本研究评估了NEAT1作为腹泻型肠易激综合征中肠道屏障功能障碍的诊断标志物及调控因子的作用。NEAT1在患者血清中表达升高，可结合miR-29b-3p，其敲低可改善脂多糖损伤的Caco-2细胞的屏障功能、凋亡及炎症相关指标。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
研究文章
* These authors contributed equally
本研究评估了NEAT1作为腹泻型肠易激综合征中肠道屏障功能障碍的诊断标志物及调控因子的作用。NEAT1在患者血清中表达升高，可结合miR-29b-3p，其敲低可改善脂多糖损伤的Caco-2细胞的屏障功能、凋亡及炎症相关指标。
腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的发病机制尚不明确，现有治疗手段仍有限。本研究评估了NEAT1在IBS-D中的诊断价值，并探讨其潜在的调控机制。共纳入116例IBS-D患者和116名健康对照者。采用反转录定量实时PCR（RT-qPCR）检测血清中NEAT1和miR-29b-3p的水平，并通过受试者工作特征（ROC）曲线评估其诊断价值。在机制研究中，建立脂多糖（LPS）处理的Caco-2肠上皮细胞模型。采用CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，跨上皮电阻（TEER）评估屏障完整性，RT-qPCR检测ZO-1、occludin和claudin-2的mRNA水平。双荧光素酶报告基因（DLR）和RNA免疫沉淀（RIP）实验用于验证NEAT1与miR-29b-3p之间的结合关系。结果显示，IBS-D患者中NEAT1高表达，miR-29b-3p低表达，二者水平呈显著负相关。NEAT1敲低可上调miR-29b-3p水平，增强细胞活力和TEER，减少细胞凋亡，提高ZO-1和occludin的mRNA水平，降低claudin-2的mRNA水平，并缓解LPS处理的Caco-2细胞中与屏障损伤相关的各项指标。综上所述，血清NEAT1可能是IBS-D的候选生物标志物，且NEAT1/miR-29b-3p轴可能参与了肠屏障功能障碍的调控过程。
以腹泻为主的肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其特征为腹痛、腹胀以及排便习惯改变1。目前，IBS-D 的病理生理机制尚未完全阐明2。现有的治疗方法主要为对症缓解，疗效有限且复发率较高3。普遍认为 IBS-D 涉及多种因素的相互作用，例如脑-肠轴调节异常、内脏高敏感性、低度肠道炎症以及屏障功能障碍4,5。尽管这些诊断标准在一定程度上实现了诊断的规范化，但其主观性较强，可能导致诊断延迟或误分类，尤其是在患者症状与炎症性肠病或其他器质性疾病重叠时。在常规临床实践中，目前尚无经过验证的 IBS-D 客观生物标志物。因此，探索一种既可作为诊断标志又具有潜在治疗价值的新型分子靶点，已成为当前 IBS-D 研究领域的一项迫切需求。
近年来，长链非编码RNA作为表观遗传调控中的关键分子，在多种疾病的诊断标志物和治疗靶点方面展现出巨大潜力6，7。腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的主要病因是肠道屏障功能受损8。紧密连接蛋白的破坏导致"肠漏"....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
患者的纳入
所有参与者在充分了解研究内容后均签署了书面知情同意书。本研究方案已通过上海市浦东新区人民医院伦理委员会审查批准（编号：2024k007）。样本量使用G*Power软件进行计算：所选检验方法为t检验，统计检验设计用于检测两组独立样本之间的差异。设定效应量d = 0.5，α = 0.05，检验效能 = 0.9，计算结果表明每组至少需纳入86例受试者。为应对试验过程中可能出现的不可预见情况，每组实际纳入116例患者。本研究共纳入2024年7月至2025年7月期间在上海市浦东新区人民医院就诊的116例腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者作为实验组。纳入标准为：（1）符合罗马IV诊断标准的IBS-D患者；（2）结肠镜检查显示黏膜无器质性病变。排除标准为：（1）患有炎症性肠病（IBD）、结直肠癌等疾病者；（2）糖尿病患者；（3）近期有腹部手术史者；（4）患有严重心、肝、肾功能不全者。同时，招募了116名在年龄、性别等人口学特征上与患者相匹配的健康志愿者作为对照组。健康对照者经确认无慢性胃肠道疾病史及相关临床症状。对所有受试者采集5 mL外周静脉血，将上清液转移至-80 °C超低温冰箱中冷冻保存，以备后续RNA提取使用。
每位参与者均完成了一份为期10天的问卷，用于记录以下临床表现：（a）采用10分制视觉模拟量表评估腹痛严重程度；（b）调查期间腹痛发作频率（疼痛天数）；（....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
NEAT1 的表达及诊断价值
与健康对照（HC）组相比， NEAT1 IBS-D 患者中的表达水平显著升高（P < 0.0001; 图1A曲线下面积（AUC） NEAT1，如受试者工作特征（ROC）曲线所示，为0.867（95% CI：0.821–0.913）。其特异性为75.9%，敏感性为84.5%（图1B）。这表明异常 NEAT1 IBS-D 患者血清中的表达可作为该疾病的一种新型诊断生物标志物。
此外，对健康组和腹泻型肠易激综合征（IBS-D）组患者的临床数据进行了比较。结果显示，两组在年龄、性别或其他特征方面均无显著差异（P > 0.05）。然而，在HADS评分、排便次数和粪便形态方面存在显著差异（P < 0.0001，表.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其病理机制尚未完全阐明。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）作为表观遗传调控中的关键分子，在疾病诊断与治疗领域展现出巨大潜力。lncRNA NEAT1 已在多种疾病中被研究，如结直肠癌24、胶质瘤25和心肌梗死26。多项研究表明，NEAT1 参与调控炎症反应13、细胞增殖27以及肠道屏障完整性28。然而，NEAT1 在 IBS-D 中的特异性表达、其临床价值以及在 IBS-D 发生发展中的调控机制仍有待深入探索。
NEAT1 在多种炎症条件下表达上调，例如肺炎29、骨关节炎30
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | Corning | CLS3524 | 用于细胞接种 |
| 96孔板 | Corning | CLS3599 | 用于CCK-8实验中的细胞接种 |
| Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | V13242 | 用于检测细胞凋亡率 |
| 抗AGO2单克隆抗体 | Proteintech | 67934-1-Ig | 用于免疫沉淀Ago2结合的RNA复合物 |
| 抗Claudin-2抗体 | Invitrogen | 32-5600 | 一抗，稀释比例1:1000 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | 一抗，稀释比例1:5000；作为上样对照 |
| 抗人IgG抗体 | Proteintech | 10284-1-AP | 用作RIP实验的阴性对照 |
| 抗Occludin抗体 | Abcam | ab31721 | 一抗，稀释比例1:500 |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | 一抗，稀释比例1:1000 |
| Caco-2细胞 | SUNNCELL | SNL-068 | 用于构建肠上皮屏障模型 |
| CCK-8试剂盒 | Solarbio | CA1210 | 细胞增殖检测试剂盒 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | 用于RNA提取过程中的相分离 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | 用于细胞培养 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | ThermoFisher | 16186 | 用于检测荧光素酶活性 |
| ELISA试剂盒（用于IL-1β） | R&D Systems | DY201 | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| ELISA试剂盒（用于IL-6） | R&D Systems | D6050B | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| ELISA试剂盒（用于IL-8） | R&D Systems | NBP3-28022 | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| ELISA试剂盒（用于TNF-α） | R&D Systems | DTA00D | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| 增强型化学发光（ECL）底物 | Thermo Fisher | 32106 | 用于显影蛋白条带 |
| 乙醇（75%） | Sigma-Aldrich | 459844 | 用于洗涤RNA沉淀 |
| FBS（胎牛血清） | Gibco | 10099141 | 用于细胞培养 |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | B53002 | 用于检测细胞凋亡率 |
| HRP标记的二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | 催化ECL底物产生化学发光信号 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 1133502500 | 用于RNA沉淀 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | 转染试剂 |
| 脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich | L2880 | 用于诱导构建细胞模型 |
| 酶标仪 | BioTek | Epoch 2 | 用于检测96孔板中样品的吸光度 |
| Nanodrop微量分光光度计 | Thermo Scientific | ND-2000C | 用于测定RNA浓度和纯度 |
| 脱脂奶粉 | Coolaber | CN7861 | 用于封闭膜（配制成5%溶液） |
| PARIS试剂盒 | Thermo Fisher | AM1921 | 用于细胞核质分离 |
| 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140122 | 用于防止细胞培养过程中的污染 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
| pmirGLO双荧光素酶载体 | Promega | E1330 | 双荧光素酶报告基因载体 |
| PrimeScript RT反转录试剂盒 | Takara | RR047A | 用于将RNA反转录为cDNA |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | 用于SDS-PAGE后的蛋白转膜 |
| 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | 4365464 | 用于检测目标基因 |
| RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂） | Thermo Fisher | 89901 | 用于细胞总蛋白提取 |
| RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-701 | 使用Protein A/G磁珠进行RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验 |
| SDS-PAGE试剂（10%胶） | TargetMol | C0189 | 用于按分子量分离蛋白质 |
| SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | 4309155 | 用于PCR检测 |
| 跨膜电阻测量仪（伏欧表） | Millipore | MERS00002 | 跨膜电阻测量仪，用于测定单层细胞完整性 |
| Transwell小室 | Corning Costar | CLS3413 | 用于单层细胞培养及TEER值测定 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026CN | 用于总RNA提取 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。