利用酶联免疫吸附测定法检测人泪膜中的性激素

摘要

本方案描述了一种优化的酶联免疫吸附测定法（ELISA），用于检测和定量通过微毛细管采集的人类泪液中的17β-雌二醇和睾酮。该方法可实现对泪液激素水平的微创测量。

摘要

泪膜是一种复杂的多层液体，对维持眼表健康、视觉清晰度以及抵御病原体和环境应激因素至关重要。泪膜主要由脂质、水样液、可溶性蛋白质和黏蛋白组成，不仅起到润滑和保护眼球的作用，还可作为干眼症（DED）等眼表疾病的重要诊断介质。已知性激素（包括雄激素和雌激素）会影响泪膜的成分，但在泪液中检测这些激素受到样本量少和技术难题的限制。本实验方案详细描述了一种逐步改进商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒的方法，用于检测和定量通过毛细管采集的基础泪液中的17β-雌二醇和睾酮。该工作流程包含了优化的样本采集、稀释及检测前处理策略，以实现对微量泪液样本的分析。本方案验证了采用改良ELISA方法在泪液中检测激素的可行性与可重复性。代表性结果来自合并的预实验样本，旨在展示检测性能而非生物学差异。该方法可为未来将泪液作为眼表研究中激素检测基质的相关研究提供支持。

引言

泪膜在保护、滋养和润滑眼表方面发挥着重要作用¹。健康眼睛的泪膜厚度约为 2–5.5 µm，体积为 3–10 µL，更新速率为每分钟 1–2 µL^2,3。泪腺分泌泪液的水相成分，富含水、电解质、蛋白质和抗菌因子；睑板腺分泌脂质，以减缓泪膜蒸发；结膜杯状细胞则释放黏蛋白，协助眼表的润滑⁴。泪液分泌主要有两种方式：1）基础分泌，用于在健康眼表维持稳定的泪膜；2）反射性分泌，由刺激（如刺激物、情绪或强光）引发。这两种泪液的生化成分存在差异，最终可能影响泪液采集分析所采用的方法^5,6。基础泪液通常含有较高浓度的蛋白质和脂质，有助于维持泪膜稳定性和角膜健康；而反射性泪液含水量更高，成分更稀释，主要用于冲刷刺激物并保护眼表^7,8,9。

由于泪液具有调节炎症、抵御病原体以及为无血管的角膜提供营养等功能¹，已成为生物标志物研究的重点¹⁰。与血液采样相比，泪液采样是一种微创且相对经济的替代方法，尤其适用于监测疾病局部发生的生理变化⁸。为了准确获取这些数据，正确的采集方法至关重要¹⁰。玻璃毛细管被广泛用于采集基础泪液，因其可在最小刺激和泪液稀释的情况下完成采样⁵。该方法通过精确放置毛细管以避免接触球结膜和睑缘，从而最大限度地降低引发反射性流泪的风险，防止泪液成分发生改变^9,11。采用此方法，研究人员可获得未被稀释的基础泪液，真实反映眼表的生理状态。这确保了样本作为定量检测敏感分析物（如性激素^10,12）的可靠介质。然而，所获得的泪液体积有限，给后续的生化分析带来了挑战。使用毛细管采集基础泪液通常每样本仅能获得几微升，限制了其与常规检测方法的兼容性。

人类眼表组织日益被认为是性激素的作用靶点^13,14。支持这一观点的证据包括在泪腺和睑板腺的腺泡细胞，以及角膜、结膜上皮细胞和结膜杯状细胞中检测到雄激素受体（AR）、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的mRNA转录本¹⁵。此外，这些组织中还鉴定出编码类固醇生成酶的mRNA，提示其具备将类固醇前体局部转化为生物活性性激素的能力¹⁶。这表明眼表可能存在原位激素合成，并引发一个关键问题：这些激素是否以可检测的水平分泌进入泪膜？

现有证据表明，性激素在维持眼表稳态中起着关键作用，但其具体的分子机制仍在研究之中^13,14。雄激素（如睾酮）似乎能够促进脂质分泌并抑制炎症反应；因此，雄激素缺乏被广泛认为是蒸发过强型干眼的重要诱因^13,14,17。相比之下，雌激素的作用则更为复杂，且具有情境依赖性^13,14,18。尽管雌激素参与调节泪液成分和泪液量，但其水平波动（如更年期、妊娠期或口服避孕药使用期间发生的波动）常与水样液分泌减少、泪膜稳定性下降以及眼表炎症相关联^19,20。因此，经历此类激素失衡的个体属于干眼病（DED）的高风险人群^13,14,20。

尽管有这些证据，监测干眼病（DED）患者的激素水平仍然存在挑战。具体而言，目前尚不清楚全身血清激素水平是否能准确反映眼部局部的激素水平²¹。这一区别至关重要，因为已有研究表明，眼表组织具有性激素受体以及类固醇生成酶的表达，支持性类固醇激素在局部的合成与代谢¹⁶。这种胞内激素合成能力提示，泪膜中的局部激素浓度可能与循环血清水平存在显著差异¹³。因此，必须直接测量泪液中的激素浓度，以更深入理解激素对眼表的局部作用。然而，由于可用于分析的泪液样本体积极小，此类测量在技术上具有挑战性。尽管已采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等先进的分析方法，以高灵敏度定量血液和泪液中的激素，但 该方法需要专业的仪器设备和技术专长，并非所有研究人员都能轻易获得^21,22。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种广泛用于检测和定量蛋白质、抗体及激素的技术。对于性类固醇等小分子的分析，本实验方案采用竞争性结合模式。在此方法中，泪液样本中存在的未标记激素与酶标记的激素类似物竞争有限数量的抗体结合位点。由于这种竞争关系，所测得的信号强度（以光密度表示）与样本中激素的浓度呈反比；即信号越低，表明目标激素的浓度越高^23,24。

ELISA 在靶向定量方面具有多种实际优势。该方法成本较低且技术门槛不高，可在常规实验室环境中实施，无需使用特殊仪器。此外，ELISA 可在 96 孔板格式中实现高通量筛选，样品前处理步骤少，具有较高的时间效率和良好的可重复性²³。然而，市售的 ELISA 试剂盒通常针对血清或血浆等样本量较大的生物样本进行了优化，其在泪液等小体积样本中的检测性能尚不明确。为克服这一局限性，本实验方案采用了优化的样品稀释和处理策略，以确保激素检测能够在试剂盒的灵敏度范围内进行。

本研究展示了一种可视化实验方案，该方案采用市售的ELISA试剂盒，用于检测和定量通过玻璃毛细管采集的微量人泪液样本中的17β-雌二醇和睾酮。本方案重点介绍了在样本采集、处理及检测准备过程中的实用改进措施，以实现从有限泪液体积中可重复地测定激素含量。本研究旨在建立一个可行的工作流程，将现有的ELISA方法应用于泪液分析。该方法可为未来研究眼表局部激素水平提供基础。

方案

本研究经印第安纳大学机构审查委员会批准（IRB#1908362633），所有参与者在样本采集前均签署了书面知情同意书。

1. 泪膜采集

1. 准备工作
   1. 确定需要采集的泪液体积，需注意酶联免疫吸附测定（ELISA）结果的统计可靠性要求至少进行两次重复实验。
   2. 准备一个1.5 mL微量离心管用于泪膜样本的储存。
   3. 选择合适的微量毛细管用于泪液采集。建议初始使用3.33 µL或5 µL规格的毛细管，若眼表泪液量较少，可更换为更小容量的毛细管。
   4. 准备好微量毛细管套件中配备的橡胶吸头，以便将泪液转移至微量离心管中。
2. 泪液采集
   1. 指导受试者直视前方或轻微向上注视。
   2. 将微量毛细管开口轻柔地置于外眦附近的泪膜弯月面处，以采集基础泪液。
   3. 尽量减少与球结膜和睑缘的接触，以最大程度避免引发反射性泪液分泌。
   4. 将毛细管充满泪液直至完全填满。
   5. 若需进行多次采集，应将各次采集时间安排在24小时内，并尽量在每日相近的时间段进行，以减少激素水平的变异性。
3. 泪液储存
   1. 封闭橡胶吸头顶部的小孔，然后将微量毛细管插入吸头中，同时迅速将毛细管开口端放入微量离心管内，使泪液流出。必要时可轻轻挤压吸头，以尽可能完全地将泪液样本从毛细管中排出。
   2. 盖紧微量离心管盖子，防止液体蒸发。
   3. 使用台式微量离心机在2,000 × g 条件下离心3–5秒，使样本沉降至管底，再进行储存。
   4. 将样本储存在-80 °C条件下，以在分析前维持待测物的稳定性。

2. 睾酮检测

1. 制备睾酮标准品，遵循以下方案
   1. 按照试剂盒说明书操作，确保已备齐用于制备睾酮标准品、质控品和样本的试剂与设备。
   2. 用去离子水或蒸馏水重悬睾酮标准品，配制成100 ng/mL的储备液。确保完全溶解，并静置至少15分钟。
   3. 在实验当天制备睾酮标准品。
   4. 准备6个微量离心管用于标准品稀释，在10 ng/mL的管中加入900 µL校准稀释液，其余各管中加入400 µL。
   5. 用移液器向第一管（10 ng/mL管）加入100 µL 储备液，充分混匀，并在下一次转移前更换吸头。
   6. 从第一管（10 ng/mL管）中吸取200 µL 液体加入下一管（3.33 ng/mL管），充分混匀，更换吸头后重复此步骤，直至最后一管（0.041 ng/mL）。
   7. 注意：完成所有步骤后应得到7个浓度的标准品。校准稀释液作为空白标准（0 ng/mL）。每个制备好的标准品量足以进行两次重复检测。
2. 制备睾酮质控品：低、中、高浓度
   1. 根据质控试剂盒分析证书（COA）中标注的体积，用去离子水或蒸馏水重悬每瓶质控品。
   2. 在使用前，用校准稀释液将每种质控品进行2倍稀释。
3. 样本制备
   1. 从-80 °C取出泪液样本，置于冰上解冻。
   2. 待样本完全解冻后，在室温下短暂离心3–5秒，确保所有样本均沉降至管底。
   3. 将20 µL样本与80 µL校准稀释液混合，每份重复样本总体积为100 µL。
   4. 为保证实验可靠性，计划设置两个重复孔，并设置非特异性结合（NSB）孔以控制背景信号。
   5. 注意：每个样本需在两个孔中进行分析。因此，每位受试者需要40 µL泪液样本用于检测，与160 µL校准稀释液混合，总体积为200 µL。
4. 检测步骤
   1. 准备好所有试剂、工作标准品、泪液样本和质控品。
   2. 从微孔板框架中移除多余的孔板，并将其放回含干燥剂的包装中，于4 °C保存。
   3. 向除NSB孔以外的每个孔中加入50 µL初级抗体溶液（蓝色），用铝箔纸覆盖微孔板。
   4. 将微孔板置于水平轨道振荡器（0.12"轨道）上，于室温孵育1小时，转速设定为500 ± 50 rpm，或使用最接近的可用设置。
   5. 配制足够的洗涤缓冲液，共进行8次洗涤，每次每孔400 µL（3小时孵育前洗4次，孵育后洗4次）。
   6. 吸去各孔内容物，并用洗涤缓冲液洗涤微孔板4次。
   7. 向NSB孔和零标准品孔中各加入100 µL校准稀释液。
   8. 向指定孔中分别加入100 µL标准品、质控品和已制备的泪液样本。
   9. 向每孔加入50 µL睾酮结合物，并通过移液充分混匀。
   10. 将微孔板置于水平轨道振荡器（0.12"轨道）上，于室温孵育3小时，转速设定为500 ± 50 rpm，或使用最接近的可用设置。
   11. 吸去各孔液体，并用洗涤缓冲液洗涤4次。
   12. 在使用前立即配制底物溶液，将显色试剂A与显色试剂B按1:1比例混合，每孔分配200 µL。在加入底物前，务必彻底吸除残留的洗涤缓冲液。
   13. 在配制后15分钟内，向每孔加入200 µL底物溶液。室温避光孵育30分钟，用铝箔纸覆盖以避光。
   14. 按照与加入底物溶液相同的顺序，向每孔加入50 µL终止液。充分混匀各孔，颜色应由蓝色变为黄色。
   15. 在加入终止液后30分钟内，使用酶标仪在450 nm和560 nm波长下测定吸光度。
   16. 注意：制造商说明书推荐参考波长为540 nm或570 nm。本方案中选用560 nm，因所用酶标仪最接近该波长，用于校正背景信号和光学缺陷。
5. 计算
   1. 从450 nm测得的吸光度中减去560 nm（参考波长）测得的吸光度。
   2. 从各标准品、样本和质控品的单次读数中减去NSB平均吸光度，然后计算重复测量值的平均值。
   3. 采用四参数逻辑（4PL）模型拟合数据，绘制标准曲线。
   4. 根据标准曲线插值确定样本中的睾酮浓度。
   5. 应用5倍稀释因子对计算出的浓度进行校正，以反映1:5的样本稀释比例。
   6. 通过计算重复孔间的变异系数（CV）验证测量结果，其值不应超过20%。
      1. 注意：%CV = (标准差/均值) × 100

3. 雌二醇检测

1. 准备雌二醇标准品、对照品和样品
   1. 按照试剂盒说明书操作，确保已备齐用于配制标准品、对照品和样品的试剂与设备。
   2. 使用前将所有试剂和材料恢复至室温。
   3. 实验当天新鲜配制试剂。
   4. 标准品和对照品为即用型。仅分装本次检测所需用量，以减少污染风险，并避免操作过程中反复经历温度变化。
   5. 确保配制六种标准品（编号0–5），其中标准品0代表浓度为0 pg/mL，并包含试剂盒提供的一个对照样品。
   6. 将-80 °C冷冻保存的样品置于冰上解冻。
   7. 离心泪液样品，确保所有样品均位于管底。
2. 检测步骤
   1. 从微孔板上取下多余的孔条，并将其放回含干燥剂的包装中，于4 °C保存。
   2. 向各孔中加入20 µL的标准品、对照品和待测样品。
   3. 注意：每个标准品和样品应设两个复孔。
   4. 为确保均匀分布，在加样前应充分混匀所有标准品、对照品和样品。
   5. 在检测孔中加入160 µL 17β-雌二醇-HRP结合物。
   6. 保留一个空白孔用于底物空白对照。
   7. 将微孔板用铝箔纸覆盖后再放入孵育箱。孔内溶液可能蒸发至铝箔纸上。
   8. 在37 °C孵育2小时。
   9. 在孵育期间，用10倍浓缩洗涤液配制洗涤缓冲液。
   10. 孵育结束后，移去铝箔纸，并吸去孔内液体。
   11. 用洗涤缓冲液洗涤每个孔3次。每次洗涤浸泡时间应> 5秒。
   12. 向所有孔中加入100 µL TMB底物溶液。
   13. 用铝箔纸覆盖整块微孔板，在室温下精确孵育30分钟。
   14. 按照之前加入TMB底物溶液的顺序和速度，向所有孔中加入100 µL终止液。
   15. 轻轻震荡微孔板，试剂颜色由蓝色变为黄色。
   16. 在加入终止液后30分钟内，于450 nm波长处测定吸光度。
3. 计算
   1. 从所有标准品、样品和对照品的读数中减去空白孔的吸光度，以校正背景信号和光学误差。
   2. 计算复孔测量值的平均值。
   3. 采用四参数逻辑拟合（4PL）方法绘制最佳拟合标准曲线。
   4. 根据标准曲线插值确定样品中雌二醇的浓度。
   5. 通过计算复孔间的变异系数（CV）验证检测结果，其值不应超过20%。
      1. 注意：%CV = (标准差/均值) × 100。

4. 使用 R 和 RStudio 进行数据分析

1. 安装 R 和 RStudio，并在进行数据分析之前安装材料表中列出的所需软件包。
2. 将标准品、对照品和样品的光密度测量值导入分析软件。
3. 根据检测要求进行波长校正以预处理数据，然后减去空白或非特异性结合（NSB）值，并计算重复测量值的平均值。
4. 使用四参数逻辑（4PL）回归模型拟合标准曲线，以浓度为自变量，光密度为响应变量。
5. 在 R 中使用 drc 软件包的 drm() 函数进行曲线拟合，模型指定为 fct = LL.4() 以实现 4PL 回归，并输入浓度和光密度数据。
6. 在解释样品浓度之前，验证曲线拟合的质量（例如，R² > 0.99 或拟合优度可接受）。
7. 基于拟合的标准曲线，使用 ED() 函数通过逆向预测计算激素浓度，根据拟合模型指定与样品光密度值相对应的有效剂量。
8. 通过应用适当的稀释因子（例如，1:5 稀释对应 ×5）校正计算得到的浓度。
9. 以适当的单位（例如，ng/mL 或 pg/mL）报告最终的激素浓度，确保与标准曲线一致，并导出处理后的数据以进行进一步分析或可视化。

结果

初步泪膜研究

本研究共纳入20名女性（45–63岁）。干眼症（DED）的分类基于症状及至少一项临床体征。具体而言，所有DED受试者的ocular surface disease index（OSDI）评分>12，且至少一只眼的荧光素泪膜破裂时间（TBUT）<5秒，或角膜荧光素染色评分（CFSS）>3（NEI量表²⁵）。被归类为非DED的受试者需满足OSDI评分<12，双眼TBUT均>5秒，且双眼CFSS均≤3。排除标准包括当前佩戴隐形眼镜者、30天内使用过眼科药物者、眼部感染、结膜瘢痕以及根据自我报告处于妊娠或哺乳期的个体。基础泪液样本通过玻璃毛细管从每位受试者的双眼采集，并在个体层面混合，以增加总样本量。单次采集可获得约5–20 µL泪液，具体体积取决于个体的泪液分泌量。泪液采集在滴加荧光素钠滴眼液之前进行。优化后的用于基础泪液分析的激素ELISA检测方案要求每孔使用20 µL泪液以实现激素检测。为应对可能存在的变异，每个样本均进行双复孔检测，因此每个样本至少需要40 ...

讨论

泪液的采集与分析为评估眼表健康状况以及发现潜在生物标志物提供了便捷的科学途径^10,22。本方案描述了将常用ELISA方法成功应用于泪膜样本中性激素分析的技术改进。我们开发该方法旨在解决泪液分析的主要局限性，即可用泪液量相对较少的问题。通过优化实验流程以适应微量样本的限制，我们在不牺牲激素准确定量所需灵敏度的前提下，实现了可靠检测。

本方案要求每次检测至少需要 20 µL 的分装样本，为确保结果可靠，建议进行样本重复检测，因此每位受试者至少需要 40 µL。由于单次采集通常只能从每只眼睛获得 15 µL 的基础泪液（非干眼者）²⁸ 或每只眼睛 6 µL  的基础泪液（干眼者），因此往往需要进行多次采集。为尽量减少变异，采集应安排在相隔不超过 24 小时的时间内，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
17β 雌二醇 ELISA 试剂盒	Abcam	ab108667
铝箔纸	Reynolds Wrap	10900000154	任何可用于厨房的铝箔纸，用于保护试剂免受光照
微量毛细管 3.33 μL	Drummond	1-000-0033	包含一个挤压球用于液体转移
微量毛细管 5 μL	Drummond	1-000-0050	包含一个挤压球用于液体转移
微量离心设备	Benchmark Scientific	C1012
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
酶标仪	Promega	GM3000
轨道式微孔板振荡器	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
R 编程语言	Posit Software, PBC（前身为 RStudio Inc.）	R version 4.5.1	请通过 https://cran.r-project.org/ 在安装 RStudio 前先下载 R 语言
RStudio 软件	Posit Software, PBC（前身为 RStudio Inc.）	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
R 软件包 "drc"、"ggplot2"、"patchwork"、"ggpp"、"dplyr"、"readr"、"tidyr"、"writexl"	Posit Software, PBC（前身为 RStudio Inc.）		在 RStudio 中安装这些软件包
睾酮对照试剂盒	R&D Parameter	QC165	与 ELISA 试剂盒（KGE010）分开销售
睾酮 ELISA 试剂盒	R&D Parameter	KGE010