单次与重复旋转性闭合性头部震荡脑损伤的小鼠模型

摘要

本文描述了一种可重复的小鼠旋转性脑震荡损伤模型，提供了一种多功能方法，用于研究单次或重复性冲击后在无明显脑结构损伤情况下的细微功能和生物学机制，包括神经血管、炎症和行为学变化。

摘要

脑震荡性脑损伤（CBI）是临床脑震荡的病理生理基础，是一种常见但尚未被充分理解的疾病，部分患者可能出现长期神经系统功能障碍。尤其是重复性CBI，例如在接触性运动中发生的损伤，已被证实与持续性认知缺陷及进行性神经退行性病变（如慢性创伤性脑病，CTE）相关。为填补这一知识空白，研究建立了可重复的小鼠闭合性头部旋转性脑损伤模型，该模型能够重现CBI的关键生物力学和病理特征。采用立体定位引导的电磁打击装置对完整颅骨施加标准化打击。为减少对颅骨及邻近脑组织的局部应变，打击头端装配了定制的硅胶帽。该配置可稳定诱导头部旋转，个体间差异小，同时避免颅骨骨折或显微组织损伤。为维持生理性的神经元和血管活动，并避免深度麻醉可能带来的神经调节效应，脑损伤在清醒小鼠中进行，仅使用α2受体激动剂美托咪啶进行轻度镇静。所施加的打击导致可重复的旋转性头部运动，其微小变异主要归因于头部定位差异。脑结构完整性通过以下方法评估 体内 T2加权磁共振成像并经证实 离体 组织学分析显示，无组织破坏、挫伤或微出血的证据，但表现出微血管界面的轻度且广泛的破坏。这种新型的旋转性闭合性头部脑损伤模型为纵向研究在无明显结构性病理改变情况下出现的细微神经血管、炎症及血脑屏障改变提供了可靠的实验平台。该模型的应用有助于揭示临床脑震荡的病理生理机制以及重复性损伤可能引发的神经退行性后果，从而推动亟需的临床生物标志物的开发。

引言

创伤性脑损伤（TBI）仍是所有年龄组长期残疾的重要原因，其中青少年和年轻成年人受影响尤为严重^1,2,3。绝大多数TBI被归类为轻度（mTBI），在临床上通常称为脑震荡。尽管根据定义，脑震荡不伴有常规神经影像学可检测到的明显脑结构损伤，但越来越多的证据表明，其潜在的损伤机制——此处称为震荡性脑损伤（CBI）——代表了一种独特且具有临床意义的病理生理学实体。

特别是重复性脑震荡（CBI），尤其是在接触性体育运动和军事环境中频繁发生的短时间内连续出现的CBI，已被证实与持续的认知功能下降、神经精神症状以及慢性创伤性脑病（CTE）的发展相关^1,2,3。这种初始损伤看似轻微，却可能导致长期神经系统后遗症，这一明显矛盾为临床诊断和机制研究带来了重大挑战。

越来越多的证据表明，神经血管和神经胶质界面发生的细微但持续的改变是相关疾病机制之一⁴。这些改变包括血脑屏障（BBB）完整性、微血管结构、胶质细胞活化、神经元兴奋性以及内源性修复过程，可能将细胞水平的病理生理变化与脑外伤后（尤其是重复性脑外伤）所观察到的长期功能和行为缺陷联系起来^5,6,7,8。总体而言，这类改变正逐渐被视为导致脑外伤后延迟性功能和行为缺陷的潜在因素。然而，由于其弥散性和多面性的特点，对这些改变的机制性理解变得复杂，迄今也阻碍了靶向治疗策略的开发。

能够重现病理生理级联关键特征的临床前模型，是剖析这些机制并发现新治疗途径的重要工具。尽管目前存在多种实验性创伤性脑损伤（TBI）模型，但大多数模型旨在模拟中度至重度损伤，或依赖于局灶性结构损伤^9,10,11。相比之下，目前极度缺乏能够体现闭合性脑损伤（CBI）典型损伤机制的动物模型⁵。目前多数被标记为“轻度”的脑外伤，是通过对固定不动的头部施加局灶性撞击，甚至通过开颅后直接皮层撞击来诱导的，这种操作从根本上违背了人类脑震荡所特有的弥漫性、由加速-减速机制驱动的损伤过程^6,7。尽管此类方法可对损伤参数实现精确控制，但其在模拟真实世界脑震荡动态过程方面的局限性，降低了其转化医学的相关性。

为了克服这些局限性，目前已存在多种方法可诱导出可重复且弥散性的闭合性脑损伤^12,13,14。在上述方法的基础上，为进一步降低技术复杂性，研究人员开发了一种利用商用电磁冲击器在小鼠中建立的可控旋转性损伤模型，该设备常用于其他实验性创伤模型（例如，可控性皮层冲击，CCI）。通过向自由移动的头部施加可重复的冲击，该方法在保持颅脑结构完整的同时，能够在接近人类脑震荡生物力学特征的条件下，对单次及重复性闭合性脑损伤（CBI）后神经血管、神经胶质以及功能方面的改变进行纵向研究。

结合纵向行为评估， 体内 成像，以及 离体 组织学，该模型提供了一个多功能且易于操作的平台，用于研究单次或重复性冲击后发生的神经血管、胶质细胞及行为学改变。因此，该模型非常适合用于在具有临床相关性的实验环境中，研究轻度脑损伤（CBI）微妙的继发性病理机制，鉴定可转化的替代参数，并评估潜在的治疗干预措施。

方案

所有动物实验均符合德国动物福利法，并经机构和政府主管部门（LANUV Nordrhein-Westfalen；AZ 81-02.04.2020.A058）批准。实验按照ARRIVE指南进行。详细的示意图见图1。本方案可稳定诱导脑震荡损伤，其有效性已通过一系列结构、行为及神经血管验证指标得到证实（图2）。本研究中使用的所有材料详见材料表。

1. 一般注意事项

注意：小鼠在标准条件下群养（12 小时光照/12小时黑暗循环），可自由获取食物和水。在手术前，小鼠需在实验设施中适应至少7天。本预试验共使用40只小鼠，每组10只，分为四个实验组（假手术组作为对照组、单次CBI组、高频重复CBI组和低频重复CBI组）。将高速摄像系统设置在与小鼠头部齐平的位置，固定于小鼠前方（例如10 cm处）。为确保各次试验之间的一致性，需保持摄像机的位置和方向不变。本研究使用GoPro Hero6，以每秒240帧（fps）的速度和1080px的分辨率进行拍摄。运动学分析采用开源软件Kinovea（版本2025.2.0）完成。

2. 镇痛与麻醉诱导

1. 准备设备，包括立体定位仪和电磁撞击器的附件。
2. 在诱导创伤前两天开始通过饮水给予曲马多（1 mg/mL），并在（最后一次）手术后继续给药三天。
3. 使用一氧化二氮/氧气混合气体（O₂ 30%，N₂O 70%）中的异氟烷进行麻醉诱导，诱导舱内异氟烷浓度为4–4.5%。
4. 通过脚趾夹捏反射评估手术耐受性。当无回缩反应时，方可继续操作。
5. 将小鼠从诱导舱中取出，置于立体定位仪内的加热垫上。使用光纤直肠探针维持核心体温在37 ± 1.0 °C。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
6. 通过连接至立体定位装置的鼻罩持续输送2.0–2.5%异氟烷以维持麻醉状态。

3. 颅骨的制备

1. 使用特定的耳杆将小鼠固定在立体定位仪框架中。
2. 剃除头皮毛发，并用含酒精的消毒剂彻底消毒手术区域。
3. 通过皮下注射布比卡因（0.1 mg/kg）实施局部麻醉。
4. 在切开皮肤前重新评估脚趾夹捏反射。只有在无回缩反应时方可继续操作，以确保麻醉深度一致。
5. 沿中线做约7 mm的皮肤切口，暴露颅骨。
6. 仔细暴露位于Bregma与Lambda之间的右侧顶骨颅骨区域。
7. 确保立体定位仪框架与颅骨垂直，其垂直轴与头颅表面成90°角。
8. 将标记针安装至立体定位仪持针器中，并将其精确对准Bregma中心位置。
9. 将所有立体定位坐标归零，然后将标记针移至预设的前后（AP）和内外侧（ML）坐标位置（在本模型中为AP 0.5，ML -2.5）。用水性不褪色记号笔标记目标点。

4. 镇痛的调整

1. 松开耳杆上的小鼠。
2. 皮下注射美托咪啶（0.5 mg/kg），并逐渐将异氟烷浓度降低至<0.5%。
3. 在持续监测呼吸和体温的同时，维持异氟烷麻醉浓度在<0.5%。
4. 在上述条件下平衡10分钟，以达到稳定的麻醉状态，同时保持神经网络活动。呼吸频率、反射反应的消失以及稳定的体温（37 ± 1.0 °C）被用作标准化指标，以确保不同动物间麻醉深度的一致性。

5. 损伤诱导

注意：实验前，使用市售的聚乙烯（PE）泡沫管材隔热材料（一种闭孔非交联聚合物泡沫）制作适用于动物模型的头部固定装置，该装置可限制向下的加速度，同时允许旋转运动。此外，制作一个定制的5 mm球形撞击头，材料为Silpuran（比例1:1；硬度830 kPa）。

1. 移除直肠温度探针并停止异氟烷输送，然后将小鼠俯卧位固定在头部固定装置上。
2. 将自制的硅胶帽安装到商用冲击头端部。
3. 将电磁冲击装置安装到立体定位仪支架上，并确保装置相对于颅骨表面呈10°角。
4. 将冲击头对准颅骨上预定义的目标区域上方。
5. 降低处于伸出状态的冲击头，直至其轻轻接触颅骨表面。
6. 回缩冲击头，并向颅骨表面推进至设定的压痕深度（本实验中为3 mm）。对于对照组动物，省略降低步骤，改为将冲击头抬高相同距离。
7. 开始视频记录。通过控制开关触发电磁撞针，以5 mm/s的速度和0.1 ms的脉冲持续时间施加一次旋转性震荡冲击。
8. 冲击完成后立即回缩冲击头。
9. 使用拮抗剂阿替帕唑（0.5 mg/kg，皮下注射）逆转美托咪定麻醉作用。

6. 冲击后评估与伤口闭合

1. 将小鼠置于仰卧位。
2. 通过记录动物恢复至俯卧位所需的时间来评估翻正反射。
3. 使用异氟烷在氧化亚氮/氧气混合气体（O₂ 30%，N₂O 70%）中以4%异氟烷重新诱导麻醉。
4. 将小鼠从诱导室中取出，并放置于立体定位仪旁的加热垫上。使用光纤直肠探头维持核心体温在37 ± 1.0 °C。
5. 使用耳杆将小鼠固定在立体定位仪上。
6. 使用可自行吸收的缝合线（例如Polyglactin 910，6-0）进行间断缝合关闭皮肤切口。
7. 将小鼠转移至保温箱中，并持续监测直至意识完全恢复。
8. 将动物放回其原有饲养笼中。

7. 重复性冲击范式

1. 根据实验设计将小鼠分配至假手术组、单次损伤组或重复损伤组。
2. 对于重复损伤组，应按照预定时间间隔（例如每48小时）安排后续的CBI操作。
3. 每次后续CBI操作前，通过饮水给予曲马多进行术前镇痛，具体方法见第3.1节。
4. 重复执行第3–6节所述的麻醉、立体定位标记和撞击操作流程，包括皮下注射布比卡因（0.1 mg/kg）进行局部麻醉，皮下注射美托咪啶（0.5 mg/kg），同时维持异氟烷浓度在< 0.5%；立体定位靶点为前囟后0.5 mm、内侧2.5 mm；使用电磁撞击装置施加旋转性冲击性损伤（压痕深度3 mm，速度5 mm/s，脉冲持续时间0.1 ms，相对于颅骨表面成10°角）。
5. 确保在重复操作中保持一致的体位（俯卧于允许旋转运动的聚乙烯泡沫头架上）、相同的撞击参数（角度、深度、速度和持续时间）以及标准化的围手术期和术后条件，包括使用阿替帕唑（0.5 mg/kg，s.c.）拮抗美托咪啶、以4%异氟烷（O₂ 30%/N₂O 70%）重新诱导麻醉，以及将体温控制在37 ± 1.0 °C，以保证不同动物及不同时间点之间的可重复性。
6. 确保在重复操作中体位、撞击参数和恢复条件的一致性，以维持不同动物及不同时间点之间的可重复性。
7. 在重复撞击后持续监测动物是否出现累积性的行为功能缺陷。

8. 运动学分析

1. 将视频导出为标准格式（例如 MP4）以供分析，并将其加载到 Kinovea 软件中。
2. 导航至包含冲击前和冲击后帧的相关时间窗口（例如，从冲击时刻起 -0.025 至 0.3 秒）。确保在软件设置中设定合适的帧率（例如 240 fps）。定义一个比例参考（例如，双眼之间的距离）。
3. 使用 Kinovea 的跟踪工具建立三点跟踪设置（例如，右眼、左眼、鼻尖；图 3A）。对每个点开始跟踪，并手动校正跟踪错误，特别是在快速运动或遮挡期间。
4. 将跟踪得到的坐标导出为 CSV 或 Excel 文件。
   注意：进一步的运动学分析使用自定义的 MATLAB 脚本完成。从 Kinovea 导出的时间分辨跟踪数据被导入并进行预处理，以去除无效数据点并确保时间尺度一致。头部平移定义为三个跟踪标志点（右眼、左眼和鼻尖）的质心，据此通过数值微分计算线性位移、速度和加速度。头部旋转通过眼-鼻轴的方向估算，角位移相对于冲击前基线计算，角速度为其一阶导数。为减少噪声放大，所有位置和角度信号在微分前均采用 Savitzky–Golay 滤波器进行平滑处理。主要结局参数为最大角位移，而速度和加速度曲线则作为各次试验中头部运动动力学的相对指标进行分析。

结果

一般注意事项：

应用本方案可稳定地诱导出脑震荡性脑损伤，这一结论已通过一系列明确的结构、行为及神经血管验证指标得到证实（见图2）。损伤后脑组织的结构完整性得以保持，未观察到明显的宏观组织破坏或出血，表明该方案诱导的是脑震荡性而非挫伤性脑损伤。组织学评估进一步证实，组织结构保持完整，无明显细胞大量丢失或空洞形成。此外，在所设定的冲击参数下，对实验动物进行的结构成像和组织学分析均一致未发现脑挫伤或微出血。

冲击诱导

头部运动学分析（图3B）显示头部旋转一致（平均旋转角度 = 18.9°，标准差 = 6.1°），支持以旋转性加速-减速机制为主的作用模式。

撞击后评估

讨论

本文描述了一种基于加速度-减速度损伤的新型闭合性头部创伤（CBI）小鼠模型，该模型具有轻度但广泛的血脑屏障功能障碍，以及一种类似于临床脑震荡的独特神经精神表型。该模型以可控且一致的方式再现了CBI的关键特征，同时保持了结构完整性，为研究CBI及其神经精神和认知后遗症的潜在机制提供了一个有用且特征明确的实验框架。

实验方案中的关键步骤是决定头部有效机械载荷的部分。特别是，需要精确的立体定位对准以及相对于撞击装置可重复的头部位置，以确保在不同动物之间产生一致的旋转性损伤矢量。撞击装置参数的标准化，包括位置、角度和设置，以及在实验运行前进行常规校准，对于最小化变异至关重要。由于撞击位置或旋转角度的微小偏差可能对损伤严重程度产生不成比例的影响，操作人员的严格一致性以及对设置参数的详细记录是实验可重复性的关键。为了进一步提高方法学的严谨性并便于技术问题的排查，强烈建议在撞击过程中进行高速视频记录以捕捉头部运动。事后对头部线性和旋转运动学参数的量化分析，有助于识别低于阈值的撞击、过度的线性加速度或偏离轴心的旋转，这些异常可能在常规操作中被忽略。该方法有助于区分技术偏差与生物学变异，并支持对实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
药物
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Medetomidine拮抗剂（α2-肾上腺素受体拮抗剂），皮下注射（0.5 mg/kg）
Bepanthen眼用软膏	Bayer	11809917	麻醉期间眼部保护，局部使用
Bupivacaine	Sigma-Aldrich	B1160000	局部麻醉，皮下注射（0.1 mg/kg）
Isoflurane	CP pharma	1214CN	麻醉，吸入给药（诱导和维持）
Medotomidine	Vetoquinol	VM 06043/4003	镇静/麻醉辅助药（α2-肾上腺素受体激动剂），皮下注射（0.5 mg/kg）
盐酸曲马多（100 mg/mL）	Grünenthal	6867645	镇痛药，通过饮水给药，小鼠终浓度为1 mg/mL，术前2天至术后3天使用
设备
聚乙烯颈部垫	定制		俯卧位时用于支撑，在冲击过程中提供稳定支持
Sterotaxic Impactor Silupran盖板	定制		分散机械载荷，防止局部颅骨损伤，连接至撞击器尖端，压力为830 kPa
立体定位撞击器	Leica Biosystems	39463923/IM10131	用于精确控制冲击递送的电磁式撞击装置
工具
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		（版本 2025.2.0）
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA