本研究评估了NEAT1作为腹泻型肠易激综合征中肠道屏障功能障碍的诊断标志物及调控因子的作用。NEAT1在患者血清中表达升高，可结合miR-29b-3p，其敲低可改善脂多糖损伤的Caco-2细胞的屏障功能、凋亡及炎症相关指标。
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研究文章
* These authors contributed equally
本研究评估了NEAT1作为腹泻型肠易激综合征中肠道屏障功能障碍的诊断标志物及调控因子的作用。NEAT1在患者血清中表达升高，可结合miR-29b-3p，其敲低可改善脂多糖损伤的Caco-2细胞的屏障功能、凋亡及炎症相关指标。
腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的发病机制尚不明确，现有治疗手段仍有限。本研究评估了NEAT1在IBS-D中的诊断价值，并探讨其潜在的调控机制。共纳入116例IBS-D患者和116名健康对照者。采用反转录定量实时PCR（RT-qPCR）检测血清中NEAT1和miR-29b-3p的水平，并通过受试者工作特征（ROC）曲线评估其诊断价值。在机制研究中，建立脂多糖（LPS）处理的Caco-2肠上皮细胞模型。采用CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，跨上皮电阻（TEER）评估屏障完整性，RT-qPCR检测ZO-1、occludin和claudin-2的mRNA水平。双荧光素酶报告基因（DLR）和RNA免疫沉淀（RIP）实验用于验证NEAT1与miR-29b-3p之间的结合关系。结果显示，IBS-D患者中NEAT1高表达，miR-29b-3p低表达，二者水平呈显著负相关。NEAT1敲低可上调miR-29b-3p水平，增强细胞活力和TEER，减少细胞凋亡，提高ZO-1和occludin的mRNA水平，降低claudin-2的mRNA水平，并缓解LPS处理的Caco-2细胞中与屏障损伤相关的各项指标。综上所述，血清NEAT1可能是IBS-D的候选生物标志物，且NEAT1/miR-29b-3p轴可能参与了肠屏障功能障碍的调控过程。
以腹泻为主的肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其特征为腹痛、腹胀以及排便习惯改变1。目前，IBS-D 的病理生理机制尚未完全阐明2。现有的治疗方法主要为对症缓解，疗效有限且复发率较高3。普遍认为 IBS-D 涉及多种因素的相互作用，例如脑-肠轴调节异常、内脏高敏感性、低度肠道炎症以及屏障功能障碍4,5。尽管这些诊断标准在一定程度上实现了诊断的规范化，但其主观性较强，可能导致诊断延迟或误分类，尤其是在患者症状与炎症性肠病或其他器质性疾病重叠时。在常规临床实践中，目前尚无经过验证的 IBS-D 客观生物标志物。因此，探索一种既可作为诊断标志又具有潜在治疗价值的新型分子靶点，已成为当前 IBS-D 研究领域的一项迫切需求。
近年来，长链非编码RNA作为表观遗传调控中的关键分子，在多种疾病的诊断标志物和治疗靶点方面展现出巨大潜力6，7。腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的主要病因是肠道屏障功能受损8。紧密连接蛋白的破坏导致"肠漏"，进而激活黏膜免疫反应9，10。免疫系统的激活会释放大量促炎因子，通过激活肠免疫-神经系统引起肠道功能障碍。研究表明，某些lncRNA能够调控肠道上皮屏障11，12。NEAT1在结肠炎患者结肠黏膜组织中已被报道呈上调表达13。抑制lncRNA NEAT1可缓解溃疡性结肠炎中肠道上皮细胞（IECs）的功能障碍14。然而，NEAT1在IBS-D中的表达谱及其诊断价值尚未得到研究。此外，NEAT1可能具有作为诊断生物标志物的潜力15。如果NEAT1在IBS-D患者血清中异常表达，则有望补充现有的罗马IV诊断标准，提供一种分子水平的诊断工具。同时，IBS患者体内的miRNA表达谱也发生了显著变化。例如，miR-29b-3p表达下调与IBS的发病机制相关16。然而，miR-29b-3p在IBS-D中表达的上游调控机制仍完全未被探索。特别是NEAT1作为miR-29b-3p的竞争性内源RNA（ceRNA）在IBS-D中的作用尚未被研究，尽管该机制在其他疾病中已有充分证实17，18。此外，以往研究主要集中在组织水平的表达，而循环NEAT1作为无创性血清生物标志物用于诊断IBS-D的潜力仍完全未知。
我们假设lncRNA-NEAT1可能通过作为miR-29b-3p的ceRNA“海绵”来参与调控IBS-D患者的肠屏障功能。基于上述研究背景，本研究旨在：（1）评估NEAT1和miR-29b-3p在IBS-D患者血清中的表达水平及其诊断价值；（2）验证NEAT1与miR-29b-3p之间的直接结合关系；（3）利用LPS处理的Caco-2细胞模型，阐明NEAT1/miR-29b-3p轴在调控肠屏障完整性及炎症反应中的功能作用。
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患者的纳入
所有参与者在充分了解研究内容后均签署了书面知情同意书。本研究方案已通过上海市浦东新区人民医院伦理委员会审查批准（编号：2024k007）。样本量使用G*Power软件进行计算：所选检验方法为t检验，统计检验设计用于检测两组独立样本之间的差异。设定效应量d = 0.5，α = 0.05，检验效能 = 0.9，计算结果表明每组至少需纳入86例受试者。为应对试验过程中可能出现的不可预见情况，每组实际纳入116例患者。本研究共纳入2024年7月至2025年7月期间在上海市浦东新区人民医院就诊的116例腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者作为实验组。纳入标准为：（1）符合罗马IV诊断标准的IBS-D患者；（2）结肠镜检查显示黏膜无器质性病变。排除标准为：（1）患有炎症性肠病（IBD）、结直肠癌等疾病者；（2）糖尿病患者；（3）近期有腹部手术史者；（4）患有严重心、肝、肾功能不全者。同时，招募了116名在年龄、性别等人口学特征上与患者相匹配的健康志愿者作为对照组。健康对照者经确认无慢性胃肠道疾病史及相关临床症状。对所有受试者采集5 mL外周静脉血，将上清液转移至-80 °C超低温冰箱中冷冻保存，以备后续RNA提取使用。
每位参与者均完成了一份为期10天的问卷，用于记录以下临床表现：（a）采用10分制视觉模拟量表评估腹痛严重程度；（b）调查期间腹痛发作频率（疼痛天数）；（c）排便频率（每日最大排便次数）；（d）布里斯托大便性状量表评估粪便性状。受试者的情绪状态采用医院焦虑抑郁量表（HADS）进行评估。
细胞培养与建模
Caco-2 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱内。Caco-2 细胞系可自发分化为具有紧密连接和微绒毛的极化单层细胞，表现出与成熟肠上皮细胞相似的形态学和功能特征。脂多糖（LPS）可触发炎症反应并破坏肠上皮中的紧密连接，增加肠道通透性，这一过程与腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的病理特征高度相似。此外，鉴于经 LPS 处理的 Caco-2 细胞已在既往研究中被广泛使用19,20,21 为模拟与肠易激综合征相关的屏障功能障碍和炎症，本研究选用脂多糖（LPS）处理Caco-2细胞以建立模型 体外 IBS-D 模型。待细胞生长至约 80% 汇合度时，将培养基更换为含有 5 µg/ml LPS 的完全培养基22，细胞刺激24小时。以未添加LPS的常规培养细胞作为对照组。
细胞转染
为研究 NEAT1 和 miR-29b-3p 在 Caco-2 细胞中的作用，对 Caco-2 细胞进行了转染。细胞分为以下六组：1. 对照组（无处理）；2. LPS 组；3. LPS + si-NC 组；4. LPS + si-NEAT1 组；5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC 组；以及 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p 抑制剂组。设计并合成了两种靶向 NEAT1 的小干扰 RNA（si-NEAT1）：si-NEAT1_1（5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′）和 si-NEAT1_2（5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′）。以非靶向随机序列 siRNA（si-NC）作为阴性对照。同时，合成了 miR-29b-3p 抑制剂及其阴性对照。miR-29b-3p 抑制剂序列：5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’；阴性对照序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。
将Caco-2细胞接种于24孔板中，待细胞融合度达到60–70%时，按照制造商的说明书进行转染。简言之，将1.25 µL的siRNA加入25 µL低血清培养基中稀释，使siRNA终浓度为50 nM。对于miRNA抑制实验，将2 µL的miR-29b-3p抑制剂或其阴性对照加入25 µL低血清培养基中稀释，终浓度为100 nM。另取1.5 µL转染试剂与25 µL低血清培养基混合。随后将稀释后的siRNA（或抑制剂/阴性对照）与稀释后的转染试剂混合，形成转染复合物，并逐滴加入细胞中。转染6小时后，弃去转染混合物，更换为新鲜的完全培养基，细胞继续培养48小时后再进行后续功能实验。在进行进一步实验前，通过RT-qPCR确认基因敲低或抑制效率。
实时定量反转录 PCR（RT-qPCR）
从血清样本和经指定处理的Caco-2细胞中提取总RNA。简言之，每个样本加入1 mL RNA提取试剂裂解，再加入200 µL氯仿。于12,000 × g 在 4 °C 下静置 15 分钟后，将上层水相转移至新离心管中，加入 500 µL 异丙醇，于 −20 °C 保存 30 分钟。随后将样品在 12,000 × g 4 °C下离心10分钟。将所得RNA沉淀用75%乙醇洗涤两次，风干后溶于20 µL无RNase的水中。使用微量分光光度计测定RNA产量和纯度，仅A260/A280 1.8–2.0 的值被采用。按照制造商的说明书，将 RNA 逆转录为 cDNA。用于检测的 NEAT1, ZO-1, occludin claudin-2 和 GAPDH每次20 µL逆转录反应使用1 µg总RNA，反应体系包含1× RT缓冲液、0.5 mM dNTPs、0.5 µM寡聚(dT)引物、200 U逆转录酶和无RN酶水。反应在37 °C进行15分钟，随后在85 °C灭活酶5秒。
以cDNA为模板，采用基于SYBR Green的实时定量PCR系统进行定量PCR。 NEAT1 miR-29b-3pZO-1， occludin, 和 使用基因特异性引物检测 claudin-2 的表达水平。 U6 作为 miR-29b-3p 的参考基因，而 GAPDH 用于标准化 NEAT1 以及紧密连接相关基因。相对表达量采用2−ΔΔCt法计算。引物序列列于 表1.
细胞活力检测
将对数生长期的Caco-2细胞以每孔1 × 104个细胞的密度接种于96孔板中。设置空白对照组（仅含培养基）、对照组（未处理细胞）和实验组（在不同处理条件下培养的Caco-2细胞），每组设5–6个复孔。细胞分为四个时间点：0、24、48和72小时。每个时间点单独准备一块培养板，以避免检测过程中反复开启培养箱。培养结束后，向每孔加入10 µL CCK-8溶液，注意避免产生气泡。随后将培养板放回37 °C、5% CO₂培养箱中，避光孵育2小时。立即使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度。最终，细胞活力以百分比形式表示。
细胞凋亡检测
采用Annexin V-FITC/PI染色后通过流式细胞术定量细胞凋亡。收集各处理组的Caco-2细胞，用预冷的PBS洗涤两次。在4 °C下以300 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于100 µL的1×结合缓冲液中，随后依次加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI。轻轻混匀后，样品在室温避光孵育15分钟。然后加入300 µL的1×结合缓冲液，小心混匀后转移至5 mL流式细胞术检测管中。样品需在1小时内完成流式细胞术分析。
跨上皮电阻（TEER）
通过测量Caco-2细胞的跨上皮电阻（TEER）值来评估通透性23。将Caco-2细胞接种于Transwell小室中，培养21天以形成致密的单层细胞。每种实验条件下进行6次独立的生物学重复，每种条件下还进行5次技术重复。在实验处理前后，使用经乙醇灭菌并用PBS平衡的电极，通过跨膜电阻仪测量各组的TEER值。具体操作如下：将电极的长杆浸入基底侧培养基中，短杆浸入顶侧培养基中，避免接触滤膜。待读数稳定后记录电阻值（Ω），并重复测量直至获得三个一致的读数。在相同条件下测量空白Transwell滤膜（无细胞）的电阻，并从所有实验读数中减去该值。TEER（Ω·cm2）=（样品电阻－空白电阻）×有效膜面积。数据以（实验组/对照组）×100%的形式表示。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
培养24小时后，收集不同处理组Caco-2细胞的上清液。根据制造商说明书，使用商用ELISA试剂检测促炎性细胞因子的水平，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-1β（IL-1β）。实验严格按照说明书操作。将样品和标准品加入预先包被抗体的微孔板中，孵育并洗涤。随后加入生物素标记的检测抗体。再次孵育并洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。最后加入TMB底物显色，并用终止液终止反应。使用酶标仪立即在450 nm波长下测定各孔的吸光度。
蛋白质印迹
采用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，从经指定处理的Caco-2细胞中提取蛋白质。使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。每份样品取30 µg蛋白上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转至PVDF膜。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4 °C与以下一抗孵育过夜：ZO-1抗体（1:1,000）、occludin抗体（1:500）、claudin-2抗体（1:1,000）和GAPDH抗体（1:5,000）。洗膜后，室温下与HRP标记的二抗孵育1小时。通过增强型化学发光（ECL）法显影条带，使用ImageJ软件分析条带强度。GAPDH作为上样内参。
双荧光素酶报告基因（DLR）检测
通过 ENCORI 数据库（https://rnasysu.com/encori/）预测了 miR-29b-3p 与 NEAT1 序列的潜在结合位点。随后，将包含野生型（WT）或突变型（MUT）结合位点的 NEAT1 片段克隆至 pmirGLO 报告载体中。将构建的重组质粒与 miR-29b-3p 模拟物（Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’；Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’）或抑制剂及其相应的阴性对照（mimic NC，Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）共同转染入细胞。转染 48 小时后收集细胞，使用双荧光素酶检测试剂测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化。
RNA 免疫沉淀（RIP）实验
进行RIP实验时，收集Caco-2细胞，用PBS洗涤后，在含有蛋白酶和RNase抑制剂的200 µL RIP裂解缓冲液中冰上孵育15分钟。细胞裂解物在4 °C下以16,000 × g离心10分钟，取各上清液10 µL作为输入对照。免疫沉淀反应中，将40 µL Protein A/G磁珠与5 µg抗Ago2抗体或正常IgG在200 µL RIP洗涤缓冲液中室温旋转孵育30分钟。用500 µL RIP洗涤缓冲液洗涤三次后，取100 µL磁珠悬液与100 µL裂解物混合，用RIP洗涤缓冲液调整至终体积为1 mL，并于4 °C旋转孵育过夜。随后，磁珠用500 µL RIP洗涤缓冲液洗涤五次，重悬于150 µL相同缓冲液中。通过加入15 µL蛋白酶K（20 mg/mL）和15 µL 10% SDS进行蛋白消化，并在55 °C振荡孵育30分钟。收集上清液，使用提取试剂分离RNA，并过夜沉淀。最后通过RT-qPCR检测NEAT1和miR-29b-3p的富集情况。
亚细胞定位分析
采用参考的市售核质分离试剂，按照制造商说明书将Caco-2细胞分离为核组分和胞质组分。从这两个组分中提取总RNA，并通过RT-qPCR检测NEAT1在细胞核和细胞质中的分布情况。使用U6（主要位于细胞核）和GAPDH mRNA（主要位于细胞质）作为分离效率的指示物进行校准。
统计分析
对于临床血清样本，功效分析（t 检验，d = 0.5，α = 0.05，功效 = 0.9）表明每组至少需要86名受试者。为应对试验过程中可能出现的不可预见情况，每组纳入116例患者，以检测具有临床意义的差异。连续变量的数据正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估。由于所有连续数据均呈正态分布（P > 0.05），故采用参数检验方法。分类变量采用卡方检验进行分析。基于细胞的实验包含六个独立的生物学重复，每个生物学重复设有五个技术重复。数据以均值 ± 标准差表示。两组连续变量之间的比较采用Student's t 检验，多组间的比较则采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验。统计学显著性定义为 P < 0.05。
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NEAT1 的表达及诊断价值
与健康对照（HC）组相比， NEAT1 IBS-D 患者中的表达水平显著升高（P < 0.0001; 图1A曲线下面积（AUC） NEAT1，如受试者工作特征（ROC）曲线所示，为0.867（95% CI：0.821–0.913）。其特异性为75.9%，敏感性为84.5%（图1B）。这表明异常 NEAT1 IBS-D 患者血清中的表达可作为该疾病的一种新型诊断生物标志物。
此外，对健康组和腹泻型肠易激综合征（IBS-D）组患者的临床数据进行了比较。结果显示，两组在年龄、性别或其他特征方面均无显著差异（P > 0.05）。然而，在HADS评分、排便次数和粪便形态方面存在显著差异（P < 0.0001，表...
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腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其病理机制尚未完全阐明。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）作为表观遗传调控中的关键分子，在疾病诊断与治疗领域展现出巨大潜力。lncRNA NEAT1 已在多种疾病中被研究，如结直肠癌24、胶质瘤25和心肌梗死26。多项研究表明，NEAT1 参与调控炎症反应13、细胞增殖27以及肠道屏障完整性28。然而，NEAT1 在 IBS-D 中的特异性表达、其临床价值以及在 IBS-D 发生发展中的调控机制仍有待深入探索。
NEAT1 在多种炎症条件下表达上调，例如肺炎29、骨关节炎30
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作者声明无利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | Corning | CLS3524 | 用于细胞接种 |
| 96孔板 | Corning | CLS3599 | 用于CCK-8实验中的细胞接种 |
| Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | V13242 | 用于检测细胞凋亡率 |
| 抗AGO2单克隆抗体 | Proteintech | 67934-1-Ig | 用于免疫沉淀Ago2结合的RNA复合物 |
| 抗Claudin-2抗体 | Invitrogen | 32-5600 | 一抗，稀释比例1:1000 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | 一抗，稀释比例1:5000；作为上样对照 |
| 抗人IgG抗体 | Proteintech | 10284-1-AP | 用作RIP实验的阴性对照 |
| 抗Occludin抗体 | Abcam | ab31721 | 一抗，稀释比例1:500 |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | 一抗，稀释比例1:1000 |
| Caco-2细胞 | SUNNCELL | SNL-068 | 用于构建肠上皮屏障模型 |
| CCK-8试剂盒 | Solarbio | CA1210 | 细胞增殖检测试剂盒 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | 用于RNA提取过程中的相分离 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | 用于细胞培养 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | ThermoFisher | 16186 | 用于检测荧光素酶活性 |
| ELISA试剂盒（用于IL-1β） | R&D Systems | DY201 | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| ELISA试剂盒（用于IL-6） | R&D Systems | D6050B | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| ELISA试剂盒（用于IL-8） | R&D Systems | NBP3-28022 | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| ELISA试剂盒（用于TNF-α） | R&D Systems | DTA00D | 用于检测细胞培养上清中的目标蛋白 |
| 增强型化学发光（ECL）底物 | Thermo Fisher | 32106 | 用于显影蛋白条带 |
| 乙醇（75%） | Sigma-Aldrich | 459844 | 用于洗涤RNA沉淀 |
| FBS（胎牛血清） | Gibco | 10099141 | 用于细胞培养 |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | B53002 | 用于检测细胞凋亡率 |
| HRP标记的二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | 催化ECL底物产生化学发光信号 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 1133502500 | 用于RNA沉淀 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | 转染试剂 |
| 脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich | L2880 | 用于诱导构建细胞模型 |
| 酶标仪 | BioTek | Epoch 2 | 用于检测96孔板中样品的吸光度 |
| Nanodrop微量分光光度计 | Thermo Scientific | ND-2000C | 用于测定RNA浓度和纯度 |
| 脱脂奶粉 | Coolaber | CN7861 | 用于封闭膜（配制成5%溶液） |
| PARIS试剂盒 | Thermo Fisher | AM1921 | 用于细胞核质分离 |
| 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140122 | 用于防止细胞培养过程中的污染 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
| pmirGLO双荧光素酶载体 | Promega | E1330 | 双荧光素酶报告基因载体 |
| PrimeScript RT反转录试剂盒 | Takara | RR047A | 用于将RNA反转录为cDNA |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | 用于SDS-PAGE后的蛋白转膜 |
| 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | 4365464 | 用于检测目标基因 |
| RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂） | Thermo Fisher | 89901 | 用于细胞总蛋白提取 |
| RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-701 | 使用Protein A/G磁珠进行RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验 |
| SDS-PAGE试剂（10%胶） | TargetMol | C0189 | 用于按分子量分离蛋白质 |
| SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | 4309155 | 用于PCR检测 |
| 跨膜电阻测量仪（伏欧表） | Millipore | MERS00002 | 跨膜电阻测量仪，用于测定单层细胞完整性 |
| Transwell小室 | Corning Costar | CLS3413 | 用于单层细胞培养及TEER值测定 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026CN | 用于总RNA提取 |
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