一种通过同时采集淋巴管和血管血液评估肝脏转运通路的综合性大鼠模型

摘要

本实验方案描述了一种肝淋巴管插管大鼠模型，可实现对肝脏淋巴系统和血管系统引流的直接且定量的评估。该模型能够同时采集肝淋巴液和全身血液，用于研究肝脏物质转运、代谢及免疫信号传导，支持药物药代动力学和肝脏特异性生物学的研究。

摘要

肝脏是代谢和免疫的核心枢纽，负责处理营养物质、外源性物质以及循环中的免疫介质。这些物质通过血液循环到达肝细胞及其他肝内细胞 通过 接收来自肠道血液的窦状毛细血管 通过 门静脉及体循环 通过 肝动脉。来自肝窦毛细血管的血浆滤液流入狄氏间隙（Disse腔），在此可发生代谢转化、参与免疫监视，或进入淋巴管形成肝淋巴液。采集肝淋巴液和血液有助于深入分析肝脏的物质转运、代谢过程及免疫活性。本文描述了一种大鼠手术模型，可通过三个独立的插管部位同时采集肝淋巴液和全身血液：肝淋巴导管、颈动脉和颈静脉。肝淋巴管和动脉插管可实现连续取样，而颈静脉插管可用于持续补液和液体支持，或用于静脉血采集，从而实现动脉血与静脉血的对比分析。成功插管后，在麻醉大鼠中可获得约0.1 mL/h的肝淋巴液流速，支持持续采集肝淋巴液长达8小时，同时进行动脉和静脉血液取样。该实验装置可直接比较全身动脉血与肝淋巴液流出物，从而全面研究肝脏的物质转运与清除功能，以及代谢和免疫信号传导过程。为进一步拓展该模型，可在实验结束时进行肝动脉和门静脉的终末取样，以实现对肝脏流入血、流出血及淋巴引流的直接比较。最终，这些技术为在多种病理生理条件下评估肝脏功能提供了灵活的平台，包括药物药代动力学、营养物质通量与代谢，以及肝脏特异性反应等。

引言

肝脏是一个核心的代谢和免疫器官，负责营养物质的处理、外源性物质的解毒以及免疫监视。肝脏是体内最大的淋巴液生成器官。在大型哺乳动物中的研究表明，肝脏贡献了全身总淋巴流量的25%–50%^1,2。在啮齿类动物中，导管插管研究显示，大约10%–20%的总胸导管淋巴流量来源于肝脏^3,4。肝淋巴液来源于血浆，经肝实质内窦状毛细血管的有孔内皮滤出。这种滤过液积聚在狄氏间隙（Disse腔），即肝细胞与窦状内皮细胞之间的间质腔隙。随后，滤过液穿过马尔（Mall）间隙，进入门脉淋巴毛细管，再汇入集合导管，最终引流至肝门和乳糜池^5,6。

肝脏淋巴系统在解剖学上分为门静脉、被膜下和小叶下三级淋巴网络^6,7。近期的容积成像研究表明，肝脏淋巴管形成一个高度分支的、血管内皮生长因子C（VEGF-C）依赖性的网络，主要局限于门管区。该网络主要由淋巴毛细血管组成，其引流方向为逆向朝向门静脉。另一方面，被膜下淋巴管和小叶下淋巴管分别沿肝脏表面和中央静脉区域分布，构成额外的引流通路。人类尸体成像进一步揭示沿肝静脉走行存在密集的淋巴管网络，表明门周区与肝静脉周围的淋巴管共同调控肝脏淋巴液的流出⁸。

肝淋巴液是一种来源于血浆的超滤液，能够反映机体的代谢和免疫过程^9,10。生化分析表明，肝淋巴液中含有白蛋白、脂蛋白、细胞因子以及来源于肝实质细胞活动的代谢产物^3,4,6，这与在其他组织中报道的淋巴液总体蛋白质组谱特征一致¹⁰。早期研究表明，肝淋巴液中含有不同类型的脂蛋白，其中高密度脂蛋白（HDL）占主导地位，这与肝脏在HDL合成与重塑中的核心作用相符¹¹。值得注意的是，近期研究发现，与肠系膜淋巴液相比，肝淋巴液中富含HDL和胆固醇酯，凸显其在脂质转运和胆固醇逆向转运中的独特作用³。此外，肝淋巴液还作为免疫传导通路，携带免疫介质、抗原呈递细胞以及细胞外囊泡，将肝脏微环境与全身免疫系统相连接⁹。

肝淋巴液的生成与引流异常是肝脏疾病的关键特征。在肝硬化和门静脉高压中，升高的窦状隙压力可导致淋巴液生成数倍增加，当引流能力达到极限后，可引发淋巴管扩张、纤维化及腹水。慢性肝损伤还可促进由VEGF-C/VEGFR-3介导的淋巴管生成，过度或异常的淋巴系统重塑会加剧肝脏炎症、水肿及脂质蓄积^9，12。此外，在代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）和肝细胞癌中，肝内淋巴管密度的增加已被证实与疾病进展及转移相关^13，14。

尽管肝淋巴在生理和临床上具有核心作用，但由于技术上的挑战难以分离出纯净的肝淋巴，目前在实验研究中仍缺乏充分的研究和探索。胸导管和肠系膜淋巴采集模型已有较广泛的描述，但这些方法仅能间接反映肝脏的转运机制。为解决该领域的局限性，研究人员建立了一种大鼠肝淋巴导管插管模型，实现了肝淋巴的直接采集⁴。利用该方法发现，静脉注射治疗性蛋白质的大部分淋巴摄取发生在肝脏和肠系膜。这些结果表明，肝淋巴是血液与淋巴系统之间大分子交换的关键途径，对生物制剂的药代动力学和体内分布具有重要意义⁴。

为弥补现有研究空白，本研究描述了一种全面的大鼠模型，通过肝淋巴管、颈动脉和颈外静脉插管，实现肝淋巴和全身血液的同时取样。via 该方法可实时评估溶质在肝间质与全身各室之间的跨室转运与交换，为在生理和病理条件下研究肝脏转运、代谢、免疫信号传导及药物分布提供了一个可靠的实验平台。该模型还包括可选的终末取样步骤，即取肝动脉和门静脉血样，以实现对肝脏流入、流出及淋巴引流的直接比较。

图1多插管模型示意图，用于同时采集淋巴液和血液样本。 一种全面的插管模型，可同时从颈动脉、颈静脉、肝动脉、肝淋巴管和门静脉采样。A颈动脉插管用于间歇性采血。B通过插管外颈静脉进行持续生理盐水输注，以维持水合作用并补偿采样过程中的液体丢失。C沿肝淋巴管走行的肝总动脉被插管，用于终末血液采样。D肝淋巴管被插管以持续收集淋巴液。E) 进入门静脉 通过 针刺法用于终末期采血。（所示操作步骤见于A), (B），以及（D在终末取样前进行，随后是（C肝动脉采样，随后（E) 门静脉采样。缩写：EJV，颈外静脉；CA，颈动脉；SVC，上腔静脉；IVC，下腔静脉；Ao，主动脉；CHA，肝总动脉；HL，肝淋巴管；ML，肠系膜淋巴管；SMA，肠系膜上动脉；PV，门静脉。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

所有涉及动物的实验程序均经莫纳什大学药学科学研究所动物伦理委员会（伦理编号 #46283）审查和批准，并严格遵循澳大利亚和新西兰研究与教学用动物福利委员会（ANZCCART）指南以及澳大利亚科学研究用途动物护理与使用规范（澳大利亚国家健康与医学研究理事会）¹⁵ 进行。

动物模型：选用雄性或雌性远交系白化 Rattus norvegicus，即斯普拉格-道利（Sprague–Dawley，SD）大鼠，体重为 250–350 g。动物来自经许可的实验动物供应商（Monash Animal Research Platform），饲养于独立通风笼具中，环境温度控制在（22 ± 2 °C），光照周期为 12 小时明暗循环，实验前可自由进食和饮水。实验前至少适应环境一周，以减少与应激相关的生理变异。

本文描述了一种肝淋巴管、颈动脉和颈外静脉插管模型，可实现肝淋巴液和全身血液的同步采集。在麻醉条件下，可选择性地进行肝动脉和门静脉的终末采样，以对比分析肝脏的流入与淋巴系统的流出情况。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 手术前一天的准备工作

1. 根据具体实验方案要求，对大鼠进行过夜禁食。始终确保其自由饮水。
2. 准备无菌生理盐水，用于淋巴液采集期间的静脉输注。根据采集持续时间（通常为 3–5 小时）和建议输注速率（1.5–3.0 mL/h）确定所需液体体积，以补充因淋巴液和血液采集以及尿液排出等生理损失所丢失的体液。
3. 按以下步骤准备用于肝淋巴管、颈动脉和颈外静脉插管的三根聚乙烯导管：
   1. 肝淋巴管
      1. 将外径（O.D.）0.8 mm、内径（I.D.）0.5 mm 的导管剪成 30–35 cm 长，确保长度足以在无张力状态下完成采集。
      2. 使用无菌手术刀片将插入端斜削成约 45° 角，以便插入。
   2. 颈动脉
      1. 将外径（O.D.）0.8 mm、内径（I.D.）0.5 mm 的导管剪成 20–30 cm 长。从导管内端起约 2–2.5 cm 处做标记，以指示插入深度。
   3. 颈外静脉
      1. 将外径（O.D.）0.8 mm、内径（I.D.）0.5 mm 或外径（O.D.）0.96 mm、内径（I.D.）0.58 mm 的导管剪成 50 cm 或更长。从导管内端起 1–1.5 cm 处做标记，以指示插入深度。确保导管长度足以在无张力状态下连接至输液泵。
4. 准备抗凝剂溶液，可选用含 0.1% EDTA 的无菌水溶液或含 20 IU/mL 肝素的无菌生理盐水溶液。
5. 用抗凝剂溶液填充 1 mL 注射器，并将 25G 针头连接至外径 0.8 mm 的导管，或将 23G 针头连接至外径 0.96 mm 的导管。
6. 用约三倍于导管内体积的抗凝剂冲洗每根导管，确保无气泡残留。
7. 将导管内充满抗凝剂，并用连接好的针头和注射器封堵，过夜保存。预先用抗凝剂浸泡可最大限度减少血栓形成。
8. 准备用于血液和淋巴液采集的收集管。加入抗凝剂溶液，使样本采集后终浓度达到 1 mg/mL EDTA 或 10 IU/mL 肝素。

2. 手术前的即时准备工作

1. 用抗凝剂冲洗所有套管以确认通畅性，确保无气泡存在。
2. 在诱导室中，使用1 L/min的氧气携带5%异氟烷对大鼠进行麻醉诱导。
3. 监测呼吸，确保呼吸频率减慢至约每秒1.5次（约90次/分钟），表明麻醉深度已足够。
   注意：异氟烷是一种挥发性麻醉剂，应在通风良好的麻醉系统或通风橱中使用，以尽量减少职业暴露。
4. 将大鼠转移至加热的手术垫（37°C）上，并以0.4–0.6 L/min的流速吸入1–3%异氟烷与氧气混合气体维持麻醉 通过 鼻锥
5. 通过角膜反射和夹趾反射消失确认麻醉深度充分。在整个手术过程及淋巴液采集期间维持麻醉状态。
   注意：持续麻醉对于防止手术期间疼痛以及因动物活动导致导管移位至关重要。
6. 剃除手术区域的毛发，包括右侧腹部象限（从正中线至右侧侧腹，约在肋缘下2 cm）以及右侧或左侧锁骨区域。
7. 使用0.5%氯己定对所有手术区域进行消毒，随后使用70%乙醇。

3. 颈动脉插管

注意：颈动脉插管可在颈静脉插管之前或之后进行。两个操作可使用相同的颈部切口。

1. 将大鼠置于仰卧位，颈部伸展。在颈部做一长度为1–1.5 cm的切口，以暴露手术区域。
2. 在颈部下方放置一个小支撑物（例如3 mL注射器），以抬高颈动脉区域。
   注意：此步骤为可选操作。
3. 分离颈部肌肉，暴露位于皮肤表面下方约1 cm处的颈动脉。
4. 使用弯头虹膜镊分离动脉，辨认并轻柔分离邻近的迷走神经，以避免神经损伤。
5. 将直头格拉夫镊置于动脉下方以阻断血流，并在其下方穿入两根4-0丝线。将近端（头侧）缝线牢固结扎。
6. 在动脉表面做一小切口。
7. 用眼科镊尖部轻轻提起血管瓣，以稳定血管腔，便于插入导管。
8. 将导管插入至预先标记的2–2.5 cm深度。可有少量回血；若回血过多，应重新阻断并清洁后继续操作。
   警告：血管穿刺和插管操作涉及锐器，需谨慎操作，防止意外损伤。
9. 通过轻柔回抽少量血液，并将抗凝溶液无阻力地注入导管内，且未见皮下肿胀，以确认导管位置正确。
10. 用缝线固定导管，并用塞子封闭其外端。
11. 颈动脉插管完成后，可在维持麻醉状态下短暂暂停操作。
12. 使用无菌缝线缝合颈部切口。图2展示了颈动脉分离及成功插管的示意图。

图 2：颈动脉插管。（A）位于颈动脉两侧的成对颈部肌肉（橙色箭头）。唾液腺（蓝色箭头）被向上翻至头侧。（B）暴露的颈动脉位于皮肤表面下约 1 cm 处。唾液腺（蓝色箭头）被向上翻至头侧。（C）插入导管前的手术设置，显示使用直型格拉费镊子阻断血流，并用两条丝线结扎隔离颈动脉，其近心端已结扎封闭。（D）约 2 cm 长的导管成功插入颈动脉内（黄色箭头）。颈动脉导管由绿色箭头指示。（E）通过将血液吸入导管内确认颈动脉插管成功。（F）在颈动脉和导管周围打三个结（4-0 缝线）以固定装置（紫色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 颈静脉插管

1. 将大鼠保持仰卧位，颈部伸展，头部轻微向左偏转。
2. 利用已有的颈部切口，通过位置和可见的血流识别锁骨上方的颈外静脉。
3. 钝性分离皮下组织以暴露静脉。
4. 使用弯头虹膜镊将静脉与周围结缔组织分离，并通过将镊子置于静脉下方确认分离完成。
5. 在暴露段静脉的两端下方各放置一根4-0丝线缝合线。结扎近头端（上方）的缝线以牢固阻断血流。
6. 为防止血液反流，在静脉下方放置直头Graefe镊子，并将镊柄置于注射器或支撑物上固定。
7. 使用虹膜剪在分离段静脉的三分之一处上方做一小切口（约1 mm）。
8. 用显微镊尖轻轻提起血管瓣，以稳定血管腔，便于插入导管。
9. 用虹膜镊将导管尖端插入切口，并推进至预先标记的深度（1–1.5 cm）。
10. 导管稳定后松开阻断，恢复血流。
    注意：应保持稳定握持，防止静脉反流。若发生出血，应立即重新阻断，清理术区后继续操作。
11. 通过轻柔回抽少量血液，并将抗凝溶液注入导管内，若无阻力且未见皮下肿胀，则可确认导管位置正确。
12. 在导管的近端和远端分别用缝线固定。
13. 暂时阻断外部导管，取下注射器，并用塞子封闭导管。
14. 用温盐水浸湿的纱布覆盖切口，直至完成颈动脉插管。颈外静脉分离与插管的代表性图像见图3。

图3：颈外静脉插管。（A）颈外静脉（黑色虚线轮廓）位于锁骨上方皮下浅层。可观察到已建立的颈动脉插管位于颈外静脉附近（绿色箭头）。（B）使用两条丝线将颈外静脉游离，近端结扎。（C）约1 cm长的导管成功插入颈外静脉（黄色箭头）。蓝色箭头指示颈外静脉导管位置，绿色箭头指示颈动脉导管位置。（D）在颈外静脉及导管周围打三个结（4-0线）以固定导管（紫色箭头）。通过顺利注入生理盐水确认颈外静脉插管成功。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 肝淋巴管插管

1. 将大鼠置于仰卧位，在手术显微镜下进行操作。
2. 从腹中线至右侧腹侧做一长度为 4–5 cm 的横向皮肤切口，切口位置约在肋缘下 1.5–2 cm 处（图 4A，B）。
3. 牵开皮肤，并在腹外斜肌和腹内斜肌上做相应切口。
4. 遇到较大的血管时应予以电凝或结扎，以防止大量失血。
5. 使用生理盐水浸湿的棉签轻柔地移动器官：将肝脏推向膈肌方向，胃向左移动，小肠向下移动。
6. 用浸有生理盐水的纱布保持器官处于牵开状态。切口位置及器官排列方式见 图 4C。
7. 利用已知的解剖标志识别肝淋巴管（直径约 0.6 mm）。该导管与肝动脉平行，略偏尾侧，位于右肾内侧，紧邻下腔静脉。
8. 观察肝淋巴管的外观，通常呈半透明且较细。
9. 注意将肝淋巴管与肠系膜淋巴管区分开，后者因含有乳糜微粒而通常较大且呈不透明或白色。因此，肠系膜淋巴管可作为解剖标志，辅助识别位于其头侧的肝淋巴管。
10. 使用直型 Graefe 镊子去除覆盖在淋巴管和下腔静脉上方的结缔组织。
11. 将直型 Graefe 镊子插入右肾下方的脂肪组织中，在下腔静脉下方建立一条通路。向前推进直至镊尖从下腔静脉对侧下方穿出，方向与肝淋巴管平行。
12. 用直型 Graefe 镊子夹住已准备好的导管外端，并将其拉过在下腔静脉下方建立的隧道，直至导管尖端从对侧穿出。
13. 使用 Halsted-Mosquito 止血钳将 25G 针头尖端弯成约 90°。用弯曲的针头从右侧（靠近操作者一侧）穿刺肝淋巴管。
    警告：穿刺淋巴管时操作锐利针头需格外小心，以防意外损伤。
14. 确保导管内充满抗凝溶液且无气泡。将斜面端插入导管内约 2 mm。
15. 观察导管外端是否有淋巴液流出（约 100 µL/h）。若未见流动，应调整或重新插入导管。
16. 确认淋巴液流动后，先堵住导管，再在穿刺部位滴加少量兽用粘合剂以固定。待粘合剂干燥后，再次确认淋巴液是否顺利流经导管。
17. 移除纱布，将器官复位至原始位置。
18. 将含有抗凝溶液的收集管置于导管出口下方，确认淋巴液以滴状流入管内。
19. 依次缝合腹内斜肌、腹外斜肌和皮肤层，关闭腹壁。肝淋巴管的识别与成功插管见 图 5。
    注：成功完成肝淋巴管插管后，可在维持麻醉和补液的情况下短暂暂停操作，再开始淋巴液收集。

图4：肝淋巴管暴露。（A）解剖标志，指示在右侧肋骨下方1.5–2 cm处进行切口。（B）切开皮肤和腹壁肌肉，暴露腹腔内脏器。（C）重新安置器官以暴露肝淋巴管。将肝脏向上推至膈肌方向，胃部移至动物左侧，小肠向下折叠。肝淋巴管位于肝动脉（绿色箭头）与肠系膜动脉（蓝色箭头）之间。L：肝脏；SI：小肠；IVC：下腔静脉；RK：右肾。请点击此处查看该图的放大版本。

图5肝淋巴管的识别与插管 (A重新定位器官后、在去除周围结缔组织之前，可观察到淋巴管和动脉结构。肝动脉（绿色箭头）位于相邻肝淋巴管（黄色箭头）的头侧。肠系膜淋巴管（紫色箭头）位于肠系膜动脉（黑色虚线轮廓）上方。这些结构与下腔静脉呈垂直走行。IVC：下腔静脉；RK：右肾。B) 清除周围结缔组织后，可清晰观察到肝淋巴管（黄色箭头）。肝淋巴管与肝动脉（绿色虚线轮廓）平行走行，并位于肠系膜淋巴管（紫色箭头）和肠系膜动脉（黑色虚线轮廓）的头侧。C将套管（白色箭头）插入肝淋巴管（黄色箭头） 通过 淋巴管上的微小穿刺孔（橙色箭头）。肠系膜淋巴管（蓝色箭头）可见。 请点击此处查看此图的放大版本。

6. 术后阶段

1. 成功进行肝淋巴管插管后，立即通过颈静脉插管以每小时1.0–2.0 mL的速度输注无菌生理盐水，开始补液。
2. 在整个淋巴液采集过程中持续输注。或者，可进行再水化处理 通过 胃或十二指肠插管，以便保留颈静脉插管用于必要时的静脉采血。
3. 在整个采集期间，将动物置于加热的手术垫（37°C）上并保持麻醉状态。
4. 在整个实验过程中，通过观察呼吸模式和反射反应来监测呼吸频率和麻醉深度，同时维持异氟烷麻醉。 通过 鼻锥
5. 通过持续输注生理盐水（1.0–2.0 mL/h）维持水化状态 通过 颈静脉插管
6. 为尽量减少生理干扰，终端取样前采集的血液总量被限制在 <根据机构动物伦理指南，相当于估计循环血量的10%。
7. 将肝淋巴液持续收集至含抗凝剂的试管中。每小时或根据需要更换收集管。
8. 在指定时间点采集动脉血样本：
   1. 暂时夹闭外部管路，并连接一个空注射器。
   2. 抽血直至管路充满。
   3. 更换新的注射器用于样本采集，在每个指定的采样时间点抽取约100–200 µL动脉血。
   4. 每次采集后用抗凝剂溶液冲洗导管。
   5. 用塞子封闭套管。
9. 样本采集完成后，可选择对肝动脉和门静脉进行终末取样，或使用戊巴比妥钠人道处死大鼠。>100 mg/kg 通过 颈动脉或颈静脉导管

7. 肝动脉和门静脉的终末取样

1. 在完成淋巴液和血液采集后，应维持深度麻醉，并确保呼吸稳定，再进行终末血管取样。
2. 小心重新切开腹部切口，以暴露上腹部腔隙。
3. 用生理盐水浸湿的纱布将肝脏轻柔地向膈肌方向牵拉，胃向左侧牵拉，小肠向下牵拉，以暴露已插管的肝淋巴管。
4. 识别肝动脉，该动脉与肝淋巴管平行且位于其尾侧。
   注意：动脉比门静脉更细、颜色更苍白，且血流搏动性更强。
5. 准备一根外径0.61 mm、内径0.28 mm的聚乙烯导管，预先充满抗凝剂溶液，并确保无气泡。
6. 使用弯型虹膜镊分离肝动脉的一小段，并在其下方放置一根4-0丝线缝线。
7. 轻轻提起动脉，在第一根缝线的远端放置第二根缝线。结扎远端缝线以控制回流， proximal suture 暂不打结，留待后续闭合时使用。
8. 使用尖头显微剪刀，在缝线之间的动脉壁上做一个小的横向切口（约0.5 mm）。
9. 用Dumont镊子的尖端轻轻提起血管瓣膜，以稳定血管腔，便于插入套管。
10. 将聚氯乙烯导管的斜面端插入开口处，并向前推进约2–3 mm。
11. 用近端缝线将血管和套管一并结扎固定。
12. 通过观察搏动性血流进入导管，或轻柔抽吸少量鲜红色动脉血，以确认导管位置正确。
13. 将0.5–1 mL血液收集至预先标记并含有抗凝剂的试管中。
14. 采集后，撤出套管，通过收紧两条缝线实现止血。肝动脉暴露与插管操作步骤如图所示 图6.
15. 识别门静脉，它位于肝动脉的内侧，且与肝动脉垂直走行。与肝动脉相比，门静脉直径较大，颜色较深。
16. 将一支预先用抗凝剂溶液冲洗过的1 mL注射器安装23G或25G针头。
17. 以针尖斜面朝上，与血管呈浅角度（约20°–30°）插入门静脉，以避免血管塌陷或撕裂。
18. 轻柔地吸取所需的血液体积。
19. 由于门静脉穿刺为终末性操作，样本采集后应立即实施人道处死动物 >100 mg/kg 戊巴比妥钠 通过 动物仍处于深麻醉状态时，对颈动脉或颈静脉进行插管。门静脉位置及终末取样方法如图所示。 图7.
    警告：戊巴比妥钠为管制药品，应根据机构规定及适当的安全规程进行操作和使用。
20. 根据《澳大利亚科学研究用动物护理与使用规范》（NHMRC）要求，在处理动物尸体前，须通过呼吸和心脏活动停止确认动物死亡。¹⁵ 以及 ANZCCART 指南。

图6：肝动脉的识别与插管。（A）暴露肝动脉（绿色箭头）。肝动脉位于肠系膜淋巴管（黑色虚线轮廓）旁，与下腔静脉垂直。IVC：下腔静脉；L：肝脏。（B）使用弯头镊子分离肝动脉。（C）成功将0.61 mm × 0.28 mm的聚乙烯导管（橙色箭头）插入肝动脉（绿色箭头，紫色箭头所示），并用4-0丝线固定，用于终末动脉采血。可观察到肠系膜淋巴管（黑色虚线轮廓）。PV：门静脉。（D）导管固定后，通过抽吸血液进入导管以确认其通畅性。请点击此处查看本图的放大版本。

图 7：门静脉识别与终末取样。（A）门静脉（由25G针头指示）位于肝动脉（白色虚线轮廓）和胆管（黑色虚线轮廓）之间。门静脉比肝动脉更粗且颜色更深，在深度麻醉下进行穿刺，用于终末血液采集。PV：门静脉；IVC：下腔静脉；L：肝脏；SI：小肠；RK：右肾。（B）将25G针头成功插入门静脉（黑色虚线轮廓）以进行终末静脉血取样。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

方案部分所述的手术入路可清晰识别位于右肾内侧、并与腹腔干和肝动脉平行走行的肝淋巴管，这与先前报道一致⁴。典型的解剖结构和插管操作如图5所示。成功插管的标志是立即出现从澄清至微浊的淋巴液，且无乳糜微粒引起的乳白色污染，提示其与肠系膜淋巴液混合极少。该观察结果与已报道的肝淋巴液特征相符³。肝淋巴液的鉴定依据其相对于肝动脉和下腔静脉的解剖位置，以及其特有的澄清外观，与通常呈不透明或乳白色的肠系膜淋巴液形成明显区别。

在整个采集期间，肝淋巴液流量应保持稳定，平均速率约为 0.1 mL/h^3,4,11。在麻醉条件下，肝淋巴液流量通常在插管后约 2–3 小时内保持最稳定，但在理想的实验条件下，采集时间可能延长至约 6–8 小时。以往研究中报道的代表性淋巴液流量值⁴汇总于表 1。肝淋巴液流量通常低于麻醉大鼠肠系膜淋巴管和胸导管淋巴液流量的报道值。

淋巴部位（清醒状态）	平均淋巴流速（mL/h）
胸导管淋巴（清醒）	1.74 ± 0.33
胸导管淋巴（麻醉）	0.65 ± 0.10
肠系膜淋巴（麻醉）	0.45 ± 0.11
肝淋巴（麻醉）	0.12 ± 0.02

表1：清醒和麻醉大鼠经胸导管、肠系膜和肝淋巴管插管的平均淋巴流速（mL/h）。 数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，n = 3–5 只大鼠。改编自 Yadav 等（2018）⁴ 的表3。

展示大分子淋巴转运的代表性结果如图所示 图8这些实例表明，该模型可用于评估治疗性大分子静脉给药后淋巴系统的恢复情况，所用分子包括约60 kDa的聚乙二醇化干扰素α2a（IFN-PEG40）、约31 kDa的聚乙二醇化干扰素α2b（IFN-PEG12）以及单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab），提示肝脏是大分子治疗药物外渗并进入淋巴系统的主要部位⁴.

图8：静脉注射大分子治疗药物在胸导管、肠系膜和肝淋巴中的淋巴回收情况。 静脉注射不同分子量的聚乙二醇化干扰素（IFN-PEG12 和 IFN-PEG40）及一种单克隆抗体（曲妥珠单抗）后，在胸导管、肠系膜和肝淋巴中回收的总剂量百分比。数据表示8小时内剂量回收的平均值 ± 标准误（SEM）。 改编自 Yadav 等（2018）⁴。 请点击此处查看该图的放大版本。

该模型还可实现对肝淋巴液的详细脂蛋白谱分析³。图9展示了淋巴液脂质组成的代表性分析结果。与胸导管淋巴液和肠系膜淋巴液相比，肝淋巴液的总脂质含量显著较低，但其蛋白质浓度与其他来源的淋巴液相当。肝淋巴液的脂蛋白分析突显了肝脏在脂质转运和胆固醇逆向转运中的独特作用。代表性脂质组成数据汇总于表2。肝淋巴液的高密度脂蛋白（HDL）富含胆固醇酯，肠系膜淋巴液的HDL以富含甘油三酯为主，而胸导管淋巴液的HDL则含有相对较高的磷脂含量。这些组成差异表明不同淋巴来源在脂质代谢与转运中具有各自独特的作用。

	质量百分比（%wt/wt）
组分	磷脂	游离胆固醇	胆固醇酯	甘油三酯
肠系膜淋巴液
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
肝淋巴液
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
胸导管淋巴液
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
血浆
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

表2：从肠系膜、肝脏和胸导管淋巴液及血浆中分离出的密度高密度脂蛋白（D-HDL）和轻度高密度脂蛋白（L-HDL）组分的脂质组成。数值表示磷脂、游离胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯占总脂质组分的重量百分比（% wt/wt）。数据以均值±标准误（SEM）表示。改编自Gracia等（2020）³的表1。

图9：肠系膜、肝和胸导管淋巴液的蛋白质与脂质组成。 肠系膜、肝和胸导管淋巴液中蛋白质与总脂质的比例含量。脂质含量包括磷脂（PL）、甘油三酯（TG）、胆固醇酯（CE）和游离胆固醇（FC），以脂质重量占蛋白质和脂质总重量的百分比表示。数据以均值 ± 标准误表示。 改编自 Gracia 等（2020）³。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

肝淋巴管插管是一种技术上较为困难的操作，即使对于经验丰富的显微外科医生而言亦是如此。若干关键步骤可提高保持淋巴管完整性和实现稳定淋巴液流的可能性。在识别和分离肝淋巴管时（方案步骤5.7–5.10），首先应清除覆盖在门脉淋巴管及下腔静脉近肝淋巴管区域的结缔组织和脂肪组织。与较厚且不透明的门脉淋巴管相比，肝淋巴管呈半透明状且更为脆弱，若直接操作极易发生破裂。门脉淋巴管可作为重要的解剖学标志，因其表面组织清除后，位于其上方的肝淋巴管即可显露。由于肝淋巴管常存在弯曲或折叠，操作者应选择一段较平直的部位进行插管，并使导管方向与淋巴管自然走向平行，以最大限度降低阻塞或撕裂的风险（步骤5.11–5.14）。

插管操作本身是决定成功与否的最关键因素。在穿刺导管后（步骤5.13），可通过将镊子尖端插入开口并确认仅有一层血管壁覆盖在器械上方，从而直观地验证是否进入管腔内。若出现两层相对的管壁，则提示为贯穿性穿刺。一旦确认进入管腔，应沿相同角度将导管平稳推进导管内。操作时需注意避免损伤邻近血管结构，因为术区出血可能导致血液进入淋巴收集导管，污染样本并显著增加血凝块形成的风险。在建立淋巴液流后（步骤5.15），应将导管的收集端封闭，并小心涂抹兽用粘合剂，防止其进入管腔内部。同时还须检查导管内是否存在气泡，因为滞留的空气会增加回压，可能阻碍淋巴液流动。由于肝淋巴液是在低驱动压力下生成的，因此导管的收集端应始终置于手术部位水平以下，以利于通过重力作用促进引流。

成功的肝淋巴管插管以淋巴液立即开始流出为标志。一旦建立，肝淋巴通常以约 0.1 mL/h 的速度稳定流出数小时。流速可能因动物的解剖结构、生理状态及实验条件而有所变化。例如，本方案中淋巴液是在异氟烷麻醉下采集的。异氟烷麻醉可能影响与淋巴功能相关的生理参数，因此在解释淋巴生成速率时应考虑涉及麻醉的实验条件¹⁶。肝淋巴管插管需要开腹手术并对腹部淋巴管进行精细的显微外科操作，因此在此模型中无法从清醒大鼠采集淋巴液。既往比较麻醉与清醒状态下淋巴运输或使用不同麻醉方案的研究表明，麻醉可能轻微影响绝对淋巴流速，但不会显著改变整体淋巴运输模式⁴。因此，本模型中获得的淋巴流速数据应在麻醉实验条件下进行解读。

在收集过程中，流量逐渐减少或停止通常是由于导管内形成血凝块所致，原因可能是血液污染或纤维蛋白沉积。有时可通过定位血凝块并用精细镊子轻轻夹捏导管，以机械方式破碎凝块，或通过导管的收集端轻轻抽吸以移除阻塞物，从而恢复流量。如果阻塞仅限于导管外部部分，可在血凝块近端将导管剪断，并使用无菌硅胶连接器重新连接至新的导管。如果血凝块在插管部位形成，则通常需要重新插管。在此类情况下，可尝试极其小心地去除粘合剂，以避免导管或邻近血管破裂。在重新尝试插管前必须实现止血，因为即使少量血液渗入导管，也会显著促进低压肝淋巴系统内的凝血。

生理因素也会影响淋巴液的流动和通畅性。即使在基础状态下，大鼠肝淋巴液的流速也天然慢于肠系膜或胸导管的淋巴流速^17,18。此外，与清醒、自由活动的大鼠相比，全身麻醉可降低其他淋巴回路中的淋巴流速¹⁹。由于肝淋巴管插管需要麻醉和剖腹手术，这些因素可能导致在长时间收集过程中出现相对较低的流速以及更易发生凝血的现象。在收集期间通过颈静脉或胃肠道插管维持水化状态，有助于稳定淋巴流速并减少血凝块形成。在本模型中，通常可维持稳定的肝淋巴流速达2–3小时，此后流速可能下降，凝血风险也更高。然而，在最佳实验条件下，淋巴收集可维持更长时间，最长可持续约8小时⁴。

通过采集肝动脉和门静脉样本（图6 和 图7），可直接比较肝脏流入血、淋巴流出液与全身循环，从而拓展了该模型的应用范围。这一终末期采样步骤能够在单个动物体内同时评估肝微血管转运和间质清除情况。此类比较有助于深入理解溶质在肝血管系统与淋巴系统之间的分布特征，尤其适用于依赖间质扩散的大分子物质或亲脂性化合物。

尽管存在这些挑战，肝脏淋巴管插管模型仍是一种有价值且信息丰富的技术。肝脏贡献了全身淋巴液流量的很大一部分，而肝脏淋巴液中含有来源于肝间质液的蛋白质及其他成分。通过采集直接来自肝脏的淋巴液，该模型能够分析在经胸导管与肠系膜及体循环淋巴液混合稀释前离开肝脏的分子和细胞。对肝脏淋巴液的生化分析有助于了解肝间质代谢和脂质转运过程^12，20。这补充了门静脉或体循环血液所提供的信息，后者反映的是肝代谢与肝外交换的综合效应。尤为重要的是，该实验设计结合了肝脏淋巴管、颈动脉和颈静脉插管，可动态评估肝脏流出物与血管流入物之间溶质梯度的变化，从而更全面地揭示肝脏的转运与清除过程。

既往利用该模型的研究表明，肝淋巴取样可实现对大分子治疗药物淋巴回流的评估，并可比较肝淋巴与全身循环之间的溶质转运。结合肝淋巴插管、同步血管取样及生化分析，该模型为研究肝微血管及间质动态提供了可靠的实验平台。该模型能够同时评估肝转运、代谢、脂质处理及免疫信号传导，并可经适当调整用于探究代谢相关脂肪性肝病（MASLD）或肝炎症等病理生理状态下的变化。

综上所述，这种经过优化的手术模型整合了肝淋巴管、肝动脉和门静脉通路，为研究肝脏物质转运途径提供了一种全面且可重复的方法。该模型可直接比较血管灌注、间质液流出及淋巴引流，有助于深入探究肝脏特异性的转运、代谢及药代动力学过程的机制。此外，采集肝淋巴液的能力为研究免疫细胞和抗原从肝脏的迁移提供了独特机会，对理解肝脏免疫监视、炎症反应及免疫耐受机制具有重要价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗凝溶液（EDTA 0.1%）	Invitrogen	AM9261	防止导管和采集样本中形成血凝块
抗凝溶液（肝素 20 IU/mL）	Pfizer	00409-2723-01	防止导管和采集样本中形成血凝块
氯己定（0.5%）	McFarlane Medical	12120-OR	用于手术部位消毒
收集管（微量离心管）	Greiner Bio-One	616201	用于淋巴液和血液采集
棉纱布	Winc Australia	18874125	用于器官操作和保持湿润
棉签	Pacific Laboratory	1005199	用于手术过程中器官复位
弯型虹膜镊	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	用于血管分离和组织操作
Dumont 镊子	Fine Science Tools	11251-35	用于打开并稳定肝动脉管腔，以便插入导管
乙醇（70%）	Ajax	AJA214-2.5PL	用于手术部位消毒
Halsted-Mosquito 止血钳	Fine Science Tools	13009-12	用于弯曲25G针头，以穿刺肝淋巴管
加热手术垫（37 °C）	Ratek	IC-WT1	维持手术期间的体温
诱导室	Darvall	1859	用于初始麻醉诱导
输注泵	Adelab Scientific	NE-300	通过导管提供受控的生理盐水输注
虹膜剪刀	Stark Medical	E-AC985-11	用于皮肤和肌肉切口
异氟烷	Provet Pty Ltd	ISOF07	吸入性麻醉剂，用于麻醉诱导和维持
Kelman-McPherson 眼科镊	ProSciTech	TY-1301	用于打开并稳定颈静脉和颈动脉管腔，以便插入导管
针头（23G × 1"）	Livingstone	DN23GX1.0LV	用于门静脉穿刺和采血
针头（25G × 1"）	Livingstone	DN25GX1.0LV	用于导管冲洗和肝淋巴管穿刺
鼻罩麻醉系统	Darvall	7885	维持手术期间的麻醉状态
带流量计的氧气供应装置	BOC	400NE	异氟烷麻醉的载气
聚乙烯导管（外径 0.8 mm，内径 0.5 mm）	Microtube Extrusions	PE8050	用于颈动脉、颈静脉和肝淋巴管插管
聚乙烯导管（外径 0.61 mm，内径 0.28 mm）	Microtube Extrusions	PIV6128	用于肝动脉插管
丝线缝合线（4-0）	SMI AG	SM8015	用于固定血管和导管
戊巴比妥钠	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	用于安乐死（>100 mg/kg）
无菌生理盐水（0.9% NaCl）	FreeFlex	K690531	用于再水化和冲洗
直型Graefe镊	Fine Science Tools	11150-10	用于精细的血管分离
手术显微镜	Zeiss	Stemi 2000-CS	用于肝淋巴管插管过程中的可视化操作
无菌手术刀片（用于手术刀）	Livingstone	SBLDCL15	用于制备导管尖端斜面
注射器（1 mL）	Terumo	19032-TE	用于冲洗导管
注射器（3 mL）	Terumo	19048-TE	用于采血
注射器（30 mL）	Terumo	19034-TE	用于生理盐水输注
Vannas剪刀	Fine Science Tools	91500-09	用于血管切口
兽用组织粘合剂	3M	1469SB	用于固定肝淋巴管导管