整合转录组-全组关联研究和孟德尔随机化确定LYNX1和MS4A14为骨髓炎的治疗靶点

摘要

本研究结合了全转录组关联分析和孟德尔随机化，系统地识别骨髓炎的药物靶点。作者利用遗传数据库，确定LYNX1和MS4A14为关键候选基因，突出关键分子通路，并为管理骨感染制定了精确的治疗策略。

摘要

骨髓炎是一种严重的传染病，其特征是骨髓和骨髓的严重炎症，主要由细菌病原体如 金黄色葡萄球菌 （S. aureus）引起。然而，当前治疗方案因抗生素耐药性和反复感染的出现而受到显著阻碍，这些感染主要由强健的生物膜形成和细胞内细菌的持续存在驱动。因此，迫切需要识别除传统抗菌药物外的新治疗靶点。采用结合全转录组关联研究（TWAS）与基于摘要的孟德尔随机化（SMR）分析的整合计算方法，系统识别导致骨髓炎的因果易感基因。大规模遗传变异被用作预测跨组织基因表达的工具变量，使得探索这些靶点与疾病风险之间的因果关系成为可能。整合框架确定LYNX1和MS4A14为关键候选基因和潜在治疗靶点。具体来说，LYNX1与骨髓炎易感性增加相关，而MS4A14则表现出潜在的保护性。这些发现凸显了这些基因在宿主免疫反应和骨感染期间炎症调节中的调控作用。本研究弥合了全基因组关联发现与生物学解释之间的鸿沟，推动了对骨髓炎遗传基础的理解，并支持开发针对性精准医疗策略，以增强宿主防御并克服治疗耐药性。

引言

骨髓炎是一种严重的传染病，其特征是骨骼和骨髓的严重炎症。它常由细菌入侵引发，金黄色葡萄球菌（S. aureus）是急性和慢性血源性表现中常见的病原体^1,2。虽然金黄色葡萄球菌较为常见，但骨髓炎常为多元微生物，单靠根除金黄色葡萄球菌并不总能解决感染，因为无法培养的微生物和动态生物膜相互作用存在 ^3,4。在易感宿主中，病原体采用复杂的规避策略，包括巨噬细胞内的细胞内残存和形成致密生物膜。这些生物膜由细胞外DNA、多糖和特殊蛋白组成，形成强大的物理屏障，抵抗宿主免疫防御，限制传统抗菌剂的渗透^5,6。因此，尽管临床治疗通常涉及积极的手术清创和长期抗生素治疗，但韧性生物膜和多元微生物群落的存在显著降低治疗效果，导致长期发病和反复感染^7,8。阐明宿主与病原体相互作用背后的分子结构对于识别新颖治疗靶点仍^{至关重要。}

全基因组关联研究（GWAS）通过识别与疾病易感性相关的多个遗传位点，推动了对骨髓炎的理解¹⁰。然而，由于多重检测阈值严格以及统计检验力和样本量的限制，许多影响骨髓炎易感性的关键位点很可能仍未被^发现7。此外，GWAS发现的解释仍具挑战性，因为大多数已识别变异位于非编码或基因间区域，暗示其对基因表达的调控作用，而非蛋白质结构的直接改变¹¹。此外，原始GWAS数据缺乏直接的组织特异性，因此需要补充的下游分析以确定这些变异在细胞环境中发挥作用。全转录组关联研究（TWAS）通过将参考面板中遗传预测的基因表达整合到现有GWAS数据集中，实现系统识别跨多组织的功能相关疾病相关基因¹²。

为加强因果推断，孟德尔随机化（MR）采用遗传变异作为工具变量，利用受孕时等位基因的随机分配以减少混杂并逆转因果关系^13,14。表达定量性状位点分析（eQTL）进一步将GWAS变异与基因转录联系起来¹⁵，而基于摘要的孟德尔随机化（SMR）整合了GWAS和QTL数据集，通过异质性测试优先排序因果基因，并将其与由连锁不平衡驱动的关联区分开来¹⁶。

本研究首次将整合性TWAS和MR框架专门应用于骨髓炎，弥合了GWAS发现与临床可操作洞见之间的差距。通过结合实验转录组数据与大规模群体遗传数据，系统地绘制了疾病易感基因并推断了因果关系。该整合策略旨在揭示此前未被发现的宿主骨髓炎耐药性分子通路，并识别精准治疗开发的候选靶点。

方案

孟德尔随机化（MR）和全转录组关联研究（TWAS）分析中使用的所有摘要统计数据均严格来源于先前发布的去标识化数据集。原创研究的伦理批准和个人同意均在各自的出版物中有所记录。因此，浙江省同德医院机构审查委员会对该数据挖掘研究的额外伦理审批被放弃（浙江通德伦申2024[燕] 028-JY）。用于研究的工具列于 材料表中。

1. RNA测序数据采集与处理

转录组数据来自基因表达综合数据库（GEO，GSE272198），用于评估哺乳动物物种间先天免疫通路的保守性，用于初步验证¹⁷。骨髓来源巨噬细胞（BMDM）被感染金 黄色葡萄球菌 （感染多重度，MOI = 10）感染1小时，随后用溶菌核桃蛋白（20 μg/mL）和庆大霉素（50 μg/mL）治疗以去除细胞外细菌。在用磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）洗涤三次后，BMDM被培养24小时，溶解于全RNA提取试剂中，并进行测序。

通过自动电泳系统评估RNA质量以确保完整性。文库由三个独立实验制备，并在高通量测序平台上测序。原始读段通过STAR（v2.7.10a）比对到小鼠基因组（GRCm38，mm10）。通过DESeq2（v1.38.0）鉴定了差异表达基因（DEGs）。为减少假阳性，统计显著性定义为调整后的p值（FDR）<0.05和|log₂折叠变化|> 1.基因本体（GO）分析使用clusterProfiler（v4.6.0）完成，基因集富集分析（GSEA）使用GseaVis（v0.0.5）进行。热力图是通过R（v4.2.0）中的pheatmap包（v1.0.12）生成的。

TWAS 分析

全血RNA测序和全基因组测序（WGS）数据来自基因型-组织表达（GTEx）项目（V8）¹⁸。使用了来自公共仓库（https://doi.org/10.5281/zenodo.3842289）的预训练基因表达模型。从FinnGen联盟检索了骨髓鞘炎关于TWAS的综合统计数据，包含2,336例病例和473,264例对照组¹²。

TWAS采用三种算法进行：关节组织补值（JTI）、PrediXcan¹⁹和UTMOST ^12,20。JTI估计基因表达相似性和表观遗传染色质可及性，以优化预测准确性。PrediXcan 采用了带有五重交叉验证的弹性净回归，而 UTMOST 则通过稀疏群 LASSO 利用多组织表达数据提升准确性。Zhou等人描述的改进版UTMOST框架¹²标准化了无偏估计的超参数。具有稳定交叉验证分数的基因——预定义为相关系数r > 0.1，预测显著性p < 0.05²¹——被保留为可识别基因。利用1000基因组参考数据集中的SNP协方差矩阵建立了全血转录组模型。

随后分析了预测基因表达与骨髓炎风险之间的关联。为考虑多重检测，TWAS的统计显著性主要采用伪发现率（FDR）阈值<0.05。鉴于该多阶段研究的假设生成性质，满足提示（名义）阈值p < 0.05的位点也被优先用于下游孟德尔随机化（SMR）和共定位分析。该整合策略旨在最大化捕捉潜在调控驱动因素，同时依靠多组学交叉验证（TWAS + SMR）确保优先候选者的稳健性。

SMR分析

本研究遵循了《加强流行病学观察性研究报告》（STROBE）指南²²。为了计算性地定义代表线粒体功能障碍遗传倾向的表型（以下为分析称为“有丝分裂体”），从MitoCarta3.0数据库中提取了所有已知线粒体相关基因的转录本²³。该基因集作为预设、基于生物学的基础，用于后续多基因风险预测。所有与“有丝分裂”相关的下游功能解释均基于该计算推断，应被视为预测性和假设生成。

表达定量性状位点（eQTL）工具通过编码序列（cis-eQTLs）1000 kb范围内的变异生成。汇总统计数据来源于eQTLGen联盟和GTEx V8²⁴。共选出8,932,843个SNPs，关联1,013个丝分裂相关转录本，基于全基因组显著性阈值P<5E-8。骨髓炎结局的基线GWAS统计数据来自FinnGen²⁰。

采用SMR（版本1.0.3）进行基于摘要数据的孟德尔随机化（SMR）分析，并使用默认参数估计基因表达性状与骨髓炎结局之间的多效性关联。因果效应beta_mitodys骨髓炎代表线粒体功能障碍对骨髓炎的估计对数比值效应大小，计算公式为：

比值比（OR）表示标准化基因表达水平每增加一个单位自然对数的变化。通过依赖仪器异质性（HEIDI）检验进一步评估了共定位。

结果

体质RNA测序和功能富集的表征

按照分离未感染（对照）与金 黄色葡萄球菌感染BMDM的方法，实验组共识别出3,775个DEGs，包括1,686个上调基因和2,089个下调基因。GO分析揭示了一个高度富集先天免疫激活的网络，包括对先天免疫反应的正向调控（GO：0045089）和激活（GO：0002218），反映了典型的细胞因子驱动病原体防御机制。白细胞增殖调节（GO：0070661）凸显了关键的免疫效应动态。值得注意的是，对病毒刺激的反应（GO：0009615）也得到了富集，表明细菌感知激活重叠病原体相关分子模式（PAMP）信号级联的潜在交叉反应。与上述发现一致，GSEA确认了TNF、NOD样受体和Toll样受体信号通路的激活，建立了骨髓炎中宿主-病原体相互作用的基础炎症框架（见图1A–F）。

全转录组...

讨论

通过整合跨转化数据集的TWAS和SMR分析，本研究识别出与骨髓炎表型相关的遗传基因座核心网络。LYNX1和MS4A14作为候选基因靶点的鉴定是关键贡献，通过纳入转录组背景，提供了超越传统GWAS发现的机制见解。这一综合方法凸显了精准医疗策略在推动严重骨感染临床管理方面的潜力。

从方法学上看，利用孟德尔随机化推断基因表达与骨髓炎之间的因果关系具有显著的分析优势。由于遗传变异在受孕时随机分配，MR近似随机试验的结构，减少^{观察性研究}中固有的混杂和反向因果的影响3.

一个核心发现是将MS4A14和LYNX1分别作为骨髓炎的潜在保护性和风险相关因素。然而，由于这些基因在骨感染中的直接作用尚未被确立，功能解释仍仅限于假设生成，需谨慎解读。MS4A14被鉴定为遗传保护轴¹⁶。虽然其在骨髓炎中的具体生理作用尚未被明确描述，但它属于四叶片MS4A家族，已被证实参与

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
clusterProfiler	广州大学的光创宇团队（孙中山大学）	NA	用于差异表达基因的基因本体（GO）功能富集分析。
DESeq2	Bioconductor项目（开源）	NA	用于识别差异表达基因（DEGs）
GSEA / GseaVis	Broad Institute / 开源社区	NA	用于基因集富集分析（GSEA）以识别协调表达的基因集。GseaVis可能用于可视化。
HEIDI（Heterogeneity in Dependent Instruments）测试	SMR软件中的集成功能	NA	用于测试在SMR中观察到的关联是否由连锁不平衡而非共享因果变量驱动。P_HEIDI > 0.05表示没有主要的异质性
JTI（Joint-Tissue Imputation）	周等人（开源模型）	NA	一种TWAS算法，估计基因表达相似性和表观遗传染染色质可及性以优化预测精度。
pheatmap	Raivo Kolde（R包）	NA	用于生成差异表达基因的热图以进行数据可视化。
PrediXcan	Gamazon等人（开源模型）	NA	一种TWAS算法，应用带五折交叉验证的弹性网络回归来推断基因表达并测试与疾病风险的关联。
SMR（基于总结数据的孟德尔随机化）	复旦大学团队开发的（开源软件）	NA	用于进行基于总结的孟德尔随机化分析，探索基因表达与骨髓炎风险之间的因果关联。使用了1.0.3版本。
STAR	Alexander Dobin（冷泉港实验室）	NA	用于将RNA-seq读取对齐到参考基因组（小鼠基因组GRCm38/mm10）。
UTMOST	胡等人（开源模型）	NA	一种TWAS算法，通过使用稀疏组LASSO框架利用多组织表达数据来提高预测精度。