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本研究遵循系统综述与荟萃分析首选报告项目（PRISMA）指南10进行。该研究方案已在PROSPERO（CRD42024584767）注册。本系统综述和荟萃分析中使用的数据库、软件、偏倚风险工具、GRADE方法及方法学资源均列于 材料表中。
1. 考虑研究的标准
如果研究包含被诊断为有症状膝关节炎的≥18岁成年人，则被视为符合条件。符合条件的干预措施包括口服甲氨蝶呤，无论其制剂、剂量或治疗时间如何。只有在所有研究组均等使用任何联合用药或共同干预时，才纳入研究。对照干预为安慰剂组，当干预组与对照组仅添加甲氨蝶呤时，研究即符合资格。如果使用非甾体抗炎药等额外治疗，两组必须完全相同，以避免混杂效应。
主要关注的结果是西安大略大学和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）总得分的变化。次级疗效结果包括WOMAC疼痛、WOMAC僵硬和WOMAC身体功能评分的变化。所有纳入的研究均采用相同的标准化WOMAC 0–100量表报告结局;因此，无需转换分数。对于报告多个随访时间点的研究，选择最接近24周的时间点，因为该时间点在纳入试验中最常见。可用的随访时间为16周和24周，报告两者时，分析优先包含24周数据。仅有随机对照试验被认为符合纳入条件，交叉试验则被排除。
2. 搜索策略
一位评审者（YouTube）从开始到2026年5月1日，在PubMed、Embase、Cochrane中央对照试验注册库（CENTRAL）和中国国家知识基础设施（CNKI）中进行了系统检索，且不限语言。核心搜索词结合 了“膝关节骨关节炎” （MeSH及自由文本：膝骨关节关节炎、膝关节骨关节炎、性关节炎）和 “甲氨蝶呤” （MeSH及自由文本：甲氨蝶呤、MTX、风湿性动物）使用布尔算符AND进行检索。采用了随机对照试验过滤器和人体研究过滤器。所有搜索均在标题、摘要和关键词字段中进行。针对数据库进行了调整：PubMed 采用了 MeSH 和标题/摘要语法;Embase使用EMTREE术语;CENTRAL使用标准的Cochrane RCT滤波器;中国中央信息使用了中文关键词。此外，WHO国际临床试验注册平台（ICTRP）使用 “膝关节骨关节炎” 和 “甲氨蝶呤” 等术语检索，以识别正在进行或未发表的试验（灰色文献）。所有数据库的确切执行日期为2026年5月1日。为确保全面性，已识别试验和系统评价的参考文献列表进行了人工审查。完整的搜索策略见 补充表1。
3. 研究选择
在排除重复研究后，两位评审员（YT和NW）独立评估了所有标题和摘要的相关性。此外，还收集了所选文章的全文，以评估其纳入资格。评审者之间的分歧通过共识或咨询第三位评审人（SH）来解决。
4. 数据收集流程
两位评审员（YouTube和NW）分别采用标准化表格独立提取纳入试验的数据。当变化标准差未被报告时，采用公式SD_change = √（SD_baseline² + SD_final² – 2r·SD_baseline·SD_final）具有保守相关系数 r = 0.5。通讯作者也 通过电子邮件联系 ，以获取必要的缺失数据。差异通过共识或邀请第三位评审员（SH）协助解决。
5. 安全结果
还从每个纳入试验中提取了安全性结局，包括不良事件、严重不良事件、治疗中止或撤销、肝功能异常、血细胞计数异常及其他报告的实验室异常。由于纳入的试验在安全性-结局定义、报告格式及实验室异常数据完整性方面存在差异，这些结局被汇总在结构化描述表中。
6. 质量评估
两位独立评审者（YT和NW）根据Cochrane工具评估了随机临床试验11的偏倚风险，该试验包含五个领域。每个试验为每个领域分配了研究级别的风险，显示偏倚风险的水平为低、高或某些问题。荟萃分析中的证据确定性采用基于既定指南的推荐评级、评估、开发与评估（GRADE）方法进行评估，12。评估中的任何分歧通过共识解决，或在未能达成共识时邀请第三位评审员（SH）来做最终决定。
7. 数据综合
数据综合使用RevMan（Cochrane协作组）进行。为保持一致性并考虑潜在偏差，所有分析均采用意图治疗原则，该原则包括所有随机参与者，无论其是否遵守干预。对于连续变量，采用逆方差随机效应模型来合并数据。研究间方差（τ²）使用RevMan 5.4默认方法DerSimonian-Laird估计器13估算。所有四项纳入试验均报告了标准化0–100分制的WOMAC评分;因此，采用均值差（MD）而非标准化均值差（SMD），因为使用相同指标时MD更具临床解释性。结果以MD形式报告，并配有相应的95%置信区间（CI）。p值低于0.05被视为统计学显著。异质性通过I²检验量化。由于仅纳入四项研究（k<10项），未正式评估发表偏倚（如漏斗图或埃格尔检验），因此此类检验力度不足，且Cochrane指导不推荐此类检验。这些严谨的统计方法和原则被采纳，旨在对现有数据进行全面且稳健的分析。此外，由于仅纳入四项研究，未进行正式的发表偏差检验（如漏斗图不对称或埃格尔检验），而当研究数量少于10项时，这些检验不可靠，可能导致误导性结论。
8. 亚群分析
根据随访时间（<6个月和≥6个月）进行了亚组分析。
9. 敏感性分析
本荟萃分析的敏感性分析通过（1）使用固定效应模型，（2）排除偏倚风险高或未知的试验，（3）排除6个月及以上的试验，以及（4）仅包括英语文献进行。这些分析旨在评估研究结果的稳健性并提升结果的可靠性。