6至12周龄雌性CD-1或C57BL6/J小鼠。 小鼠饲养在特定病原体阴性环境中，采用12小时光照-黑暗循环，自由摄食和饮水。

所用材料均列于材料表中。

1. 成年雌性小鼠尿道的解剖与采集

1. 使用 CO₂ 对小鼠实施安乐死。以颈椎脱位作为辅助安乐死方法。
2. 将小鼠置于仰卧位，并喷洒 70% 乙醇润湿腹部毛发（图 1A）。
3. 用镊子提起腹部皮肤，沿纵轴向下体方向做垂直切口，止于尿道外口（图 1B 和 1C）。
4. 辨认膀胱，并用镊子轻轻提起。在某些情况下，膀胱可能充满尿液。用镊子轻轻挤压膀胱以排空内容物。
   注意：膀胱呈膨大的囊状结构。
5. 使用小型弹簧剪修剪膀胱周围的脂肪和结缔组织，暴露两侧耻骨在耻骨联合处连接形成的蝶形结构（图 1D）。尿道位于耻骨联合下方。
6. 用镊子提起耻骨联合，用小型弹簧剪将其剪开（图 1E）。移除耻骨碎片，使尿道从膀胱向下延伸的部分清晰可见（图 1F）。
   注意：尿道呈细长的红色管状结构，位于阴道壁腹侧表面（图 1G）。
7. 用精细镊子轻轻向上牵拉膀胱，将小型弹簧剪插入尿道与阴道壁之间，分离泌尿道与生殖道。
8. 在沿尿道背侧剪切时保持膀胱轻微张力，以将其从阴道壁分离（图 1H–J）。一直剪至远端尿道开口，以获取全长的小鼠尿道（长度为 1.2–1.5 cm）（图 1K 和 1L）。
9. 在膀胱颈处做单一切口，将尿道与膀胱分离。

2. 尿道上皮组织的分离

注意：从尿道分离上皮层的方案已对子宫内膜上皮分离方案进行了修改和优化¹⁴。图2展示了从周围间质区室中分离尿道上皮层的步骤（图2A）。

1. 将解剖好的尿道组织转移至含有新鲜1×Hanks平衡盐溶液（HBSS，无钙镁，详见补充表1）的无菌培养皿中。
   注意：建议在此阶段合并4–5根尿道组织，用于上皮分离和单细胞消化。
2. 在解剖显微镜下，使用尖头镊子和小型弹簧剪刀去除尿道周围的脂肪和结缔组织（图2B）。
3. 将每根尿道横向切成大小相等的两段，并放置在100微米尼龙网筛上（图2C–G）。
4. 用1 mL 1×HBSS（无钙镁）冲洗组织。
5. 将组织片段转移至含有1 mL 1%胰蛋白酶（1% Trypsin, w/v，溶于1×sHBSSa，详见补充表2）的1.5 mL微量离心管（MCT）中（图2H）。
6. 在4 °C条件下，于样品旋转仪（30 rpm）上孵育15–30分钟进行组织消化。
7. 孵育结束后，从4 °C取出离心管，在同一管中加入MgCl₂（1 M MgCl₂，用1×HBSS配制的储存液），使其终浓度为10 mM，同时加入DNase I（10 mg/mL DNase I，用1×PBS配制的储存液），使其终浓度为10 µg/mL，与组织片段混合。
8. 将离心管转移至37 °C杂交炉内的样品旋转仪上，继续孵育15–30分钟。
   注意：4 °C和37 °C下的胰蛋白酶孵育时间可根据下游应用进行调整。全组织染色建议采用15分钟孵育，单细胞消化则建议采用30分钟孵育。
9. 将组织转移至含有10%绵羊血清的1×HBSS（无钙镁）的1.5 mL MCT中，以终止胰蛋白酶活性。
10. 将尿道组织转移至另一含有冰浴1×HBSS（无钙镁）的新离心管中，随后转移至含有冰浴1×HBSS的无菌培养皿中。 
11. 使用两把尖头镊子，从尿道中挤出上皮组织。用一把镊子夹住尿道片段的一端。
12. 另一只手用镊子夹住尿道片段，沿其全长滑动挤压，以挤出上皮组织。对培养皿中其余尿道片段重复此操作，以分离上皮组织（图2I–J）。
    注意：机械分离后，一层薄而透明的上皮组织将从尿道腔内被挤出。尿道上皮可识别为比间质组织颜色更浅（透明）、呈片状的薄层组织碎片。分离出的上皮组织应为细丝状、透明的组织片段，可转移至培养皿中进行切碎。组织分离物不应完全解体。若组织碎片完全解体，可缩短胰蛋白酶孵育时间。

3. 消化制备单细胞悬液

1. 将分离的上皮组织碎片用小型塑料移液管或200 µL移液枪头转移至无菌培养皿中。在直接滴加到组织碎片上的1x HBSS液滴中，使用小型弹簧剪将上皮组织剪切成小片段。图 2K).
   注意：上皮分离后残留的间质组织可采用与分离上皮相同的方法进行消化。
2. 转移 使用移液器将剪碎的组织转移至含有1.5 mL预热（37 °C）Accutase消化液的2 mL MCT管中。Accutase消化液成分如下：Accutase、10 µM Rocki Y-27632和100 µg/mL DNase I。
3. 将含有组织和消化液的离心管转移至37 °C杂交炉中的样品旋转仪上，孵育1 h。
   注意：在继续操作前，可检查管内物质以确认消化是否成功。消化成功的标准：组织碎块在Accutase溶液中充分分散 孵育后仅见少量可见碎片。 消化失败：在Accutase溶液中孵育后仍存在大块组织。为确保消化成功，组织必须尽可能充分剪碎。
4. 孵育1小时后，将2 mL MCT管中的全部内容物转移至5 mL离心管中，并加入2 mL洗涤缓冲液（不含Ca和Mg的1×PBS，含1%牛血清白蛋白）。
5. 600 x g 离心悬浮液 g 在4 °C下，使用水平转子离心机离心5分钟。
6. 使用移液器吸除上清液 用带滤芯吸头的1 mL移液器吸取1 mL洗涤缓冲液，轻轻抽吸以重悬沉淀。
7. 用移液枪头反复吹打沉淀，直至团块变小。将悬液用1 mL注射器连接23½号针头推注4次，随后用同一注射器连接26½号针头推注4–6次。
   注意：必须通过细针头以获得均匀的单细胞悬液，并防止细胞聚集。尽管此步骤可能引起剪切应力和细胞死亡，但作者已优化了针头和注射器的抽吸次数，在避免过度细胞死亡的同时实现了单细胞悬液的制备。若跳过此步骤，将导致大量细胞成团，从而干扰后续分析，如单细胞RNA测序和流式细胞术。
8. 向置于5 mL离心管上的30微米预分离滤膜中加入1 mL洗涤缓冲液以润湿滤膜表面。使用连接26½号针头的注射器将1 mL细胞溶液通过滤网转移。
9. 向含有细胞的离心管中加入1 mL额外的洗涤缓冲液，然后用注射器吸取该溶液并使其通过滤膜。在600 x g条件下离心收集细胞沉淀 g 在4 °C下以摆桶转子离心5分钟。
10. 吸弃上清液，将沉淀重悬于100 µL洗涤缓冲液中，加入100 µL 1x红细胞（RBC）裂解缓冲液。将悬液在室温下准确孵育3分钟，然后加入4 mL洗涤缓冲液并重悬沉淀。
    注意：建议进行红细胞裂解，以从尿道上皮细胞悬液中去除血细胞。尽管该步骤可能对上皮细胞活力产生轻微影响，但本方案采用0.5倍稀释的红细胞裂解缓冲液并孵育3分钟，以尽量减少细胞损失并维持细胞活力。.
11. 通过离心（600 x g）收集细胞 g 在4 °C下以摆桶转子离心5分钟。
12. 吸弃上清液，根据沉淀物大小，用50–200 µL洗涤缓冲液重悬沉淀。
    注意：来自4–5个 pooled 小鼠尿道上皮样本的沉淀物体积较小，但肉眼仍可见。必须使用水平转子离心，以确保沉淀位于管底，而非沿管壁涂抹。研究人员记录的小鼠尿道上皮每只可获得28,000–34,000个活细胞。
13. 将5 µL细胞悬液转移至0.5 mL MCT管中，加入5 µL台盼蓝染液。混匀后取样加载至血细胞计数板，检测细胞产量和细胞活力。

4. 尿道上皮单细胞分离物的流式细胞术分析

1. 取100,000个总细胞分装至5 mL离心管中，用于对尿道上皮或间质区室的单个细胞进行流式细胞术荧光免疫染色。用1×PBS将管内体积补至4 mL。
   注意：为获得可靠的流式细胞术结果，建议每个样本至少使用50,000个细胞。
2. 使用水平转子，在4 °C条件下以500 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。
3. 弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µL的1×PBS中。
4. 向细胞悬液中加入50 µL的2×Ghost染料Violet 450（将1 µL Ghost染料溶于500 µL 1×PBS中），最终得到100 µL的1×Ghost染料溶液。
   注意：Ghost Dye V450是一种胺反应性活率染料，可用于在流式细胞术应用中区分活细胞与死细胞。
5. 每100 µL细胞悬液中加入5 µL Fc受体阻断液（抗小鼠CD16/32），室温孵育5分钟。
   注意：此步骤用于阻断免疫球蛋白与Fc受体的结合。
6. 将细胞悬液置于冰上继续孵育25分钟。
7. 用细胞染色缓冲液（1×PBS，0.02% (w/v) 叠氮化钠，1% (w/v) BSA，参见补充表3）将细胞悬液稀释至5 mL，使用水平转子在4 °C条件下以500 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于100 µL细胞染色缓冲液中。
   注意：叠氮化钠具有高毒性，避免接触皮肤、眼睛和衣物。操作时应使用适当的个人防护装备（PPE）。
8. 在100 µL细胞悬液中加入5 µL偶联的一抗：抗CD326/EPCAM（标记上皮细胞）、抗F4/80（标记小鼠巨噬细胞）和抗CD45（泛免疫标记物），稀释比例为1:20。将细胞悬液置于冰上孵育30分钟。
9. 用细胞染色缓冲液将细胞悬液稀释至5 mL，然后使用水平转子在4 °C条件下以500 ×g离心5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于500 µL细胞染色缓冲液中。
10. 将细胞悬液通过装有35微米尼龙滤网的带滤帽分选管进行过滤。将样品管置于冰上，待后续分析。
11. 对流式细胞仪进行初始设置和性能检查。
12. 使用未染色和完全染色的样本调整电压。使用微珠对照进行补偿校正，然后开始数据采集。
    注意：若实验中使用多种荧光染料，则必须进行补偿校正。请准备必要的补偿对照。每种实验中使用的荧光染料均需配备单染对照（即补偿微珠）。可根据流式细胞仪软件设置自动完成补偿。建议使用FMO（减去一色荧光）对照来区分特定荧光染料的阳性与阴性细胞群。制备FMO对照时，除待控制的荧光染料外，其余所有荧光染料均应包含在样本中。
13. 使用FMO（减去一色荧光）对照调整设门，并采集每个样本50,000个事件。

5. 尿道上皮类器官的培养

注意：对于小鼠尿道上皮类器官，请遵循方案第3部分“消化为单细胞悬液”中的步骤3.1至3.11，以获得单细胞悬液。

1. 用50–100 µL类器官扩增培养基重悬尿道上皮细胞沉淀（详见补充表4）。使用血细胞计数板计数，测定细胞活力和细胞数量。
2. 将细胞悬液（1份）与Cultrex（4份）配制成1:4的混合液，最终浓度为25 µL中含有5000个细胞。向12孔板的每个孔中加入3滴细胞悬液，每滴25 µL（每滴含5000个细胞）。
   注意：使用剪口枪头轻柔吸取Cultrex，避免产生气泡。
3. 将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育15分钟，使液滴凝固。
4. 从孔的侧边缓慢加入800 µL类器官扩增培养基，覆盖凝固的液滴，然后将培养板放回培养箱继续培养。
   注意：每2天需更换一次培养基。弃去旧培养基，每孔加入800 µL新鲜的类器官扩增培养基。
5. 从第0天至第6天，每天使用倒置显微镜在4x–20x放大倍数下拍摄类器官的图像。

6. 尿道类器官组织学与免疫染色

警告：二甲苯是一种高度易燃的溶剂。操作该化学品时应佩戴适当的个人防护装备。使用后的二甲苯应作为有机溶剂废物收集，并通过批准的危险化学品废物处理程序进行处置。福尔马林具有毒性，可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。避免皮肤接触和吸入。操作该化学品时应佩戴适当的个人防护装备。通过机构规定的危险化学品废物处理系统进行处置 。将尿道类器官包埋于石蜡块中的实验方案，是在子宫内膜类器官包埋方案的基础上修改和优化而来的¹⁴。

1. 类器官培养第6天，弃去用过的培养基，用1×HBSS在室温下洗涤类器官。向孔中加入1.5 mL中性缓冲福尔马林（10%），固定15分钟。
2. 弃去固定液，向孔中加入1.5 mL苏木精染液，染色10分钟。弃去染液，用1×HBSS洗涤两次。
3. 向每个含有3滴类器官的孔中加入1 mL用1×HBSS配制的2% UltraPure低熔点琼脂糖，室温下静置15分钟使其凝固。
4. 使用薄刮刀的平头端轻轻将琼脂糖从孔中取出，确保Cultrex液滴随琼脂糖一同脱落。
5. 将琼脂糖片转移至组织包埋盒中，加入70%乙醇，在室温下持续振荡脱水30分钟。
6. 继续用不同浓度的乙醇进行脱水处理：90%乙醇30分钟，100%乙醇30分钟，100%乙醇60分钟，100%乙醇90分钟。
7. 吸去多余乙醇，加入二甲苯在室温下持续振荡透明化45分钟。重复二甲苯透明化步骤60分钟。
8. 吸去多余二甲苯，将样品转移至65 °C的浸蜡石蜡中，过夜浸蜡。
9. 在金属包埋模具底部加入一层薄薄的包埋石蜡，将琼脂糖片置于其上。将模具从载片加热器上取下，迅速通过包埋盒底部的缝隙将包埋石蜡覆盖其上，室温下静置使其凝固。
10. 使用切片机对类器官石蜡块进行切片，获得5-µm厚的切片，并将切片置于带正电荷的载玻片上。
11. 苏木精-伊红染色
    1. 将载玻片在60 °C下烘烤，用二甲苯脱蜡，并通过一系列乙醇洗涤重新水化（二甲苯1分钟，100%乙醇1分钟，95%乙醇1分钟，75%乙醇1分钟）
    2. 用自来水冲洗载玻片，加入Gill苏木精染液2号，染色3分钟。将载玻片置于流动的自来水中，使切片呈现蓝色。
    3. 将载玻片在95%乙醇中孵育1分钟，随后加入0.25%伊红溶液染色1分钟。用自来水冲洗载玻片，直至流出水清澈。
    4. 脱水（95%乙醇1分钟，100%乙醇1分钟），用二甲苯透明化（1分钟），然后使用快干封片剂封片。
12. 石蜡切片免疫染色
    1. 将5 µm石蜡切片置于杂交炉中，60 °C烘烤1–2小时。
    2. 将载玻片浸入二甲苯中6分钟，进行脱蜡处理（使用切片染色缸）。
    3. 依次用100%、95%、75%乙醇（溶于蒸馏水）各洗涤6分钟进行再水化处理，然后用蒸馏水洗涤5分钟。
    4. 将载玻片放入盛有0.01 M柠檬酸（溶于蒸馏水）抗原修复液的方形Pyrex玻璃皿中，并用保鲜膜覆盖。使用微波炉高火加热20分钟进行抗原修复。
    5. 冷却至温热状态20分钟，用PBS冲洗5分钟。在组织切片周围画出疏水屏障，每张切片加入100 µL马源封闭缓冲液，室温下轻柔振荡封闭1小时（马源封闭缓冲液的配制方法见补充表5）。
    6. 在马源封闭缓冲液中按适当稀释比例（1:100–1:200）加入一抗，配制一抗溶液。每张切片加入100 µL一抗溶液，4 °C下轻柔振荡孵育过夜。
       注：类器官使用针对Keratin 5/KRT5（基底上皮标志物）、P63（基底上皮标志物）、KRT4（中间/上基底上皮标志物）和KRT13（中间/上基底上皮标志物）的抗体进行免疫染色。
    7. 过夜孵育后，室温下用PBS轻柔振荡洗涤4次，每次5分钟。
       注：后续所有步骤均应在避光盒中于室温下进行。
    8. 在马源封闭缓冲液中按1:500稀释比例加入荧光标记的二抗，配制二抗溶液。室温下轻柔振荡孵育1小时。
    9. 室温下用PBS轻柔振荡洗涤4次，每次5分钟。
       注：可选步骤：可使用自发荧光淬灭试剂盒淬灭自发荧光信号。
    10. 加入300 nM DAPI溶液，轻柔振荡孵育5分钟。室温下用PBS洗涤2次，每次5分钟。
    11. 使用抗荧光淬灭封片液（90%甘油，0.2%没食子酸丙酯溶于1×PBS）封片。在宽场荧光显微镜下观察切片。
        注：每种荧光染料的相机曝光参数应调整至在避免像素饱和的同时最大化信噪比。同一实验批次中染色的类器官应使用相同的曝光参数进行成像。

7. 分离的尿道上皮组织片的全组织免疫染色

注意：进行全组织免疫染色时，请遵循方案第2节“尿道上皮组织的分离”中的步骤2.1至2.12，以获取尿道上皮组织片。

1. 使用移液管或200 µL枪头小心地将上皮组织转移至含有500 µL 10%中性缓冲福尔马林的24孔组织培养板的一个孔中。用石蜡密封板盖，并在4 °C下于摇床上孵育20分钟。
   注意：所有步骤均需在同一孔中进行，以避免上皮组织丢失。
2. 小心吸尽孔中的甲醛溶液。加入500 µL 1x PBS进行洗涤，于室温在摇床上孵育5分钟。重复该洗涤步骤一次。
3. 加入500 µL透化溶液（含1x PBS + 1% Triton X-100）至孔中。密封盖子 用封口膜密封培养板，于4 °C轻柔振荡孵育2小时。
4. 小心地从孔中吸出透化溶液。
5. 使用含有额外1% Triton X-100的500 µL马源封闭缓冲液孵育组织进行封闭（马源封闭缓冲液配方见下文） 补充表5用封口膜密封培养皿盖，于4 °C轻轻振荡孵育过夜。
6. 在含有额外1% Triton X-100的马源封闭缓冲液中，按适当稀释比例（1:100–1:200）加入一抗，配制一抗溶液。吸除封闭液后，加入500 µL一抗溶液：抗CDH1（上皮细胞标志物）和抗F4/80（小鼠巨噬细胞标志物）。用封口膜密封盖子，在4 °C条件下轻轻振荡孵育48–72小时。
7. 小心吸除一抗溶液，用1×PBS在室温下轻轻摇动孵育，每次30分钟，共洗涤3次。
8. 在马源封闭缓冲液中加入1% Triton X-100，并按适当稀释比例（1:500）加入二抗，配制二抗溶液。
9. 向孔中加入500 µL二抗溶液，用铝箔覆盖酶标板，在摇床中室温孵育4–6小时。
10. 小心吸去二抗溶液，室温下用1×PBS洗涤3次，每次30分钟。
    注意：可将组织与稀释的 DAPI 储存液（终浓度为 300 nM）在室温下孵育 10 分钟进行 DAPI 染色。在摇床上用 1x PBS 在室温下洗涤组织（每次 5 分钟，共 2 次）。
11. 小心地将上皮组织转移至载玻片上 成像培养皿并加入抗荧光淬灭封片液（90% 甘油，0.2% 没食子酸丙酯溶于 1× PBS 中）。
12. 在荧光显微镜下观察组织图像。
    注意：由于样本较厚，作者建议使用具备光学切片功能的荧光显微镜进行成像。本研究中，作者采用配备Apotome光学切片系统的宽场荧光显微镜以去除离焦光信号并获取z轴层扫图像。通过获取图像的z轴堆栈，用于观察上皮相关巨噬细胞的树突状突起。

结果

成年雌性小鼠尿道的解剖与采集

在本研究的第一部分，作者提供了一种小鼠雌性尿道解剖的详细方案。由于尿道附着于阴道前壁，并位于耻骨联合下方，本方法可实现完整雌性尿道的清晰解剖（图1）。

尿道上皮组织的分离及单细胞流式细胞术分析

胰蛋白酶消化可使尿道上皮层与周围间质组织易于分离。分离后可观察到透明度高于间质组织的上皮片层（图2）。分离得到的上皮片层经酶消化后可获得单细胞悬液。通过台盼蓝染色在血细胞计数板上检测，从尿道上皮分离的单细胞始终表现出较高的存活率（>80%）（图2L），并可通过使用活细胞染料进行流式细胞术分析以圈定活细胞（图3，补充文件1）。

作者通过流式细胞术评估了从尿道上皮单细胞悬液中富集上皮细胞的效果。为检测细胞活力，将细胞悬液用活/死细胞染料（一种胺反应性鬼染料 V450）进行染色。作者通过活/死标记 consistently 观察到细胞活力 >80%。该活/死标记有助于在流式分析过程中排除碎片和死细胞。他们使用上皮细胞标记物（CD326/EPCAM）、巨噬细胞标记物（F4/80）以及免疫细胞标记物（CD45）对样本进行染色，以记录通过该方法分离得到的细胞组成。流式细胞术结果显示，作者成功从雌性小鼠尿道上皮中分离出富集的上皮细胞群体。在两次独立实验中，经活细胞设门后，EPCAM 阳性上皮细胞的比例均达到 80–90%。作者还在上皮细胞制备物中观察到约 1.30% 的 CD45+ 免疫细胞。与上皮层相关的巨噬细胞约占上皮区室中活细胞的 1.18%。对来自上皮片层的单细胞悬液进行流式细胞术分析显示，间质污染极少（5–6%），根据他们之前的研究⁵，这些污染主要来源于血管内皮。补充文件 1 展示了来自上皮区室和间质区室单细胞制备物的流式细胞术结果。与从上皮区室分离得到的上皮细胞 80–90% 的富集度相比，间质区室中也含有 40–50% 的上皮细胞，这些细胞来源于从尿道腔延伸至周围间质中的短导管和腺上皮（图 3，补充文件 1）。

尿道上皮类器官培养、组织学与免疫染色

作者还展示了从尿道分离的单个上皮细胞具有活力，并能在三维基质中形成类器官，观察到单个尿道上皮细胞在培养至第6天时的类器官生长情况（图4B–G）。他们进行了苏木精-伊红染色（H&E）以观察类器官的组织学结构（图4H–J）。作者观察到尿道上皮类器官存在两种不同的形态：一种体积较大且中空，另一种较小且为实心结构。在两种情况下，类器官均呈现分层结构，并重现了女性尿道上皮衬里中表达的标志物，包括标记基底层的KRT5和P63，以及标记上基底层/中间细胞层的KRT4和KRT13（图4K–N），补充图1）。研究还比较了近端与远端尿道之间类器官形成能力的差异。源自近端尿道的类器官中空结构比例更高，而来自远端尿道的类器官则形成实心球状结构（图4O–P）。此外，作者还观察到从尿道近端和远端分离的上皮细胞在类器官形成效率上的差异。在相同的初始接种密度（5000个细胞/滴）下，远端尿道上皮细胞形成类器官的效率高于近端尿道上皮细胞（图4Q–S）。

分离尿道上皮组织的整体免疫染色

研究人员还提出了一种优化的小鼠雌性尿道上皮组织全封片染色方法。在此方法中，他们使用两种标记物对上皮组织片进行染色：F4/80 用于标记巨噬细胞，E-钙黏蛋白/CDH1 用于标记上皮细胞间的细胞连接（图5）。组织样本使用配备 Apotome 3 光学切片系统的蔡司 Axio Observer 7 显微镜进行成像。上皮组织片显示出 CDH1 抗体的强阳性标记信号。使用 F4/80 抗体标记的尿道上皮全封片显示，巨噬细胞在上皮层内形成树突状分支结构。可观察到巨噬细胞向尿道上皮细胞之间延伸出树突样突起。总体而言，结果表明本文所述实验方案可用于研究小鼠雌性尿道上皮层的结构与特征。

图1：用于采集雌性小鼠尿道的解剖操作。（A）将小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇喷洒腹部。（B–C）提起皮肤并做垂直切口以打开腹腔。（D）修剪脂肪和结缔组织，暴露呈蝴蝶状、在（黑色箭头所示）耻骨联合处相连的耻骨。（E）剪开耻骨联合。（F）去除耻骨后，可见尿道从膀胱向下延伸（以黑色虚线轮廓标示）。（G）用镊子轻轻提起膀胱，尿道清晰可见，呈一条细的红色管道。（H–I）将膀胱从体腔中向上牵拉，利用张力使尿道与阴道前壁分离。将剪刀插入尿道与阴道壁之间，分离泌尿道与生殖道。（J–K）分离附着于皮肤的尿道远端。（L）雌性小鼠下尿路（FLUT）解剖后图像，显示膀胱与尿道。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：尿道上皮的分离及单细胞悬液的制备。（A）示意图显示尿道上皮和间质组分的酶消化与机械分离过程，随后进行单细胞消化。（B）清除女性下尿路多余的脂肪组织。（C–F）从膀胱颈区域切断尿道，以将尿道与膀胱分离，然后使用精细剪刀将尿道沿纵轴剪成两半。（G）用1× HBSS溶液冲洗尿道组织片段，并通过100微米滤网过滤。（H）将尿道组织碎片转移至1%胰蛋白酶溶液中，在低温室中置于样品旋转仪上孵育。向同一管中加入MgCl₂和DNase I，随后在杂交炉中37 °C、样品旋转仪上继续孵育。（I–J）用精细镊子沿尿道片段长度方向轻轻挤压，以分离上皮层。（K）使用精细剪刀将组织剪碎成小片段，将剪碎的上皮组织转移至Accutase消化液中，并在杂交炉中37 °C、样品旋转仪上孵育。（L）使用血细胞计数板和台盼蓝染色对上皮细胞进行计数并评估细胞活力。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过流式细胞术分析尿道上皮和间质区室的单细胞悬液。对来自小鼠尿道混合样本的单细胞制备物进行流式细胞术分析，包括（A）上皮区室和（B）间质区室。通过Ghost Dye V450染色排除死细胞，对活细胞进行设门分析。检测活细胞中CD45（泛免疫标记物）、CD326/EPCAM（泛上皮标记物）以及F4/80（小鼠巨噬细胞标记物）的表达情况。数据代表了两次独立实验的结果，每次实验使用5–6只小鼠的组织混合后制备上皮和间质样本。缩写：SSC-A = 侧向散射峰值面积；FITC = 异硫氰酸荧光素；APC = 别藻蓝蛋白；PE = 藻红蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：尿道上皮类器官的组织学与免疫染色分析。（A）尿道上皮类器官生成流程示意图。（B–G）由单细胞体外扩增不同时间点生成的尿道上皮类器官（UEOs）的代表性明场显微图像。（H）中空型和（I）实心型尿道上皮类器官（UEOs）经苏木精-伊红（H&E）染色后的代表性明场图像。（J）三次独立实验中生成的类器官类型的量化结果。误差线表示均值的标准误。（K）中空型和（L）实心型尿道上皮类器官（UEOs）经上皮标志物KRT13（表层上皮标志物）、KRT5（基底上皮标志物）和P63（基底上皮标志物）免疫染色的代表性图像。单个荧光通道的图像分别显示于K’、K’’、K’’’、L’、L’’和L’’’。（M）中空型和（N）实心型尿道上皮类器官（UEOs）经上皮标志物KRT4（表层上皮标志物）和KRT5（基底上皮标志物）免疫染色的代表性图像。单个荧光通道的图像分别显示于M’、M’’、N’和N”。（O）近端与远端尿道解剖示意图。（P）两次独立实验中从近端和远端尿道生成的类器官类型的量化结果。（Q）从近端尿道和（R）远端尿道分离的上皮细胞生成的第6天尿道上皮类器官（UEOs）的代表性明场显微图像。完整尿道来源类器官的数据代表了3次独立实验，每次实验使用3–5只小鼠的混合样本。（S）近端与远端尿道来源类器官的数据代表了2次独立实验，每次实验使用3–4只小鼠的混合样本。细胞核用DAPI标记（蓝色）。（比例尺：100 µM）。示意图使用BioRender和Adobe Illustrator绘制。在BioRender中创建。Binoy joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：尿道上皮片的整体免疫染色。（A）成年雌性小鼠尿道在最佳切割介质中的10微米冷冻切片，显示小鼠巨噬细胞标志物F4/80（红色）和上皮蛋白E-cadherin/CDH1（绿色）的免疫染色。（A’）为（A）中插图的放大视图。（B）示意图展示分离的尿道上皮片进行整体染色的步骤。对分离的雌性小鼠尿道上皮层进行整体免疫染色，使用针对小鼠巨噬细胞标志物F4/80（红色）和上皮蛋白E-cadherin/CDH1（绿色）的抗体。（C）合并视图的代表性图像。（D）红色通道的正交最大强度投影，显示巨噬细胞的排列。（E–F）上皮及关联巨噬细胞的放大视图。白色标尺，50 µM。灰色标尺，500 µM。数据代表在4–5只小鼠组成的样本池上进行的2次独立实验的结果。示意图使用BioRender和Adobe Illustrator绘制。由BioRender制作。Binoy joseph, D.（2026）https://BioRender.com/tjh9opk 请点击此处查看该图的放大版本。

补充表 1：1x HBSS（无钙、镁）的配制。请点击此处下载该文件。

补充表 2：1x sHBSSa 和 1% 胰蛋白酶溶液的配制。请点击此处下载该文件。

补充表 3：细胞/流式染色缓冲液的配制。请点击此处下载该文件。

补充表 4：尿道上皮类器官扩增培养基的制备。请点击此处下载该文件。

补充表5：马封闭缓冲液的配制。请点击此处下载该文件。

补充文件 1： 两次独立实验中来自尿道上皮和间质区室的单细胞进行流式细胞术实验的细胞计数。请点击此处下载该文件。

补充图 1： 成年雌性小鼠尿道上皮与尿道上皮类器官的比较。 （A）成年雌性小鼠尿道上皮、（B）中空尿道上皮类器官和（C）实心尿道上皮类器官（UEOs）的代表性图像，使用上皮标志物 KRT13（表层上皮标志物）、KRT5（基底层上皮标志物）和 P63（基底层上皮标志物）进行免疫染色。单个荧光通道的图像分别显示于 A’、A’’、A’’’、B’、B’’、B’’’、C’、C’’ 和 C’’’。代表性图像还包括（D）成年雌性小鼠尿道上皮、（E）中空尿道上皮类器官和（F）实心尿道上皮类器官（UEOs），使用上皮标志物 KRT4（表层上皮标志物）和 KRT5（基底层上皮标志物）进行免疫染色。单个荧光通道的图像分别显示于 D’、D’’、E’、E’’、F’ 和 F”。数据代表了3次独立实验的结果，每次实验使用3–4只小鼠的样本合并进行。细胞核用DAPI标记（蓝色）。（比例尺，100 µM）。请点击此处下载该文件。

讨论

机体中的上皮屏障对宿主防御至关重要。这些是具有多种上皮细胞类型及伴随的常驻免疫细胞的特化结构。上皮屏障在发育过程中不断变化，通常在微生物群或环境暴露的刺激下获得宿主防御相关基因的表达。上皮完整性或基因表达的缺陷可能影响宿主防御能力¹⁵。为了理解转录组特征以及研究细胞间连接和上皮完整性，必须对上皮组织进行分离研究。目前尚无详细描述专门优化用于从小鼠雌性尿道分离上皮组织的方法。虽然膀胱上皮可通过单纯的机械分离获得¹⁶，但尿道上皮位于尿道间质管内部，需要结合酶消化与机械分离的方法才能成功分离上皮组织。

本文中，作者介绍了一种从雌性小鼠尿道腔内分离上皮细胞片的优化方法。该方法可用于制备高活力的尿道上皮细胞单细胞悬液，适用于流式细胞术、类器官培养和免疫染色等后续实验。该研究团队此前已证实此方法适用于单细胞RNA测序流程⁵。经过适当修改和进一步优化，本方案也可用于提取其他管状器官的上皮组织，以满足不同的下游应用需求。

该实验方案的关键步骤包括对成年雌性小鼠全长尿道进行精细解剖，从而能够研究其近端-远端轴向上的区域差异。随后，方案采用温和的酶消化法，使尿道上皮层与其周围的间质组织松散分离。通过酶消化使上皮层松动后，可用镊子轻轻挤压尿道管，实现上皮组织的机械分离并释放。研究人员已对胰蛋白酶消化的时间进行了细致优化，能够以高活性（ > 80%）获得完整的尿道上皮组织片层，适用于免疫染色或后续的单细胞分离（图3，补充文件1）。对尿道上皮组织进行单细胞消化后发现，分离物中80–90%为上皮细胞。根据先前的研究，该制备物中的非上皮细胞主要由与上皮相关的免疫细胞和血管内皮细胞组成⁵。当前的单细胞分离方法通过使用细口径针头抽吸进行机械破碎以消除细胞团块，并通过温和裂解去除红细胞，从而获得高质量的单细胞悬液，适用于流式细胞术和单细胞RNA测序等下游应用。

结果表明，该方法可用于富集特定区室的免疫细胞（图3）。还可分别研究从尿道近端和远端分离的上皮组织。此外，作者证明分离的上皮细胞可用于生成尿道类器官，这些类器官具有 此前尚未被描述图4）。这些结果还表明女性尿道类器官生成能力存在区域差异。尽管作者近期的研究已显示雌性小鼠尿道上皮基因表达和免疫细胞分布具有近端-远端差异⁵本研究显示，近端尿道上皮细胞形成的类器官少于从远端尿道分离的上皮细胞图4）。将尿道划分为近端和远端的局限性在于，在解剖过程中缺乏可用于区分这两个区域的解剖学标志。在本研究中，作者通过将尿道长度均分为两部分，以获得近端和远端区室。此处描述的上皮分离方法可用于进一步表征近端与远端尿道上皮在基因表达和细胞组成上的差异。

尽管本文介绍的优化方案具有良好的可及性和可重复性，但某些步骤需要反复练习并仔细校准。特别是本方案所示的解剖方法，要求在保留尿道全长的前提下，小心地从耻骨联合下方分离出尿道管。此外，解剖后必须注意清除附着于尿道背侧壁的任何阴道组织。膀胱颈周围存在的脂肪组织应仔细去除，以减少在后续应用（如单细胞RNA测序）中脂肪细胞 污染的风险。此外，每次使用新的胰蛋白酶批次时，都应仔细优化消化条件，以确保消化效果的一致性。组织过度消化可能导致细胞活力下降。作者已对胰蛋白酶消化时间进行了细致优化，建议在4 °C和37 °C孵育步骤中的消化时间为15–30分钟，具体时间可根据所用酶的批次进一步调整。为了实现高效的单细胞消化，将组织切碎成小块也至关重要。作者采用Accutase进行进一步的单细胞消化，因其可实现温和的细胞解离。若出现细胞活力下降的情况，可缩短Accutase的孵育时间。此外，作者在Accutase消化体系中加入了ROCK抑制剂，以提高细胞存活率。建议使用DNase消化，以降解死亡或濒死细胞释放的胞外DNA，从而减少细胞聚团现象。作者还建议使用红细胞裂解缓冲液，以减少红细胞污染，避免对后续实验结果（如流式细胞术和单细胞RNA测序）造成干扰。

本文所述上皮细胞分离方法的一个局限性在于，该方法已针对雌性小鼠尿道进行了优化。雄性小鼠尿道解剖结构更为复杂，从近端到远端尿道的上皮结构存在变化。此外，该方法仅能分离衬于尿道管腔的上皮细胞。与尿道管腔通过短的上皮导管相连的尿道分泌腺无法被分离，因为这些结构嵌于间质组织中。相反，这些上皮结构在分离尿道上皮层后残留的间质组分中得以富集（图3）。

尽管存在这些局限性，该方法已为了解尿道上皮结构提供了重要见解，并将通过原位可视化上皮相关巨噬细胞，进一步推动对上皮相关免疫细胞的研究。该方法已被证实可与单细胞RNA测序流程兼容，用于鉴定尿道上皮及关联免疫细胞的细胞异质性⁵。此外，能够从尿道近端和远端分离上皮组织，将有助于研究尿道内不同区域的空间差异。尤为重要的是，上皮细胞消化法可获得具有活性的单个细胞，这些细胞能够形成尿道上皮类器官，可用于研究尿道宿主与病原体的相互作用以及上皮生物学特性。总体而言，这些方法丰富了研究工具，有助于更深入地探究尿道上皮生物学。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5 精细镊子
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12 孔板	Corning	3513
30 微米预分离滤器	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		用于制作图版
Adobe Photoshop	Adobe		用于制作图版
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
抗生素/抗真菌剂	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 稀释，用于流式细胞术
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 稀释，用于流式细胞术
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 稀释
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 稀释，用于流式细胞术
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 稀释
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 稀释
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 稀释
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 稀释
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 稀释
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 稀释
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 补充剂	Invitrogen	12587010
牛血清白蛋白 (BSA)，第五组分	Genetix	PG-2330
CD-1 小鼠	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI 溶液	Sigma Aldrich	D5942
D-葡萄糖	Qualigens	Q15405
二甲基亚砜 (DMSO)	Himedia	MB058
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
驴抗鸡 IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 稀释
驴抗小鼠 IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 稀释
驴抗小鼠 IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 稀释
驴抗兔 IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 稀释
驴抗兔 IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 稀释
驴抗大鼠 IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 稀释
驴抗大鼠 IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 稀释
EGF	PeproTech	AF-315-09
伊红	Himedia	GRM938
乙醇	Supelco	1.00983
Eukitt 封片介质	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
带滤帽分选管	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
无水甘油	Merck	DA1P692899
苏木精	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
马血清	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	流式细胞术数据分析
氯化镁 (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
N-乙酰半胱氨酸	Sigma Aldrich	A9165
烟酰胺	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
对羟基苯甲酸丙酯	Sigma Aldrich	P3130
石蜡	Qualigens	Q19215
氯化钾 (KCl)	Qualigens	Q13305
磷酸二氢钾 (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC 裂解缓冲液 (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
视黄酸	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-32
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002
碳酸氢钠 (7.5% w/v 溶液)	Sigma Aldrich	S8761
氯化钠 (NaCl)	Himedia	GRM853
Stero Zoom 体视显微镜	Nikon	SMZ18	用于上皮组织分离
SuperFrostTM PLUS 黏附载玻片	Electron Microscopy Sciences	71896-10
Tris 碱	Hi-Media	MB029
Triton™ X-100	Sigma Aldrich	X100
TrueVIEW 自发荧光淬灭试剂盒	Vector Laboratories	SP-8400-15
台盼蓝	Gibco	15250061
猪胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T4799
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
UltraPure LMP 琼脂糖	Invitrogen	16520-050
二甲苯	Qualigens	Q32295