本研究通过动物实验证实了生陷祛瘀汤对心力衰竭的治疗作用。采用超高效液相色谱-质谱联用技术及网络药理学分析，鉴定了其潜在的治疗靶点和作用机制。
本文内容
摘要
摘要
生心区域汤（Shengxian Quyu decoction，SXQY）被认为是一种治疗心力衰竭（HF）的潜在治疗策略，但其治疗机制尚不明确。本研究探讨了SXQY在心力衰竭中的治疗作用及其潜在机制。采用横主动脉缩窄术（TAC）建立大鼠心力衰竭模型，并给予SXQY治疗。通过经胸超声心动图评估心脏功能，采用苏木精-伊红染色和马松三色染色评价心肌结构及纤维化程度。利用超高效液相色谱-串联质谱技术对血清样本进行非靶向代谢组学分析。将入血成分映射至靶点，并结合蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析，筛选出与HF相关的交集靶点，随后进行基因本体（Gene Ontology）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。结果显示，SXQY显著改善了TAC大鼠的心脏功能，表现为舒张期左心室内径和舒张期左心室后壁厚度降低，左心室射血分数升高，同时减轻了心肌肥厚、炎症反应和纤维化。共鉴定出563种入血化合物（其中原型成分367种，代谢产物196种），在中药系统药理学数据库中筛选出5种关键活性成分，对应63个靶点。网络分析揭示了44个交集基因，其中以芒柄花素（Formononetin）、知母皂苷BII（Timosaponin BII）和辛那素（Sinensetin）为核心成分，PTGS2、PPARG和HSP90AA1为枢纽靶点。PPI分析进一步识别出ESR1、PTGS2、PPARG、HSP90AA1、JUN等关键基因及其他15个相关基因。KEGG通路分析表明，SXQY主要通过Ca2+、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B、环磷酸腺苷以及炎症和激素相关信号通路发挥作用。综上所述，SXQY通过多成分、多靶点、多通路机制改善心脏功能并减轻心肌重塑，从而对心力衰竭产生保护作用。
引言
心力衰竭（HF）是一种临床综合征，由心脏结构或功能异常导致心室充盈和射血能力受损，从而引发一系列临床体征和症状1。作为多种心脏疾病的终末阶段，HF 显著降低患者的生活质量，并导致高死亡率和频繁的再住院，给家庭和社会带来沉重的疾病负担2,3。在临床管理中，药物治疗是 HF 治疗的基础和核心，主要包括利尿剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂以及钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂等关键药物类别3,4,5,6。尽管这些药物在一定程度上改善了 HF 患者的预后，但每类药物均存在一定的局限性和不良反应，例如电解质紊乱、心动过缓和尿路感染等7。因此，心力衰竭的药物治疗仍需进一步研究。
中医（Traditional Chinese Medicine, TCM）在长期治疗心力衰竭（HF）的过程中积累了丰富的临床经验。其强调整体调节和多靶点干预，提供了一种独特的治疗思路8。近年来，多项随机对照试验（RCTs）已证实中药复方对心力衰竭具有治疗效果9,10,11,12,13,14,15。生陷祛瘀汤（Shengxian Quyu decoction, SXQY）已开始接受严格的随机对照试验以验证其疗效，但其具体的治疗机制仍需进一步和更全面的研究16。网络药理学作为一门融合系统生物学、多靶点药理学和计算分析的新兴学科，为阐明中药复方的整体作用机制提供了有力工具17,18,19。因此，本研究采用非靶向代谢组学与网络药理学相结合的整合策略，鉴定SXQY的入血成分并阐明其潜在的治疗机制。本工作旨在为SXQY的进一步临床应用提供理论基础。
方案
所有实验操作均经中日友好医院动物伦理与福利委员会审查批准（批准号：zryhyy21-23-01-09），并遵循替代、减少和优化原则，以最大限度地减少动物使用数量和减轻动物痛苦。负责数据采集与分析（包括超声心动图测量和组织学评估）的研究人员对分组情况设盲。
SXQY 样品的制备
SXQY 由以下草药成分组成：Astragalus membranaceus（黄芪）（30 g）、Codonopsis pilosula（党参；20 g）、山茱萸（山萸肉；15 g）、Sparganium stoloniferum（三棱；12 g）、Curcuma zedoaria（莪术；15 g）、Cimicifuga heracleifolia（升麻；10 g）、Bupleurum chinense（柴胡；10 g）、Platycodon grandiflorus（桔梗；10 g）、Anemarrhena asphodeloides（知母；15 g）和益母草（益母；15 g），每剂总生药量为 152 g。所有药材均购自中国—日本友好医院药剂科，并由主任药师根据标准生药学鉴定方法进行鉴定。临床上，SXQY 的给药剂量为每日一剂（152 g）。假设成年成人平均体重为 70 kg，则相应的人体剂量为 2.17 g（生药）/kg。根据人与大鼠之间的体表面积归一化换算，计算得出等效大鼠剂量为 13.67 g（生药）/kg。在制备汤剂时，将一剂 SXQY 以每克生药加 10 mL 蒸馏水的比例（w/v，基于浸泡前初始溶剂体积，浸泡后不调整体积）浸泡 1 小时，随后使用电热套加热至沸腾，并在 100°C 下持续沸腾 1 小时。提取液经纱布（孔径 200–300 µm）过滤，药渣再按相同条件重复提取两次。合并滤液后，在 60°C 下使用旋转蒸发仪减压浓缩至最终体积 111 mL，得到浓度为 1.37 g（生药）/mL 的浓缩液。浓缩后的汤剂再次经纱布（孔径 200–300 µm）过滤，于 4°C 保存，并在 24–48 小时内使用。给药时直接使用该溶液，灌胃体积根据 1.37 g/mL 的浓度计算，约为 10 mL/kg，以达到 13.67 g/kg 的目标剂量。
动物模型
将18只8周龄雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠饲养于标准环境条件下（23°C ± 2°C，相对湿度50 ± 5%，12小时光照/黑暗循环），自由摄食和饮水。根据随机数字表将动物随机分为三组（每组n = 6）：假手术组（Sham）、横主动脉缩窄组（TAC）和SXQY治疗组（SXQY）。TAC组和SXQY治疗组大鼠通过吸入异氟烷（诱导浓度4%，维持浓度2%）进行麻醉，并仰卧于恒温加热垫上，维持体温在37°C。通过足底夹捏无反射反应、呼吸频率稳定且无自发运动来确认麻醉深度。双眼涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。经气管插管后，将动物连接至小型动物呼吸机，潮气量为每200 g体重4–6 mL，呼吸频率为每分钟70次，吸气与呼气时间比为1:1。
所有手术操作均在无菌条件下进行。手术器械通过高压灭菌法进行消毒，手术区域则通过剃毛后使用聚维酮碘消毒，再用70%乙醇处理。完成手术部位准备后，于左侧胸壁做皮肤切口，钝性分离胸大肌和胸小肌以暴露肋骨。在左侧胸骨旁第二至第三肋间处做一长约1.0 cm的横向切口。钝性分离血管和筋膜后，轻柔牵拉胸腺以充分暴露主动脉弓。
使用无菌弯镊在无名动脉右侧与左颈总动脉之间小心抬起主动脉弓，并将一根2-0丝线从下方穿过。使用前，将钝头弯形16号针头（外径1.6 mm）手动修整为钝头并弯成适当弧度，随后经高压灭菌处理。将制备好的钝头弯针平行置于主动脉弓旁，然后将丝线在主动脉和针头周围紧密结扎。迅速抽出针头以形成标准化的缩窄，复位胸腺组织。确认无活动性出血后，逐层关闭胸壁和皮肤。术后继续机械通气约10分钟，直至动物自主呼吸恢复，表现为呼吸频率稳定且规律，并能在无呼吸机支持下维持自主呼吸。此时拔除气管插管。假手术组动物接受相同的手术操作，但不结扎主动脉弓。
手术后，对切口部位进行消毒，并将动物置于清洁的恢复笼中，以降低感染风险。随后将大鼠送回动物饲养设施进行恢复和常规饲养。使用布托啡诺（0.05 mg/kg，皮下注射）进行镇痛。在术后前72小时内，每12小时观察一次大鼠是否出现疼痛、痛苦或手术并发症的迹象，包括活动减少、竖毛、异常姿势、呼吸困难或伤口裂开。
手术后3天，SXQY治疗组大鼠按1 mL/100 g体重剂量灌胃给予SXQY汤剂，持续9周。同时，假手术组和TAC组大鼠以相同体积（1 mL/100 g体重）的蒸馏水灌胃处理。
经胸超声心动图
治疗期结束后，对所有组别进行经胸超声心动图检查。大鼠通过吸入异氟烷进行麻醉，并仰卧于专用成像平台上。仔细剃除胸部前侧毛发，并涂抹足量超声耦合剂。采用配备高频探头（18–40 MHz）的高分辨率小动物超声系统，在B模式和M模式下进行超声成像。将探头轻柔地置于涂有耦合剂的区域，设置深度为12.29 mm，增益为22 dB，并调整焦点以优化图像质量。采集图像和视频片段用于后续定量分析。测量左心室舒张末期内径（LVIDd）和舒张末期左心室后壁厚度（LVPWd），并根据M模式测量结果，采用Teichholz公式计算左心室射血分数（LVEF）。每个参数的测量值取3–5个连续心动周期的平均值。所有超声心动图的采集与分析均由经过正式培训并具备资质的超声心动图操作人员，依照标准化超声心动图操作规程完成。
样品采集与处理
超声检查后，用异氟烷对大鼠进行麻醉。将动物置于仰卧位，打开胸腔以暴露心脏。迅速切除心脏，用冷磷酸盐缓冲液冲洗，并沿矢状面进行切分。心脏组织立即在4°C条件下用4%多聚甲醛固定24小时，随后依次经梯度乙醇（70%、80%、90%、95%和100%）脱水，每步1小时，在此过程中组织逐渐变为半透明且无明显收缩。样品经二甲苯透明处理后，在60°C下用熔融石蜡浸润3小时，并在室温（RT；20°C–25°C）下冷却固化。将石蜡包埋的心脏组织块修整后，用切片机切成4–6 µm厚的切片。切片漂浮于45°C水浴中展平，然后捞取至载玻片上，并在37°C–40°C下过夜干燥。载玻片置于室温低湿度条件下保存，并在1周内用于组织学染色。
苏木精-伊红（HE）染色
石蜡包埋切片按以下步骤处理。首先将切片依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各5分钟以脱蜡，随后通过无水乙醇Ⅰ、Ⅱ及梯度乙醇溶液（95%、90%、80%、70%和50%）各5分钟进行水化，最后用蒸馏水冲洗，直至无可见蜡残留。然后将切片用 Harris 苏木精染色5分钟，并用流水冲洗1–2分钟。接着用酸性乙醇溶液分化约1–2秒，分化终点通过肉眼观察确定，即背景呈淡色而细胞核染色仍清晰分明。随后在37°C–45°C的水中进行蓝化处理，并用蒸馏水冲洗。之后，切片用醇溶性伊红复染40秒，经蒸馏水洗涤后，通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
马松染色
石蜡包埋切片依次在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脱蜡，每次5分钟；随后经无水乙醇Ⅰ、Ⅱ及梯度乙醇溶液（95%、90%、80%、70%和50%）各5分钟进行水化，最后用蒸馏水漂洗。切片浸入预冷至4°C的0.5%醋酸溶液中1秒，随后用商品化Masson三色染色试剂盒中的品红溶液染色10分钟，再用磷钼酸分化5分钟，最后用苯胺蓝复染3分钟。所有试剂均来自同一商品化试剂盒，并按照生产商说明书使用。染色完成后，切片用预冷至4°C的醋酸溶液漂洗三次（每次约30秒），经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
用于代谢组学分析的血清样本采集
选取6只8周龄雄性SD大鼠，饲养条件与上述体内实验相同。采用计算机生成的随机化方法，将动物随机分为SXQY处理组和溶剂对照组（蒸馏水；每组n = 3）。SXQY组大鼠按1 mL/100 g体重剂量经口灌胃给予SXQY，对照组则给予等体积的蒸馏水。连续每日灌胃7天，第7天最后一次给药剂量加倍。末次给药后，动物禁食12 h。使用异氟烷麻醉大鼠，直至足底回缩反射消失，以确认达到充分麻醉状态。采用无菌毛细管从眶后静脉丛采集血液样本，并立即转移至不含抗凝剂的1.5 mL微量离心管中。全血在室温下静置1 h后，于4°C以1000 × g离心15 min，以获取血清。当上层透明血清层与血凝块清晰分离时，小心吸取上清液血清并转移至洁净的微量离心管中。血清样品储存于−80°C，待测入血成分。
代谢组学分析的样品预处理
血清样本从 −80°C 保存条件下取出后置于冰上解冻，并短暂涡旋混匀（10 秒），以确保样本均匀。取 100 µL 血清转移至 1.5 mL 微量离心管中，随后加入 500 µL 提取溶剂（含 2-氯-L-苯丙氨酸作为内标，终浓度为 1 µg/mL 的 20% 乙腈-甲醇溶液），以诱导蛋白质沉淀。混合物剧烈涡旋 3 分钟，然后在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。取 470 µL 上清液转移至新管中，在受控的低流量氮气条件下使用氮吹仪蒸发至完全干燥。用 200 µL 70% 甲醇-水溶液重新溶解残渣，涡旋 1 分钟后，在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，将 180 µL 澄清上清液转移至自动进样瓶中，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。
取200 µL SXQY样品，转移至预先标记的1.5 mL离心管中。按1:1（v/v）的体积比向每个样品中加入内标提取液。混合物涡旋振荡15分钟，于4°C下以12,000 × g 离心3分钟。小心收集上清液，经0.22 µm微孔滤膜过滤，得到无可见颗粒的透明滤液。将滤液转移至自动进样瓶中，于4°C保存，待进行超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）分析。
内标溶液的制备
通过将1 mg参考标准品溶解于1 mL 70%（v/v）甲醇-水溶液中，配制内标物（2-氯-L-苯丙氨酸）储备液，得到浓度为1,000 µg/mL的溶液。再用相同溶剂将该储备液稀释，获得终浓度为1 ppm的工作用内标溶液。工作液需新鲜配制，于4°C保存，并在48–72小时内使用。
UPLC–MS/MS 条件
采用超高效液相色谱系统与串联质谱仪联用进行色谱分离。分离在维持于40°C的C18色谱柱上完成，流速为0.35 mL/min，进样体积为4 µL。流动相由含0.1%（v/v）甲酸的超纯水（A）和含0.1%（v/v）甲酸的乙腈（B）组成。梯度洗脱程序如下：0.0 min时为5% B；线性增加至2.0 min时为25% B，3.0 min时为35% B，5.0 min时为60% B，6.0 min时为99% B；在99% B条件下保持1.5 min；于7.6 min时返回至5% B；并在5% B条件下平衡至10.0 min。
采用配备电喷雾电离源的高分辨质谱仪，在正离子和负离子模式下进行质谱检测。正离子模式下的喷雾电压设置为3500 V，负离子模式下为3200 V。鞘气和辅助气体流速分别设定为30和5个任意单位（由仪器定义）。离子传输管温度和汽化器温度分别维持在320°C和300°C。全扫描质谱（Full MS）在m/z 84–1250范围内采集，分辨率为35,000，自动增益控制（AGC）目标值为1.0 × 106；随后进行数据依赖的二级质谱（MS/MS）采集（前10个信号最强的离子），分辨率为17,500，AGC目标值为2.0 × 105，隔离窗口为1.0–1.5 m/z。采用分步归一化碰撞能量，分别为30、40和50。选择信号强度最高的前10个母离子进行碎裂，动态排除时间为3秒。
原始数据处理
使用 ProteoWizard 将原始质谱数据转换为 mzML 格式。为确保分析的可靠性，通过等体积混合所有血清样本制备混合的质量控制（QC）样本。在整个超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）分析过程中，以固定间隔（每分析 5–10 个样本插入一次 QC 样本）进样 QC 样本，以监测仪器稳定性、保留时间一致性及信号重复性。根据 QC 样本中峰强度的相对标准偏差评估重复性。
使用 XCMS 软件包进行峰检测、保留时间校正和峰对齐。在任一组内缺失率超过 50% 的特征被排除在后续分析之外。随后，采用基于支持向量回归（SVR）的归一化方法，在 R 统计软件中利用基于质控样本（QC）的建模对峰面积进行信号漂移校正，以校正分析过程中信号的漂移。
通过将校正后的特征与内部参考标准品库（包含约5,000种化合物，均具有MS1和MS2谱图数据；为专有资源，不公开）以及公开可用的谱图数据库进行比对，完成代谢物鉴定。所用数据库包括人类代谢组数据库（HMDB）、代谢物与串联质谱数据库（METLIN）、MassBank以及全球天然产物社会分子网络（GNPS），比对依据为精确质量匹配、保留时间对齐以及MS/MS谱图相似性。质量匹配时，母离子（MS1）和碎片离子（MS2）的质量容差设为±25 ppm，保留时间容差为±6秒。在谱图库检索中，母离子（Q1）的质量容差设为±25 ppm，MS/MS碎片离子设为±50 ppm，并要求最低MS/MS匹配得分不低于0.3。仅保留综合鉴定得分高于0.5的代谢物用于非靶向鉴定。最终得分由碎片匹配得分（权重0.1）、正向匹配得分（权重0.3）和反向匹配得分（权重0.6）加权求和计算得出。正负离子化模式下获得的数据在化合物水平上进行合并。对于重复的注释条目，选择鉴定置信度最高且得分最高的条目保留。最终确定的注释结果被汇总生成代谢物注释文件。
吸收化合物的鉴定标准
吸收的原型成分定义为在SXQY提取物和SXQY处理组中检测到的化合物，且其保留时间在±0.1 min的容差范围内相匹配。此外，这些化合物在SXQY处理组中的峰面积需至少是溶剂对照组的两倍，或在溶剂对照样品中未检出。
采用另一组标准鉴定吸收的代谢物。这些化合物在SXQY提取物中未被检测到，但在SXQY处理组中存在。其质谱特征需与典型的代谢转化一致，包括羟基化（Δm/z = +15.9949 Da）和去甲基化（Δm/z = −14.0157 Da）。此外，根据信号漂移校正后的归一化峰面积，SXQY处理组中的峰面积需至少是溶剂对照组的两倍，或在溶剂对照样品中相应信号不可检出。
吸收化合物相关基因的获取
通过传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph；2026年1月访问）对入血成分进行筛选20。根据已建立的药代动力学阈值，口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18的化合物被筛选为候选生物活性成分21。随后检索这些保留化合物对应的潜在靶点，并利用UniProt数据库将所有靶点标识符标准化为官方基因符号22。
疾病相关靶点与交集基因的获取
以“心力衰竭”为检索词，在 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/；访问时间：2026 年 1 月）中收集与心力衰竭（HF）相关的基因，并筛选相关性评分 ≥ 10 的基因用于后续分析。随后，利用 Weishengxin 平台（https://www.bioinformatics.com.cn；访问时间：2026 年 1 月）将心力衰竭相关靶点与 TCMSP 数据库中获得的化合物相关靶点进行交集分析。将获得的共同基因为交集靶点，用于后续的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及功能富集分析。
网络构建与功能富集分析
使用 STRING 数据库（http://cn.string-db.org/；访问时间为 2026 年 1 月）对鉴定出的靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析23，设置物种为智人（Homo sapiens），置信度评分阈值 ≥0.7。将相互作用数据导入 Cytoscape 可视化工具进行网络可视化。利用该可视化工具中的 NetworkAnalyzer 插件进行拓扑分析，并使用 CytoHubba 插件识别枢纽基因24,25。对交集靶点进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，包括生物过程（biological process, BP）、细胞组分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）三个类别。将 P 值 < 0.05 的 GO 条目视为具有显著性，从每个类别中选取前 10 个富集最显著的条目进行可视化展示26。进一步利用统计软件中的 clusterProfiler 软件包对交集靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。P 值 < 0.05 的通路被认为具有统计学显著性，并选取前 20 条富集通路进行可视化。随后基于这些通路构建靶点-通路相互作用网络27。
统计学分析
数据以均值 ± 标准差表示。在分析前，采用 Shapiro-Wilk 检验评估数据分布的正态性，采用 Levene 检验或 Brown-Forsythe 检验评估方差齐性。组间统计学比较采用单因素方差分析，随后使用 GraphPad Prism 进行 Tukey 事后检验。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。
结果
经胸超声心动图
超声心动图分析显示，TAC 大鼠出现明显的心脏重构和功能障碍（图1）。与假手术对照组相比，TAC 显著增加了舒张末期左室内径（LVIDd）和舒张末期左室后壁厚度（LVPWd），同时左室射血分数（LVEF）显著降低。值得注意的是，与 TAC 组相比，SXQY 给药部分逆转了这些病理变化，表现为 LVIDd 和 LVPWd 显著减小，同时 LVEF 明显改善。
图1。各组间心脏功能参数的比较（n = 6）。 采用经胸超声心动图评估舒张期左心室内径（LVIDd）、舒张期左心室后壁厚度（LVPWd）和左心室射血分数（LVEF）。数据以均值 ± 标准差表示。*P < 0.05，与假手术组（Sham group）相比；#P < 0.05，与横主动脉缩窄（transverse aortic constriction, TAC）组相比。生仙祛瘀方（Shengxian Quyu decoction, SXQY）。请点击此处查看该图的放大版本。
组织学分析
组织病理学评估显示，TAC 模型组出现严重的心肌重塑（图 2）。与假手术对照组相比，HE 染色显示心肌细胞明显增大、心肌结构紊乱以及大量炎性细胞浸润。Masson 三色染色显示间质中广泛存在胶原沉积，可见显著的蓝色染色纤维化区域，符合明显的心肌纤维化特征。
图2。各组大鼠心肌组织的代表性组织病理学变化（n = 6）。苏木精-伊红染色显示心肌细胞形态及炎性细胞浸润情况，Masson 三色染色显示胶原沉积（蓝色）。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
SXQY 治疗显著改善了这些病理改变。HE 染色切片显示心肌细胞排列更为规整，炎症细胞浸润减少。Masson 染色显示间质胶原沉积明显减少，纤维化区域显著缩小，表明心肌纤维化得到有效抑制。
代谢组学分析
基于UPLC–MS/MS分析平台并结合自建数据库，共检测到2,034种成分。其中，共有563种化合物符合预设的吸收成分标准，包括367种被鉴定为原形成分的吸收物和196种被鉴定为代谢产物的吸收物（补充表1）。通过TCMSP平台筛选，获得5种符合筛选标准的候选活性化合物，分别为蜜橘黄素（Sinensetin）、芒柄花素（Formononetin）、苦苣素（Lactucin）、3’-甲氧基大豆苷元（3’-Methoxydaidzein）和知母皂苷BII（Timosaponin BII）。这些化合物共关联63个相应的靶基因，详细信息见表1。
| 分子编号 | 分子名称 | 口服生物利用度（OB，%） | 类药性（DL） | 分子式 | 分子量（MW，g/mol） | 靶点数量（n） |
| MOL001803 | Sinensetin | 50.56 | 0.45 | C20H20O7 | 372.4 | 21 |
| MOL000392 | Formononetin | 69.67 | 0.21 | C16H12O4 | 268.28 | 15 |
| MOL010586 | Timosaponin BII | 13.87 | 0.04 | C45H74O18 | 921.07 | 9 |
| MOL002959 | 3′-Methoxydaidzein | 48.57 | 0.24 | C16H12O5 | 284.28 | 19 |
| MOL008535 | Lactucin | 22.99 | 0.22 | C15H16O5 | 276.31 | 3 |
表1：具有生物活性的入血成分详细信息。 本表总结了生仙祛瘀汤（SXQY）中鉴定出的具有生物活性的入血成分的关键理化性质及其作用靶点概况。口服生物利用度（OB，%）和类药性（DL）数值来源于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）。每种化合物均提供了分子式和分子量（MW，g/mol）。预测靶点数量（n）表示基于数据库检索和靶点预测分析所得的每种化合物相关的潜在蛋白质靶点总数。
网络构建与分析
从 GeneCards 数据库中检索到共计 18,023 个与心力衰竭相关的靶基因。交叉分析确定了 44 个重叠基因（图 3）。这些交集基因随后用于构建“SXQY–组分–靶点–心力衰竭”调控网络，该网络包含 51 个节点和 149 条相互作用边（图 4）。拓扑学分析显示，在化合物节点中，芒柄花素、知母皂苷 BII 和蜜桔黄素的度值最高；在靶基因节点中，前列腺素-过氧化物合酶 2（PTGS2）、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（PPARG）、前列腺素-过氧化物合酶 1（PTGS1）、丝氨酸蛋白酶 1（PRSS1）和热休克蛋白 90α家族A类成员1（HSP90AA1）为度值排名前五的核心靶点。
图3。维恩图显示SXQY相关靶点与心力衰竭（HF）相关基因之间的重叠部分。重叠区域中的数字表示共有靶点的数量。请点击此处查看该图的放大版本。
图4。SXQY-成分-靶点-HF调控网络。 节点代表化合物或靶基因，边代表相互作用关系。节点大小与度值成正比。请点击此处查看该图的放大版本。
蛋白质-蛋白质相互作用网络
使用 STRING 数据库构建的蛋白质-蛋白质相互作用网络包含 58 个节点和 346 条相互作用边（图 5A）。根据节点度数升序排列，排名前 20 的基因为 ESR1、PTGS2、PPARG、HSP90AA1、JUN、GSK3B、PRKACA、SIRT1、AR、ESR2、NOS3、CDK2、MAPK14、IL4、CCNA2、NCOA2、CHEK1、DRD1、MAOB 和 NOS2（图 5B）。
图 5．SXQY-HF 共享靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。（A）PPI 网络。（B）按度值排序的前 20 个基因。请点击此处查看此图的放大版本。
功能富集分析
KEGG 通路富集分析共鉴定出 114 条通路。排除与代谢和人类疾病相关的通路后，剩余 57 条通路。从中选取前 15 条富集最显著的通路进行可视化展示（图 6A）。这些通路主要包括神经活性配体-受体相互作用、雌激素信号通路、钙信号通路、多巴胺能突触、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路、激素信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、磷脂酰肌醇 3-激酶–蛋白激酶 B（PI3K–Akt）信号通路、神经活性配体-受体相互作用、白细胞介素-17 信号通路、甲状腺激素信号通路、细胞衰老、环磷酸鸟苷–蛋白激酶 G（cGMP–PKG）信号通路以及 Th17 细胞分化。
对目标基因-通路网络的进一步分析显示，根据度值排名前10的核心靶基因分别为PRKACA、CALM2、ADRB2、MAPK14、DRD1、ADRA1D、ADRA1B、HSP90AA1、CHRM1和GSK3B（图6B）。
图6．SXQY–HF共有靶点的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。（A）按显著性排序的最显著富集KEGG通路；圆点大小表示基因数量，颜色表示−log10(P值)。（B）基因与前20个富集KEGG通路的相互作用图谱。请点击此处查看该图的放大版本。
SXQY 能有效改善由 TAC 诱导的心功能障碍和心肌重构，表现为超声心动图参数的改善以及心肌肥厚、炎症和纤维化的减轻。整合的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）与网络药理学分析表明，SXQY 含有多种可进入血液的生物活性成分，作用于 PTGS2、PPARG 和 HSP90AA1 等关键靶点，并调控 ESR1、JUN、SIRT1 和 MAPK14 等核心基因。功能富集分析进一步显示，其治疗作用通过多条信号通路介导，特别是钙信号、PI3K–Akt、环磷酸腺苷、炎症相关及激素相关通路。综上所述，这些研究结果表明 SXQY 通过多成分、多靶点、多通路的机制发挥心脏保护作用，为其在心力衰竭治疗中的应用提供了科学依据。
数据可用性：
本研究期间生成或分析的所有数据集均可公开获取，相关网址已在文章中提供。补充数据见补充表1。
补充表 1. 通过液相色谱-质谱法鉴定的代谢物双工作表数据集。 工作表 1 列出了所有检测到的化合物及其分析参数、化学分类和数据库注释。工作表 2 提供了关键代谢物及其代谢转化的精选汇总。鉴定置信度等级反映了注释的可靠性。请点击此处下载该文件。
讨论
参芎注射液（SXQY）已在临床实践中广泛应用二十余年，证实对多种心血管疾病具有治疗作用。近年来，其应用已扩展至射血分数降低和射血分数轻度降低的心力衰竭患者16。在本研究中，通过主动脉缩窄（TAC）手术建立大鼠心力衰竭（HF）模型，以模拟HF的病理改变，同时对部分大鼠给予参芎注射液治疗，以评估其疗效。采用经胸超声心动图、苏木精-伊红（HE）染色和马松（Masson）染色评价模型是否成功建立以及参芎注射液是否发挥干预作用。TAC诱导的心力衰竭显著增加左心室舒张末期内径（LVIDd）和左心室后壁舒张末期厚度（LVPWd），同时降低左心室射血分数（LVEF），提示心脏功能受损。参芎注射液治疗部分逆转了上述改变，与TAC组相比，LVIDd和LVPWd减小，LVEF改善。组织学分析显示，TAC组存在心肌细胞肥大、心肌结构紊乱及广泛炎症，并在马松三色染色中呈现明显纤维化。参芎注射液治疗减轻了这些病理改变，促进心肌细胞排列趋于规整，减轻炎症反应，并减少胶原沉积和纤维化区域，提示其对心肌纤维化具有保护作用。这些结果表明，参芎注射液显著缓解了压力超负荷引起的心肌病理性重塑和纤维化。这些实验结果通过证实参芎注射液在体内具有心肌保护作用，直接支持了本研究的假设，表明其活性成分可被吸收进入血液循环，并能够到达心脏组织，减轻结构和功能损伤，从而为后续的机制研究奠定了基础。与既往研究相比，本研究不仅在TAC诱导的心力衰竭模型中验证了参芎注射液的心肌保护作用，还系统表征了其在体内吸收的原型成分及其代谢产物，结合代谢组学与网络药理学的多层次机制分析，将体内疗效与作用机制相联系。
然而，其对抗心力衰竭（HF）的潜在机制仍不明确。为此，本研究采用非靶向代谢组学方法系统检测血液中的成分，并将这些数据与网络药理学相结合，以阐明其治疗机制。以往的网络药理学研究主要依赖TCMSP、HERB和TCMID等数据库来识别关键生物活性成分并预测治疗靶点28。然而，这种基于数据库的策略存在固有局限性。这些数据库中收录的大多数化合物来源于体外化学分析或文献报道，未能充分考虑体内吸收、分布、代谢和排泄过程。因此，许多被预测的成分可能生物利用度较差，或无法进入体循环，导致计算预测结果与实际药理效应之间存在显著差异。相比之下，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC–MS/MS）能够准确鉴定和定量真正存在于血液中的化合物，从而为药效评估提供更具生理相关性的依据。聚焦于循环成分可更真实地反映药物在体内的作用模式，并提高下游靶点预测及网络药理学分析的生物学相关性29。值得注意的是，本研究的特色在于将实验鉴定出的入血成分与计算机靶点预测相结合，而非仅依赖数据库来源的化合物，从而提高了研究结果的生理相关性和转化潜力。此外，UPLC–MS/MS与网络药理学的联合应用，为阐明传统方剂在心力衰竭背景下的多成分、多靶点作用机制提供了一种新策略。该整合策略通过减少对可变数据库注释的依赖，转而使用实验验证的循环成分，提高了研究的可重复性；同时通过优先关注与体内药理活性直接相关的可利用成分，增强了研究的转化应用价值。
UPLC–MS/MS 平台共检测到 2,034 种成分，其中 563 种符合吸收标准。通过 TCMSP 平台筛选，确定了 5 种候选活性化合物：Sinensetin、Formononetin、Lactucin、3’-Methoxydaidzein 和 Timosaponin BII。Sinensetin 具有显著的抗炎和抗氧化作用，可能有助于其在预防心肌纤维化和不良心脏重构中的潜在机制30,31。同样，Formononetin 已被报道可阻断促纤维化信号级联反应，并改善心脏纤维化，从而对心力衰竭（HF）产生作用32。Timosaponin BII 治疗可使斑马鱼心包水肿在不同程度上得到改善33。通过 UPLC–MS/MS 鉴定出的 SXQY 这些关键生物活性成分具有针对多靶点、多通路的 HF 治疗作用；因此，有必要进一步通过网络药理学方法深入探究其潜在作用机制。
PPI 富集分析揭示了一系列关键靶点，这些靶点主要参与神经激素激活、心肌肥厚、纤维化、炎症、氧化应激、代谢改变和细胞凋亡等生物学过程。ESR1、AR、ESR2 和 NCOA2 通过与激素相关的调控机制促进心力衰竭（HF）的进展34,35。这种激素失调与强烈的炎症级联反应相互交织，其中 PTGS2、NOS3 和 IL4 等介质是心肌细胞损伤或修复的主要驱动因子36,37,38。尤其值得关注的是 SIRT1 的作用，其与心力衰竭的病理生理过程密切相关。研究表明，SIRT1/Notch1 信号轴可促进内皮-间充质转化，这是心脏纤维化及继发性心脏功能障碍的关键驱动因素39。此外，在心力衰竭中 SIRT1/p53 通路的激活被证实可减少 SLC7A11 的耗竭，从而抑制铁死亡，并减轻心脏功能障碍的进展40。有趣的是，木蝴蝶素 A 可激活 SIRT1，促进 NRF2/SOD2 信号通路，抑制 M1 极化，进而调节心脏中的炎症反应并促进组织修复41,42。然而，莴苣内酯则通过增强 SIRT1/PGC-1α 信号通路促进线粒体动态平衡的恢复42。
对这些交集基因的KEGG通路分析显示，神经活性配体-受体相互作用、雌激素信号通路以及钙信号通路显著富集，提示这些通路参与了舒心强压方（SXQY）的治疗作用。这些通路与慢性交感神经激活、激素失调以及能量感知和代谢障碍密切相关，共同促使心肌细胞从代偿性适应向病理性重塑发展43,44,45。更具体而言，雌激素受体β已被证实可拮抗心肌细胞和成纤维细胞的激活，从而抑制心脏肥厚和纤维化46,47,48。在心肌细胞中，钙离子是启动肌肉收缩的关键因子，同时调节心肌细胞的能量需求49。肌浆网耗竭型钙内流（SOCE）在心肌梗死后成纤维化修复和血管生成中发挥重要作用，药理学抑制SOCE可减少成纤维细胞活化，并损害纤维化和血管生成过程，已为此提供了证据50。除上述通路外，其他通路也参与调控心脏重塑和纤维化。越来越多的证据表明，PI3K–Akt信号通路通过mTOR、GSK-3、FoxO1/3和NOS等分子调控细胞存活、凋亡、生长、收缩功能及基因转录，从而调节心脏纤维化51。在由TAC诱导的慢性心力衰竭大鼠模型和缺血性心力衰竭兔模型中，Th17细胞输注和静脉注射IL-17均较相应对照组显著加重了心肌纤维化和心力衰竭程度52。这些富集的通路由所鉴定的核心靶点介导，这些核心靶点作为关键节点，连接了SXQY来源的生物活性成分与心脏重塑及纤维化的调控过程。
本研究探讨了参芎清瘀（SXQY）在经腹主动脉缩窄术诱导的心力衰竭大鼠模型中的吸收入血成分，并证实了其治疗效果。然而，本研究的局限性在于尚未完全阐明SXQY发挥心脏保护作用的潜在机制。除本研究所采用的吸收入血成分分析与网络药理学整合策略外，还可采用体外细胞实验、组学技术（如代谢组学和蛋白质组学）以及分子对接模拟等方法进一步探究其作用机制。与这些方法相比，本研究的方法能够在系统层面系统性地识别具有生物利用度的化合物及其潜在作用靶点，但其结果仍主要基于预测，需进一步的实验验证。未来的研究应更加注重阐明其涉及的具体分子通路，特别是从能量代谢和炎症反应的角度，以更全面地理解SXQY抗心力衰竭的作用机制。
披露
作者在本研究中无任何利益冲突。
致谢
感谢中日友好医院动物实验中心在动物护理和手术操作方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氯-L-苯丙氨酸 | Aladdin | C105993-1g | 内标物 ≥98% |
| 乙腈（LC-MS级） | Aladdin | A120771-1L | 提取溶剂 |
| 乙酸 | Solarbio | G1340 | Masson染色；预冷至4 °C |
| 自动进样瓶 | 安捷伦 | 5190-9590 | 用于LC-MS/MS样品上样 |
| 布托啡诺 | Cerilliant | B-044S | 镇痛剂 |
| C18 色谱柱（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm | 沃特斯 | 176001125 | ACQUITY Premier HSS T3 色谱柱 |
| 毛细管，无菌 | Fisherbrand | 22-362-566 | 眼后静脉丛采血 |
| 离心机（带制冷功能） | 久保田 | N61196-F000 | 用于血清和样本处理 |
| clusterProfiler 包 | Bioconductor | — | 用于KEGG富集分析的R软件包；v4.0.2 |
| 无菌弯头镊子 | HL-SQX | HL-JP | 主动脉弓操作 |
| Cytoscape 软件 | NHGRI | NIH NHGRI U24 HG012107 | 版本 6.4.1 |
| 专用成像平台 | 富士胶片 VisualSonics | VisualSonics Vevo 1100 超声成像系统 | 超声心动图检查中的动物体位 |
| 蒸馏水 | N/A | N/A | 煎煮液制备与溶剂对照 |
| 电加热套 | Midea | WK2102 | 煎煮沸腾 |
| 气管内导管 | CWE公司，美国 | SAR-1000 | 经气管插管；本研究中使用的气管插管已整合至呼吸机配置中，并非独立或单独的装置 |
| 乙醇（纯） | 北京益利精细化学品有限公司 | 64-17-5 | 脱水与灭菌 |
| 甲酸 | Aladdin | O930702 | 流动相添加剂 |
| 纱布 | Solarbio | YA0720 | 煎煮过滤；200–300 μm 孔径大小 |
| GeneCards 数据库 | GeneCards | — | 疾病相关靶点检索；访问时间：2026年1月 |
| GNPS数据库 | 加利福尼亚大学圣地亚哥分校 | — | 光谱数据库；版本 1.3.16，数据存档于 2025 年 12 月 |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | — | 版本 10.1.2；SCR_002798 |
| 加热垫（恒温式） | Physitemp | HP-4M | 维持在 37 °C |
| 苏木精和伊红（H&E）&E) 染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | 组织学染色 |
| 高频换能器 | VisualSonics | Vevo F2 | 18–40 MHz |
| 高分辨率质谱仪 | 赛默飞世尔科技 | Q Exactive | Q Exactive HF-X |
| 高分辨率小动物超声成像系统 | 富士胶片 VisualSonics | VisualSonics Vevo 1100 超声成像系统 | Vevo 2100 |
| HMDB数据库 | 阿尔伯塔大学威沙特研究组 / 代谢组学创新中心 | — | 光谱数据库；HMDB 当前版本 5.0；发布版本 5.0；2022 年 1 月 |
| 内部参考标准品库 | METWARE | — | 内部参考标准库的组成：该库共包含5,000种化合物，涵盖MS1（前体离子）信息及MS2（碎片离子）质谱数据。 可用性声明：库数据格式为.txt。 储存条件：数据库存储于公司内部服务器。 访问权限：该自建标准库为公司专有的内部质谱库，仅用于公司受控分析流程中的代谢物鉴定、结果验证和质量溯源，不对外公开下载。客户可获取基于该库生成的注释结果、匹配信息及必要的字段说明。 |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich | 792632 | 吸入麻醉剂 |
| 超高效液相色谱系统（UPLC） | SCIEX | ExionLC AD | ExionLC AD |
| MassBank 数据库 | MassBank联盟；日本质谱学会 / MassBank欧洲 | — | 光谱数据库；版本 2024.06；数据存档于 2025 年 12 月 |
| 马松’s Trichrome 染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | 组织学染色 |
| 膜滤器（0.22 μm) | Beyotime | FF362 | 聚醚砜（PES） |
| METLIN数据库 | 斯克里普斯研究所 / 苏兹达克实验室 | RRID: SCR_010500 | 光谱数据库；该数据库不提供固定的年度版本号；数据下载于2023年 |
| 甲醇（LC-MS级） | 北京益利精细化工有限公司 | 67-56-1 | 提取溶剂 |
| 微型离心管（1.5 mL） | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | MCT-150-C | 样品处理 |
| 切片机 | Leica | DSC1 | 组织切片 |
| 中性树脂 | Solarbio | G8590 | 载玻片封片 |
| 氮吹仪/气源 | Organomation | N-EVAP | 样品干燥 |
| 眼用软膏 | Aladdin | 08-03-8009 | 麻醉期间的眼部保护 |
| 石蜡 | Solarbio | YA0010 | 组织包埋 |
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | 组织固定 |
| 磷酸盐缓冲液 | 杜有由 | DYP1021 | 组织洗涤 |
| 磷钼酸 | Solarbio | G1340 | Masson染色 |
| 聚维酮–碘 | Solarbio | IP3800 | 外科消毒 |
| ProteoWizard 软件 | ProteoWizard 基金会 | — | 版本 3.0.19254 |
| R 软件 | R 基金会 | — | 版本 4.2.2 |
| 旋转蒸发仪 | 青岛精诚仪器仪表有限公司 | JC-2LZF | 减压浓缩煎煮液 |
| 丝线缝合线（2-0） | 弗尔安 | NL30RH26A-76 | 主动脉缩窄 |
| 小型动物呼吸机 | CWE 公司，美国 | SAR-1000 | 机械通气 |
| 斯普拉格–Dawley大鼠（雄性，8周龄） | SPF Bio Co., Ltd. | — | RGD_70508；许可证号 SCXK(京)2024-0001 |
| STRING 数据库 | STRING 联盟 | — | 蛋白质相互作用分析；2026年1月访问 |
| 支持向量回归归一化软件包/脚本 | MetNormalizer | — | 信号漂移校正；v1.3.02 |
| TCMSP数据库 | TCMSP | — | 化合物与靶点检索；2026年1月访问 |
| UniProt数据库 | UniProt 联盟 | — | 基因符号标准化 |
| 超声耦合剂 | MAGNAFLUX | 25-912 | 超声心动图 |
| 超纯水 | 实验室制备的 | — | 流动相溶剂 |
| 涡旋混合器 | Yalin | VM-ST | 样品混匀 |
| 水浴锅 | Julabo | PURA22 | 切片在45℃下漂浮 °C |
| Weishengxin 平台 | 魏圣心 | — | 靶向交叉分析；访问于2026年1月 |
| XCMS 软件 | R 基金会 | — | 版本 3.16.1 |
| 二甲苯 | Aladdin | X775162 | 脱蜡 |