本方案描述了一种通过在离心前添加钴胺素和α-生育酚以生物精细调控富血小板纤维蛋白的方法，从而实现对生长因子和细胞因子释放的可控调节 体外 条件。
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摘要
摘要
富血小板纤维蛋白（PRF）是一种自体生物材料，因其良好的生物相容性及可持续释放生长因子的特性，被广泛应用于再生牙科领域。近年来，研究重点逐渐转向通过生物学手段对PRF进行调控，以在不改变其基本制备原则的前提下提升其再生性能。本研究提出一种在离心前通过添加钴胺素和α-生育酚对PRF进行生物学精细调控的实验方案，并评估这两种成分对PRF释放生长因子及促炎性细胞因子的影响 体外 条件。采集自健康志愿者的外周血样本采用固定的离心程序进行处理。在离心前向全血中添加钴胺素或α-生育酚，以获得生物活性修饰的富血小板纤维蛋白（PRF）基质。使用酶联免疫吸附测定法在24小时和72小时定量检测血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放谱。富含钴胺素的PRF与组间TGF-β1水平的显著差异相关，并表现出促炎性细胞因子释放减少，提示其向更有利的再生微环境转变。相比之下，FGF-2和IGF-1的升高呈时间依赖性，在所有组中均有检出，但未显示钴胺素特异性效应。富含α-生育酚的PRF表现出VEGF释放的选择性增加，提示其可能具有促血管生成作用。这些结果表明，靶向性维生素富集可在保持PRF自体来源和无抗凝剂特性的前提下，实现对其生物活性的可控调节。本方案为PRF的生物学精细调控提供了实用框架，支持其作为可调节的再生平台用于未来的转化研究与临床应用。
引言
富血小板纤维蛋白（PRF）是一种第二代自体血小板浓缩物，由于其具有良好的生物相容性、制备简便以及能够持续释放生长因子等优点，已被广泛应用于牙周病学、种植牙科和口腔外科领域1,2。PRF通过将全血在不使用抗凝剂或外源性激活剂的条件下进行离心获得，形成一种三维结构的纤维蛋白基质，可有效包埋血小板和白细胞。这些细胞成分作为内源性生长因子的储存库，包括血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、类胰岛素生长因子-1（IGF-1）以及成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），共同调控组织再生过程中的血管生成、细胞迁移、增殖以及细胞外基质重塑3,4。
除了其生物学组成外，富血小板纤维蛋白（PRF）的再生性能还受到其纤维蛋白网络结构及其细胞成分生物学活性的显著影响。因此，近期研究已超越传统的制备方案，开始将PRF概念化为一种生物学上可调控的载体系统，而不仅仅是一种被动的支架材料5,6。结构修饰策略，例如引入透明质酸和胶原蛋白等生物材料，已证明可改变PRF的物理和力学特性，从而影响纤维蛋白的排列结构、力学稳定性以及生长因子的释放动力学7。这些发现不断积累证据，支持PRF可根据特定再生需求进行适应性调整的观点。
与基于生物材料的方法并行，基于维生素的富集已成为调节PRF生物活性的一种具有生物学相关性的策略。已知维生素可调控代谢、氧化还原平衡、胶原蛋白合成、血管生成以及炎症信号传导等基本细胞过程。特别是，如抗坏血酸、胆钙化醇、钴胺素和α-生育酚等维生素已被证明可通过不同的分子通路影响细胞行为和组织修复8。既往的体外研究表明，富含维生素的PRF制剂能够调节生长因子的释放谱型、炎症性细胞因子的表达以及纤维蛋白基质的生物力学特性，表明维生素补充是一种在不改变PRF自体来源特性的前提下，对其生物学特性进行有效调控的方法9。
钴胺素（维生素B12）和α-生育酚（维生素E）是参与组织稳态与修复相关关键生物学过程的必需微量营养素。维生素B12在核酸合成、细胞代谢和红细胞生成中发挥重要作用，其缺乏与口腔黏膜改变及牙周组织破坏相关。10,11维生素E作为一种强效抗氧化剂，可限制脂质过氧化，减轻氧化应激，并有助于胶原蛋白的稳定以及炎症反应的调节。12,13重要的是，尽管本研究基于先前关于探索PRF不同生物和生理调节因子的工作，但当前研究引入了一种独特的方案，即在离心前特异性地用钴胺素和α-生育酚进行富集。因此，本研究旨在描述一种可重复的制备钴胺素和α-生育酚富集型PRF的方案，并评估这种生物活性精细调控方法对生长因子和促炎性细胞因子释放的影响 体外 条件。
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方案
本实验研究遵循《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则，并已获得土耳其查库罗瓦大学临床研究伦理委员会批准（批准号：139/25；日期：8th 2023年12月）。在参与研究之前，所有个体均被告知研究流程，并签署书面知情同意书。涉及人类血液样本的所有操作均严格遵守机构生物安全规定。实验全程使用适当个人防护装备（PPE），包括手套、口罩和实验服。生物材料操作采用无菌技术，所有废弃物均按照既定的生物危害管理规程进行处理。本研究中使用的所有试剂、耗材和设备均列于下文 材料表，包括制造商信息和相关技术参数，以确保可重复性。
1. 受试者选择
受试者从年龄在20至30岁之间的系统健康成年人中招募，且需表现出对研究流程的良好依从性。有系统性疾病、血液系统疾病或已知会影响血小板功能或伤口愈合状况病史的个体不符合入选资格。其他排除标准包括妊娠或哺乳期、当前吸烟、近期感染、已知对钴胺素或α-生育酚过敏，以及在过去六个月内使用可能干扰血小板活性的维生素补充剂或药物。为减少生物学变异，仅纳入基线血液学检查结果正常的志愿者，并在纳入前对所有受试者进行评估，以确保适合进行富血小板纤维蛋白（PRF）制备。作为一项初步探索性临床研究，本研究的样本量基于研究期间可行性和合格受试者的可获得性确定，共分析了十二名受试者的样本。
2. 血液采集与分组
在无菌条件下，使用不含添加剂的10 mL玻璃试管从每位参与者处采集外周静脉血。每位参与者共采集五支试管。其中一支用于全血细胞计数分析，另一支用于测定基础血清钴胺素和α-生育酚水平。剩余三支试管用于制备富血小板纤维蛋白（PRF）。在这三支试管中，一支作为不含任何添加剂的对照PRF组；一支在离心前加入钴胺素（1 mL），以制备钴胺素富集型PRF；另一支在离心前加入α-生育酚（0.5 mL），以制备α-生育酚富集型PRF。钴胺素采用无菌注射液形式（1000 µg/mL），α-生育酚以安瓿瓶形式使用（2 mL）。所有样本在采集后立即处理，以避免过早凝固。
3. PRF 的制备
使用无菌、不含抗凝剂的玻璃试管从每位参与者处采集外周静脉血样本。采集后立即放入离心机中进行处理，以防止过早凝固。采用固定角度转子系统，在室温下以 2700 rpm（708 × g）离心 12 分钟。离心完成后，可观察到三个明显分层：下层为红细胞部分，上层为血小板贫乏血浆层，中间层为富含血小板纤维蛋白（PRF）的纤维蛋白凝块。使用无菌器械将 PRF 凝块小心地与红细胞层分离，并单独取出用于后续处理。对于制备富集型 PRF 组，指定的添加剂在标准化条件下于离心前立即加入血液样本中。该方法可在凝块形成过程中将生物活性化合物整合入正在形成的纤维蛋白基质中（图 1）。
图1：获取PRF样本的方法学流程图。 在离心前，向血液样本中加入1 mL的钴胺素（A）和0.5 mL的α-生育酚（B）。离心后试管中的PRF样本（C），以及从红细胞层分离后的样本（D）。最终获得的钴胺素富集型PRF（E）和α-生育酚富集型PRF（F）。请点击此处查看此图的放大版本。
4. 体外 PRF 样本的孵育
每个PRF凝块被转移至无菌管中，并按每1 g凝块加入1 mL培养基的标准比例（1:1，v/w）添加细胞培养基，以确保所有样本具有统一的扩散环境。将试管置于摇床中，在37 °C下孵育72 h，以促进PRF基质中生长因子和细胞因子的逐步释放。分别在24 h和72 h收集上清液，转移至无菌微量管中，并于−80 °C保存，待后续分析。细胞培养基未添加血清，以避免外源性生长因子的干扰，确保所检测到的所有生物分子均 solely 来源于PRF基质。
5. 生长因子ELISA分析
采用酶联免疫吸附测定试剂盒，根据制造商说明书定量检测所收集上清液中血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度。使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，并根据标准曲线计算待测物的浓度。
6. 统计学分析
采用 IBM SPSS Statistics for Windows（版本 20.0）进行统计学分析。根据情况，数据以均值 ± 标准差或中位数（最小值–最大值）表示。使用 Shapiro–Wilk 检验评估数据分布的正态性。组内不同时间点之间的比较采用配对 t 检验或 Wilcoxon 符号秩检验，组间比较则根据情况采用重复测量方差分析或 Friedman 检验。以 p 值 <0.05 为差异具有统计学意义。
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结果
所有参与者均成功制备了对照组、钴胺素富集型和α-生育酚富集型富血小板纤维蛋白（PRF）。大体观察证实形成了结构良好的PRF凝块，纤维蛋白完整性得以保持，并具有足够的机械稳定性，可实现标准化的操作、孵育以及后续的生物化学分析（表1）。
...| 变量 | 时间 | 组别 | 组间比较 | 组别(时间) | |||||
| 对照组 | 钴胺素组 | α-生育酚组 | p | 对照组- 钴胺素组 | |||||
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讨论
本研究表明，富血小板纤维蛋白（PRF）可在离心前通过靶向富集钴胺素和α-生育酚进行生物学精细调控，从而实现对生长因子和细胞因子释放谱的显著且可重复的调节。这些发现进一步支持了当前不断发展的观点：PRF不仅是一种被动的自体支架，更是一种具有生物响应性的基质，其再生行为可通过精心选择的生物活性干预手段进行调节，同时不改变其基本制备原则。
富血小板纤维蛋白（PRF）主要通过其三维纤维蛋白结构中嵌入的血小板和白细胞来源的生长因子的持续释放来发挥再生潜能。该纤维蛋白网络的结构以及被包裹细胞成分的生物活性，在决定生长因子释放的强度和时间动态方面起着关键作用14。在此背景下，于纤维蛋白聚合前进行生物活性物质的富集，是一种合理策略，可在维持PRF自体来源且不含抗凝剂特性的同时，调控其下游生物学反应15。本实验方案基于这一原理，在离心前加入钴胺素和α-生育酚，使这些分子能够整合至正在形成的纤维蛋白基质中。
当前研究结果还应结合其他自体血小板浓缩物，尤...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-生育酚（维生素E） | AKSU FARMA，土耳其伊斯坦布尔 | A11HA03 | 安瓿瓶 EVIGEN 2 mL |
| 离心机（40° 固定角转子 | 法国尼斯的PRF制备流程 | 913023410238 | Duo 离心机 |
| 钴胺素（维生素B12） | DEVA 控股公司，土耳其伊斯坦布尔 | B03BA01 | 安瓿 DODEX 1000 mcg/mL |
| Eppendorf 管 | Axygen | PCR-02-C | 200 件 |
| 玻璃采血管 | Hema & Tube（伊斯坦布尔，土耳其） | HNM8080 | （10 mL）无抗凝剂 |
| HRP 溶液 | 包含在ELISA试剂盒中 | ||
| 人ELISA试剂盒 - FGF | 武汉菲恩生物科技 | EH0541 | Fine Test |
| 人 IGF-1 ELISA 试剂盒 | 武汉菲恩生物科技 | ER0030 | 精细测试 |
| 人ELISA试剂盒 - PDGF | 武汉菲恩生物科技 | ER1240 | 精细测试 |
| 人 ELISA 试剂盒 - TGFβ-1 | 武汉菲恩生物科技 | EH0287 | 精细检测 |
| 人ELISA试剂盒 - VEGF | 武汉菲恩生物科技 | EH0327 | Fine Test |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | 武汉菲恩生物科技 | EH0185 | Fine Test |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | 武汉菲恩生物科技 | EH0302 | Fine Test |
| 微量移液器 &和技巧 | Eppendorf | 3123000063 | 1 设置 |
| 酶标仪 | Biochrome | EZ Read 400 | 450 nm |
| 轨道摇床 | Stuart | SSM3 | 小型旋涡振荡器 |
| 精密天平 | 赛多利斯 | H51-D | 1 件 |
| RPMI-1640 细胞培养基 | HyClone，Cytiva，美国 | SH30027.01 | 500 mL |
| 无菌剪刀 | ASA Dental（土耳其伊斯坦布尔） | 0305-1 | 1 件 |
| 终止液 | 包含在ELISA试剂盒中 | ||
| 底物溶液 | 包含在ELISA试剂盒中 | ||
| 洗涤缓冲液 | 包含在ELISA试剂盒中 |
参考文献
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