NEAT1 通过结合 miR-29b-3p 在脂多糖损伤的 Caco-2 细胞中介导肠道屏障功能障碍

摘要

本研究评估了NEAT1作为腹泻型肠易激综合征中肠道屏障功能障碍的诊断标志物及调控因子的作用。NEAT1在患者血清中表达升高，可结合miR-29b-3p，其敲低可改善脂多糖损伤的Caco-2细胞的屏障功能、凋亡及炎症相关指标。

摘要

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的发病机制尚不明确，现有治疗手段仍有限。本研究评估了NEAT1在IBS-D中的诊断价值，并探讨其潜在的调控机制。共纳入116例IBS-D患者和116名健康对照者。采用反转录定量实时PCR（RT-qPCR）检测血清中NEAT1和miR-29b-3p的水平，并通过受试者工作特征（ROC）曲线评估其诊断价值。在机制研究中，建立脂多糖（LPS）处理的Caco-2肠上皮细胞模型。采用CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，跨上皮电阻（TEER）评估屏障完整性，RT-qPCR检测ZO-1、occludin和claudin-2的mRNA水平。双荧光素酶报告基因（DLR）和RNA免疫沉淀（RIP）实验用于验证NEAT1与miR-29b-3p之间的结合关系。结果显示，IBS-D患者中NEAT1高表达，miR-29b-3p低表达，二者水平呈显著负相关。NEAT1敲低可上调miR-29b-3p水平，增强细胞活力和TEER，减少细胞凋亡，提高ZO-1和occludin的mRNA水平，降低claudin-2的mRNA水平，并缓解LPS处理的Caco-2细胞中与屏障损伤相关的各项指标。综上所述，血清NEAT1可能是IBS-D的候选生物标志物，且NEAT1/miR-29b-3p轴可能参与了肠屏障功能障碍的调控过程。

引言

以腹泻为主的肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其特征为腹痛、腹胀以及排便习惯改变¹。目前，IBS-D 的病理生理机制尚未完全阐明²。现有的治疗方法主要为对症缓解，疗效有限且复发率较高³。普遍认为 IBS-D 涉及多种因素的相互作用，例如脑-肠轴调节异常、内脏高敏感性、低度肠道炎症以及屏障功能障碍^4,5。尽管这些诊断标准在一定程度上实现了诊断的规范化，但其主观性较强，可能导致诊断延迟或误分类，尤其是在患者症状与炎症性肠病或其他器质性疾病重叠时。在常规临床实践中，目前尚无经过验证的 IBS-D 客观生物标志物。因此，探索一种既可作为诊断标志又具有潜在治疗价值的新型分子靶点，已成为当前 IBS-D 研究领域的一项迫切需求。

近年来，长链非编码RNA作为表观遗传调控中的关键分子，在多种疾病的诊断标志物和治疗靶点方面展现出巨大潜力^6，7。腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的主要病因是肠道屏障功能受损⁸。紧密连接蛋白的破坏导致"肠漏"，进而激活黏膜免疫反应^9，10。免疫系统的激活会释放大量促炎因子，通过激活肠免疫-神经系统引起肠道功能障碍。研究表明，某些lncRNA能够调控肠道上皮屏障^11，12。NEAT1在结肠炎患者结肠黏膜组织中已被报道呈上调表达¹³。抑制lncRNA NEAT1可缓解溃疡性结肠炎中肠道上皮细胞（IECs）的功能障碍¹⁴。然而，NEAT1在IBS-D中的表达谱及其诊断价值尚未得到研究。此外，NEAT1可能具有作为诊断生物标志物的潜力¹⁵。如果NEAT1在IBS-D患者血清中异常表达，则有望补充现有的罗马IV诊断标准，提供一种分子水平的诊断工具。同时，IBS患者体内的miRNA表达谱也发生了显著变化。例如，miR-29b-3p表达下调与IBS的发病机制相关¹⁶。然而，miR-29b-3p在IBS-D中表达的上游调控机制仍完全未被探索。特别是NEAT1作为miR-29b-3p的竞争性内源RNA（ceRNA）在IBS-D中的作用尚未被研究，尽管该机制在其他疾病中已有充分证实^17，18。此外，以往研究主要集中在组织水平的表达，而循环NEAT1作为无创性血清生物标志物用于诊断IBS-D的潜力仍完全未知。

我们假设lncRNA-NEAT1可能通过作为miR-29b-3p的ceRNA“海绵”来参与调控IBS-D患者的肠屏障功能。基于上述研究背景，本研究旨在：（1）评估NEAT1和miR-29b-3p在IBS-D患者血清中的表达水平及其诊断价值；（2）验证NEAT1与miR-29b-3p之间的直接结合关系；（3）利用LPS处理的Caco-2细胞模型，阐明NEAT1/miR-29b-3p轴在调控肠屏障完整性及炎症反应中的功能作用。

方案

患者的纳入

所有参与者在充分了解研究内容后均签署了书面知情同意书。本研究方案已通过上海市浦东新区人民医院伦理委员会审查批准（编号：2024k007）。样本量使用G*Power软件进行计算：所选检验方法为t检验，统计检验设计用于检测两组独立样本之间的差异。设定效应量d = 0.5，α = 0.05，检验效能 = 0.9，计算结果表明每组至少需纳入86例受试者。为应对试验过程中可能出现的不可预见情况，每组实际纳入116例患者。本研究共纳入2024年7月至2025年7月期间在上海市浦东新区人民医院就诊的116例腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者作为实验组。纳入标准为：（1）符合罗马IV诊断标准的IBS-D患者；（2）结肠镜检查显示黏膜无器质性病变。排除标准为：（1）患有炎症性肠病（IBD）、结直肠癌等疾病者；（2）糖尿病患者；（3）近期有腹部手术史者；（4）患有严重心、肝、肾功能不全者。同时，招募了116名在年龄、性别等人口学特征上与患者相匹配的健康志愿者作为对照组。健康对照者经确认无慢性胃肠道疾病史及相关临床症状。对所有受试者采集5 mL外周静脉血，将上清液转移至-80 °C超低温冰箱中冷冻保存，以备后续RNA提取使用。

每位参与者均完成了一份为期10天的问卷，用于记录以下临床表现：（a）采用10分制视觉模拟量表评估腹痛严重程度；（b）调查期间腹痛发作频率（疼痛天数）；（c）排便频率（每日最大排便次数）；（d）布里斯托大便性状量表评估粪便性状。受试者的情绪状态采用医院焦虑抑郁量表（HADS）进行评估。

细胞培养与建模

Caco-2 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱内。Caco-2 细胞系可自发分化为具有紧密连接和微绒毛的极化单层细胞，表现出与成熟肠上皮细胞相似的形态学和功能特征。脂多糖（LPS）可触发炎症反应并破坏肠上皮中的紧密连接，增加肠道通透性，这一过程与腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的病理特征高度相似。此外，鉴于经 LPS 处理的 Caco-2 细胞已在既往研究中被广泛使用^19,20,21 为模拟与肠易激综合征相关的屏障功能障碍和炎症，本研究选用脂多糖（LPS）处理Caco-2细胞以建立模型 体外 IBS-D 模型。待细胞生长至约 80% 汇合度时，将培养基更换为含有 5 µg/ml LPS 的完全培养基²²，细胞刺激24小时。以未添加LPS的常规培养细胞作为对照组。

细胞转染

为研究 NEAT1 和 miR-29b-3p 在 Caco-2 细胞中的作用，对 Caco-2 细胞进行了转染。细胞分为以下六组：1. 对照组（无处理）；2. LPS 组；3. LPS + si-NC 组；4. LPS + si-NEAT1 组；5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC 组；以及 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p 抑制剂组。设计并合成了两种靶向 NEAT1 的小干扰 RNA（si-NEAT1）：si-NEAT1_1（5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′）和 si-NEAT1_2（5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′）。以非靶向随机序列 siRNA（si-NC）作为阴性对照。同时，合成了 miR-29b-3p 抑制剂及其阴性对照。miR-29b-3p 抑制剂序列：5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’；阴性对照序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

将Caco-2细胞接种于24孔板中，待细胞融合度达到60–70%时，按照制造商的说明书进行转染。简言之，将1.25 µL的siRNA加入25 µL低血清培养基中稀释，使siRNA终浓度为50 nM。对于miRNA抑制实验，将2 µL的miR-29b-3p抑制剂或其阴性对照加入25 µL低血清培养基中稀释，终浓度为100 nM。另取1.5 µL转染试剂与25 µL低血清培养基混合。随后将稀释后的siRNA（或抑制剂/阴性对照）与稀释后的转染试剂混合，形成转染复合物，并逐滴加入细胞中。转染6小时后，弃去转染混合物，更换为新鲜的完全培养基，细胞继续培养48小时后再进行后续功能实验。在进行进一步实验前，通过RT-qPCR确认基因敲低或抑制效率。

实时定量反转录 PCR（RT-qPCR）

从血清样本和经指定处理的Caco-2细胞中提取总RNA。简言之，每个样本加入1 mL RNA提取试剂裂解，再加入200 µL氯仿。于12,000 × g 在 4 °C 下静置 15 分钟后，将上层水相转移至新离心管中，加入 500 µL 异丙醇，于 −20 °C 保存 30 分钟。随后将样品在 12,000 × g 4 °C下离心10分钟。将所得RNA沉淀用75%乙醇洗涤两次，风干后溶于20 µL无RNase的水中。使用微量分光光度计测定RNA产量和纯度，仅A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8–2.0 的值被采用。按照制造商的说明书，将 RNA 逆转录为 cDNA。用于检测的 NEAT1, ZO-1, occludin claudin-2 和 GAPDH每次20 µL逆转录反应使用1 µg总RNA，反应体系包含1× RT缓冲液、0.5 mM dNTPs、0.5 µM寡聚(dT)引物、200 U逆转录酶和无RN酶水。反应在37 °C进行15分钟，随后在85 °C灭活酶5秒。

以cDNA为模板，采用基于SYBR Green的实时定量PCR系统进行定量PCR。 NEAT1 miR-29b-3pZO-1， occludin, 和 使用基因特异性引物检测 claudin-2 的表达水平。 U6 作为 miR-29b-3p 的参考基因，而 GAPDH 用于标准化 NEAT1 以及紧密连接相关基因。相对表达量采用2−ΔΔCt法计算。引物序列列于 表1.

细胞活力检测

将对数生长期的Caco-2细胞以每孔1 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中。设置空白对照组（仅含培养基）、对照组（未处理细胞）和实验组（在不同处理条件下培养的Caco-2细胞），每组设5–6个复孔。细胞分为四个时间点：0、24、48和72小时。每个时间点单独准备一块培养板，以避免检测过程中反复开启培养箱。培养结束后，向每孔加入10 µL CCK-8溶液，注意避免产生气泡。随后将培养板放回37 °C、5% CO₂培养箱中，避光孵育2小时。立即使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度。最终，细胞活力以百分比形式表示。

细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI染色后通过流式细胞术定量细胞凋亡。收集各处理组的Caco-2细胞，用预冷的PBS洗涤两次。在4 °C下以300 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于100 µL的1×结合缓冲液中，随后依次加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI。轻轻混匀后，样品在室温避光孵育15分钟。然后加入300 µL的1×结合缓冲液，小心混匀后转移至5 mL流式细胞术检测管中。样品需在1小时内完成流式细胞术分析。

跨上皮电阻（TEER）

通过测量Caco-2细胞的跨上皮电阻（TEER）值来评估通透性²³。将Caco-2细胞接种于Transwell小室中，培养21天以形成致密的单层细胞。每种实验条件下进行6次独立的生物学重复，每种条件下还进行5次技术重复。在实验处理前后，使用经乙醇灭菌并用PBS平衡的电极，通过跨膜电阻仪测量各组的TEER值。具体操作如下：将电极的长杆浸入基底侧培养基中，短杆浸入顶侧培养基中，避免接触滤膜。待读数稳定后记录电阻值（Ω），并重复测量直至获得三个一致的读数。在相同条件下测量空白Transwell滤膜（无细胞）的电阻，并从所有实验读数中减去该值。TEER（Ω·cm²）=（样品电阻－空白电阻）×有效膜面积。数据以（实验组/对照组）×100%的形式表示。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

培养24小时后，收集不同处理组Caco-2细胞的上清液。根据制造商说明书，使用商用ELISA试剂检测促炎性细胞因子的水平，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-1β（IL-1β）。实验严格按照说明书操作。将样品和标准品加入预先包被抗体的微孔板中，孵育并洗涤。随后加入生物素标记的检测抗体。再次孵育并洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。最后加入TMB底物显色，并用终止液终止反应。使用酶标仪立即在450 nm波长下测定各孔的吸光度。

蛋白质印迹

采用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，从经指定处理的Caco-2细胞中提取蛋白质。使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。每份样品取30 µg蛋白上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转至PVDF膜。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4 °C与以下一抗孵育过夜：ZO-1抗体（1:1,000）、occludin抗体（1:500）、claudin-2抗体（1:1,000）和GAPDH抗体（1:5,000）。洗膜后，室温下与HRP标记的二抗孵育1小时。通过增强型化学发光（ECL）法显影条带，使用ImageJ软件分析条带强度。GAPDH作为上样内参。

双荧光素酶报告基因（DLR）检测

通过 ENCORI 数据库（https://rnasysu.com/encori/）预测了 miR-29b-3p 与 NEAT1 序列的潜在结合位点。随后，将包含野生型（WT）或突变型（MUT）结合位点的 NEAT1 片段克隆至 pmirGLO 报告载体中。将构建的重组质粒与 miR-29b-3p 模拟物（Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’；Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’）或抑制剂及其相应的阴性对照（mimic NC，Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）共同转染入细胞。转染 48 小时后收集细胞，使用双荧光素酶检测试剂测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化。

RNA 免疫沉淀（RIP）实验

进行RIP实验时，收集Caco-2细胞，用PBS洗涤后，在含有蛋白酶和RNase抑制剂的200 µL RIP裂解缓冲液中冰上孵育15分钟。细胞裂解物在4 °C下以16,000 × g离心10分钟，取各上清液10 µL作为输入对照。免疫沉淀反应中，将40 µL Protein A/G磁珠与5 µg抗Ago2抗体或正常IgG在200 µL RIP洗涤缓冲液中室温旋转孵育30分钟。用500 µL RIP洗涤缓冲液洗涤三次后，取100 µL磁珠悬液与100 µL裂解物混合，用RIP洗涤缓冲液调整至终体积为1 mL，并于4 °C旋转孵育过夜。随后，磁珠用500 µL RIP洗涤缓冲液洗涤五次，重悬于150 µL相同缓冲液中。通过加入15 µL蛋白酶K（20 mg/mL）和15 µL 10% SDS进行蛋白消化，并在55 °C振荡孵育30分钟。收集上清液，使用提取试剂分离RNA，并过夜沉淀。最后通过RT-qPCR检测NEAT1和miR-29b-3p的富集情况。

亚细胞定位分析

采用参考的市售核质分离试剂，按照制造商说明书将Caco-2细胞分离为核组分和胞质组分。从这两个组分中提取总RNA，并通过RT-qPCR检测NEAT1在细胞核和细胞质中的分布情况。使用U6（主要位于细胞核）和GAPDH mRNA（主要位于细胞质）作为分离效率的指示物进行校准。

统计分析

对于临床血清样本，功效分析（t 检验，d = 0.5，α = 0.05，功效 = 0.9）表明每组至少需要86名受试者。为应对试验过程中可能出现的不可预见情况，每组纳入116例患者，以检测具有临床意义的差异。连续变量的数据正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估。由于所有连续数据均呈正态分布（P > 0.05），故采用参数检验方法。分类变量采用卡方检验进行分析。基于细胞的实验包含六个独立的生物学重复，每个生物学重复设有五个技术重复。数据以均值 ± 标准差表示。两组连续变量之间的比较采用Student's t 检验，多组间的比较则采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验。统计学显著性定义为 P < 0.05。

结果

NEAT1 的表达及诊断价值

与健康对照组（HC）相比，IBS-D 患者中 NEAT1 的表达水平显著升高（P < 0.0001；图 1A）。受试者工作特征（ROC）曲线显示，NEAT1 的曲线下面积（AUC）为 0.867（95% CI：0.821–0.913），特异性为 75.9%，敏感性为 84.5%（图 1B）。这表明 IBS-D 患者血清中 NEAT1 的异常表达可能作为该疾病的一种新型诊断生物标志物。

此外，比较了健康组与IBS-D组患者的临床数据。结果显示，两组在年龄、性别及其他特征方面均无显著差异（P > 0.05）。然而，在HADS评分、排便次数和粪便形态方面存在显著差异（P < 0.0001，表2）。关于腹痛发生频率，有69例患者症状持续时间≥5天，占病例总数的59.48%。在腹痛严重程度方面，72例患者的评分≥5分，占62.07%（表2）。这表明，IBS-D患者在症状表现上可明显区别于对照组。鉴于NEAT1水平升高与IBS-D症状之间存在临床关联，我们接下来利用LPS处理的Caco-2细胞模型，进一步研究NEAT1对肠道屏障完整性的功能影响。

低水平NEAT1对脂多糖处理的Caco-2细胞肠道屏障损伤及炎症反应的影响

为了模拟腹泻型肠易激综合征（IBS-D）中出现的肠道屏障功能障碍和低度炎症，我们用LPS处理Caco-2细胞。与对照组相比，LPS加入细胞后，NEAT1 水平上调。转染si-NEAT1 后，NEAT1 水平较LPS + si-NC组显著降低（P < 0.0001，图2A）。LPS处理降低了细胞活力，并增加了细胞凋亡率，与对照组相比差异明显。敲低NEAT1 后，细胞活力升高，凋亡率较LPS + si-NC组降低（P < 0.001；图2B、C）。敲低NEAT1 后，LPS引起的跨上皮电阻（TEER）降低得到显著恢复（P < 0.0001，图2D）。与对照组相比，LPS处理降低了ZO-1 和occludin的mRNA表达水平，同时升高了claudin-2的表达；而敲低NEAT1 可逆转这些变化（P < 0.001，图2E–G）。LPS处理可触发细胞的炎症反应，细胞内促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的水平高于对照组。敲低NEAT1 后，细胞内促炎因子含量较si-NC组显著降低（P < 0.0001，图3A–D）。这表明低水平的NEAT1 可减轻LPS诱导的肠道屏障功能障碍和炎症反应，提示NEAT1 可能在IBS-D的进展中发挥作用。

NEAT1 与 Caco-2 细胞中 miR-29b-3p 的直接结合及其作用

在Caco-2细胞中，NEAT1主要定位于细胞质（图4A）。通过ENCORI数据库预测了NEAT1与miR-29b-3p的结合位点，并据此设计了WT-NEAT1和MUT-NEAT1序列（图4B）。双荧光素酶报告（DLR）实验结果显示，与mimic NC相比，miR-29b-3p mimics显著降低了WT-NEAT1的酶活性，而其抑制剂则相对于inhibitor NC显著提高了酶活性；相反，两种处理对MUT-NEAT1均无影响（P < 0.0001，图4C）。RNA免疫沉淀（RIP）实验显示，与抗IgG组相比，NEAT1和miR-29b-3p在抗Ago2沉淀组分中显著富集，表明二者之间存在特异性相互作用（P < 0.0001，图4D）。上述结果表明，NEAT1可特异性结合miR-29b-3p。同时，与健康对照组（HC）相比，IBS-D患者中miR-29b-3p的表达水平显著降低（P < 0.0001，图4E）。其ROC曲线的AUC为0.856（95% CI：0.808–0.905），敏感性为89.7%，特异性为71.6%（图4F）。Pearson相关性分析显示，NEAT1表达水平与miR-29b-3p表达水平呈显著负相关（r = -0.744，P < 0.0001，图4G）。

低表达NEAT1对脂多糖处理的Caco-2细胞肠屏障损伤及miR-29b-3p水平的影响

在LPS处理的Caco-2细胞中，miR-29b-3p的表达水平较对照组显著下调。转染si-NEAT1可升高miR-29b-3p水平，而转染miR-29b-3p抑制剂则再次降低miR-29b-3p水平（P < 0.0001，图5A）。敲低NEAT1可提高细胞活力并减少细胞凋亡，而这些效应可被miR-29b-3p抑制剂所消除（P < 0.01，图5B、C）。LPS诱导的跨上皮电阻（TEER）下降可通过NEAT1敲低得以恢复，而该恢复作用再次被miR-29b-3p抑制剂所阻断（P < 0.0001， 图5D）。与对照组相比，LPS处理导致ZO-1和occludin mRNA表达降低，而claudin-2 mRNA表达升高。在NEAT1敲低后，miR-29b-3p水平上升，ZO-1和occludin mRNA水平较LPS + si-NC组升高，claudin-2 mRNA水平则下降。而在抑制miR-29b-3p后，ZO-1和occludin mRNA水平较LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC组下降，claudin-2 mRNA水平则上升（P < 0.001，图5E–G）。NEAT1（主要为细胞质亚型NEAT1_1）可作为miR-29b-3p的分子海绵。敲低NEAT1可释放miR-29b-3p，从而间接上调ZO-1和occludin表达，并下调claudin-2表达，进而缓解LPS诱导的屏障功能破坏。这些结果表明，在该模型中，miR-29b-3p正向调控ZO-1和occludin的表达，负向调控claudin-2的表达，且NEAT1敲低的作用至少部分通过miR-29b-3p介导实现。

我们进一步通过蛋白质印迹分析检测了紧密连接蛋白的表达水平。如图5H所示，与LPS + si-NC组相比，NEAT1敲低可增加LPS诱导降低的ZO-1和occludin的表达，并抑制claudin-2的表达。然而，与LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC组相比，共转染miR-29b-3p抑制剂削弱了NEAT1敲低的保护作用。这些结果支持以下结论：通过上调miR-29b-3p，NEAT1敲低至少部分恢复了紧密连接蛋白的表达，从而改善了肠道屏障功能。

低水平 NEAT1 对脂多糖处理的 Caco-2 细胞肠道炎症及 miR-29b-3p 表达的影响

在LPS处理的Caco-2细胞中，LPS引发了炎症反应。促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的水平显著高于对照组。在敲低NEAT1后，miR-29b-3p的水平升高，而促炎因子的水平与si-NC组相比显著降低。在抑制miR-29b-3p后，炎症因子的水平再次上升（P < 0.0001，图6A-D）。因此，敲低NEAT1至少部分通过上调miR-29b-3p来抑制炎症细胞因子的释放。

这些结果表明，NEAT1 在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者血清中的水平异常升高，且 NEAT1 在区分 IBS-D 患者与健康对照者方面具有较高的曲线下面积（AUC）。从作用机制上看，NEAT1 可直接与细胞质中的 miR-29b-3p 结合并将其隔离。在细胞模型和功能挽救实验中，NEAT1 的敲低可上调 miR-29b-3p 的表达，提高细胞存活率和跨上皮电阻（TEER），减少细胞凋亡，并抑制促炎性细胞因子的释放。这些发现支持了 NEAT1 通过抑制 miR-29b-3p 负向调控肠道屏障完整性的假说，提示靶向 NEAT1 可能为 IBS-D 提供一种潜在的诊断和治疗策略。

数据可用性：

图和表的原始数据作为补充文件1（原始数据电子表格）和补充文件2（未经编辑的蛋白质印迹图像）提供。

图1。NEAT1 在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者中的表达及其诊断价值。（A）通过RT-qPCR检测健康对照组（HC，n = 116）和IBS-D患者组（n = 116）血清中NEAT1的表达水平；（B）NEAT1用于区分IBS-D患者与健康对照的ROC曲线分析。数据以均值±标准差表示（每组n = 116）。**** P < 0.0001。缩写：IBS-D = 腹泻型肠易激综合征；ROC = 受试者工作特征曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2。NEAT1 对脂多糖（LPS）诱导的 Caco-2 细胞肠屏障损伤的影响。（A）转染 si-NEAT1 可降低 LPS 诱导的 NEAT1 表达水平；（B）通过 CCK-8 法检测 0、24、48 和 72 小时的细胞活力。敲低 NEAT1 可增强细胞活力；（C）采用 Annexin V-FITC/PI 染色结合流式细胞术测定细胞凋亡率。沉默 NEAT1 可降低细胞凋亡率；（D）在 Caco-2 单层细胞中测定跨上皮电阻（TEER）。抑制 NEAT1 可提高细胞 TEER 值；（E–G）通过 RT-qPCR 检测（E）ZO-1、（F）occludin 和（G）claudin-2 的 mRNA 表达水平。沉默 NEAT1 可升高 ZO-1 和 occludin 的 mRNA 表达，降低 claudin-2 的 mRNA 水平。数据以六次独立实验的均值 ± 标准差表示（每组 n = 6）。*** P < 0.001；**** P < 0.0001，LPS 组与对照组比较，LPS + si-NEAT1 组与 LPS + si-NC 组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

图3。 NEAT1 沉默对脂多糖（LPS）诱导的Caco-2细胞促炎性细胞因子释放的影响。 （A-D）通过ELISA检测细胞培养上清液中（A）TNF-α、（B）IL-6、（C）IL-8和（D）IL-1β的浓度。NEAT1 沉默可降低LPS诱导的TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β水平。数据以六次独立实验的均值±标准差表示（每组n = 6）。**** P < 0.0001，LPS组与对照组比较，LPS + si-NEAT1组与LPS + si-NC组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

图4．NEAT1 的直接结合及其与 miR-29b-3p 的关联。（A）通过细胞核-细胞质分馏法确定 Caco-2 细胞中 NEAT1 的亚细胞定位（U6：核对照，GAPDH：细胞质对照）。NEAT1 主要位于细胞质中；（B）根据 ENCORI 数据库预测的 NEAT1 与 miR-29b-3p 的野生型（WT）和突变型（MUT）结合序列；（C）双荧光素酶报告基因（DLR）实验验证了 NEAT1 与 miR-29b-3p 之间的结合关系；（D）RNA 免疫沉淀（RIP）实验验证了 NEAT1 与 miR-29b-3p 之间的结合关系。图 A、C 和 D 中的数据为六次独立实验的均值 ± 标准差（n = 6 每组）。（E）健康对照者（HC，n = 116）与 IBS-D 患者（n = 116）血清中 miR-29b-3p 的表达水平；（F）miR-29b-3p 区分 IBS-D 患者与健康对照者的 ROC 曲线；（G）IBS-D 患者中 NEAT1 与 miR-29b-3p 表达水平的 Pearson 相关性分析。NEAT1 与 miR-29b-3p 的表达呈负相关（r = -0.744，P < 0.0001）。图 E 中的数据为均值 ± 标准差（n = 116 每组）。**** P < 0.0001。缩写：WT = 野生型；MUT = 突变型；DLR = 双荧光素酶报告基因；RIP = RNA 免疫沉淀。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5．NEAT1 沉默对脂多糖处理的 Caco-2 细胞肠道屏障功能及 miR-29b-3p 的影响。 （A）NEAT1 沉默可升高 miR-29b-3p 水平，而转染 miR-29b-3p 抑制剂则降低 miR-29b-3p 表达；（B）通过 CCK-8 法测定细胞活力。低水平 NEAT1 通过增加 miR-29b-3p 增强细胞活力；（C）通过流式细胞术测定细胞凋亡率。低水平 NEAT1 通过增加 miR-29b-3p 降低细胞凋亡率；（D）低水平 NEAT1 通过提高 miR-29b-3p 水平增加细胞的跨上皮电阻（TEER）；（E–G）E）ZO-1、F）occludin 和 G）claudin-2 的 mRNA 表达。低水平 NEAT1 通过增强 miR-29b-3p 上调 ZO-1 和 occludin 的表达，并降低 claudin-2 mRNA 的表达；（H）代表性 Western blot 图像，显示在指定处理条件下 ZO-1、occludin、claudin-2 和 GAPDH 蛋白的表达。数据以六次独立实验的均值 ± 标准差表示（每组 n = 6）。** P < 0.01；*** P < 0.001；**** P < 0.0001，LPS 组与对照组、LPS + si-NEAT1 组与 LPS + si-NC 组、LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor 组与 LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC 组之间的比较。缩写：miR-inhibitor = miR-29b-3p 抑制剂；TEER = 跨上皮电阻。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 效应 NEAT1 LPS处理的Caco-2细胞中miR-29b-3p对炎症的抑制作用 (A-D) 浓度（A肿瘤坏死因子-α（TNF-α）α, (B) IL-6，(C) IL-8，以及（D白细胞介素-1β 通过ELISA检测细胞培养上清液中的低水平 NEAT1 降低TNF-的含量α, IL-6, IL-8 和 IL-1β 通过增加miR-29b-3p在细胞上清液中的含量。数据以均值表示 ± 六次独立实验的标准差（每组 n = 6）。**** P < 0.0001，LPS 对照组，LPS + si-NEAT1 与LPS + si-NC、LPS + si-相比NEAT1 + miR-抑制剂 vs. LPS + si-NEAT1 + 抑制剂 NC。缩写：miR-抑制剂 = miR-29b-3p 抑制剂。 请点击此处以查看此图的放大版本。

基因	引物序列
NEAT1 正向	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 反向	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 正向	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 反向	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin 正向	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin 反向	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 正向	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 反向	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p 正向	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p 反向	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH 正向	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH 反向	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 正向	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 反向	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

表1： 引物序列。

指标	对照组 (N=116)	腹泻型肠易激综合征组 (IBS-D组, N=116)	P
年龄，年
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
性别
男性	64	66	0.895
女性	52	50
吸烟史
否	58	53	0.599
是	58	63
饮酒史
否	63	58	0.599
是	53	58
HADS评分
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
每日排便次数
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
粪便性状（布里斯托评分）
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
腹痛频率，天数
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
腹痛严重程度评分
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

表2： 健康对照组与腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者之间人口统计学和临床特征的比较。 数值以每组的参与者人数表示（每组 n = 116）。组间差异采用卡方检验进行评估。缩写：HADS = 医院焦虑抑郁量表；IBS-D = 腹泻型肠易激综合征。

补充文件 1： 图表和表格的原始数据。 该文件包含用于生成所示定量结果的原始数值数据 图1, 图2, 图3, 图4, 图5，以及 图6, 以及人口统计学/临床数据的总结 表2.请点击此处下载此文件。

补充文件2：未剪辑的蛋白质印迹图像。 该文件包含对应于图5H中代表性蛋白质印迹图的ZO-1、occludin、claudin-2和GAPDH的未剪辑蛋白质印迹图像。请点击此处下载该文件。

讨论

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其病理机制尚未完全阐明。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）作为表观遗传调控中的关键分子，在疾病诊断与治疗领域展现出巨大潜力。lncRNA NEAT1 已在多种疾病中被研究，如结直肠癌²⁴、胶质瘤²⁵和心肌梗死²⁶。多项研究表明，NEAT1 参与调控炎症反应¹³、细胞增殖²⁷以及肠道屏障完整性²⁸。然而，NEAT1 在 IBS-D 中的特异性表达、其临床价值以及在 IBS-D 发生发展中的调控机制仍有待深入探索。

NEAT1 在多种炎症条件下表达上调，例如肺炎²⁹、骨关节炎³⁰、鼻炎³¹ 和脓毒症³²。我们的研究结果与上述研究报道一致：NEAT1 在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者中显著上调，提示其可能与 IBS-D 的发病相关。目前，IBS-D 的诊断主要依赖罗马 IV 症状诊断标准，尚无客观的实验室生物标志物。尽管该标准在研究和多数临床实践中已被证实有效，但仍存在局限性，包括主观性强、症状与其他疾病重叠以及诊断延迟等问题。进一步的 ROC 曲线分析表明，NEAT1 在 IBS-D 患者中具有相对良好的诊断价值。NEAT1 血清表达水平能够有效区分 IBS-D 患者与健康对照者，其 AUC 为 0.867，且具有较高的敏感性和特异性。这提示 NEAT1 有望作为补充罗马 IV 标准的诊断工具，或成为 IBS-D 的新型诊断标志物。例如，对于表现为慢性腹痛和排便习惯改变且 NEAT1 水平升高的患者，若结合罗马 IV 标准与生物标志物检测结果，可更可靠地进行评估，从而促进早期启动针对症状的治疗，并避免不必要的侵入性检查。相反，对于生物标志物结果正常但符合罗马 IV 标准的患者，应加强随访监测，以排除其他器质性疾病。因此，将此类生物标志物整合到临床实践中有望提高诊断的准确性和效率，但仍需在临床环境中进行前瞻性验证。

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者出现的临床症状可能与肠道屏障功能受损有关³³该功能主要由肠上皮细胞间的紧密连接（tight junction, TJ）结构介导，其中ZO-1和occludin蛋白发挥重要作用。^34,35ZO-1 参与维持黏膜上皮的机械屏障功能及通透性³⁶Occludin 主要负责在细胞间形成紧密连接，这对于维持细胞的屏障功能至关重要³⁷紧密连接蛋白claudin-2在形成细胞旁路孔道等多种功能中发挥重要作用³⁸在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者中，ZO-1 和 occludin 通常减少，claudin-2 增加，肠屏障受损，通透性增强。本研究发现 NEAT1 敲低增加了TEER值 体外 细胞模型，支持某种损伤效应 NEAT1 在此模型中对肠道屏障的影响。在分子水平上，抑制 NEAT1 表达导致关键紧密连接蛋白的mRNA表达水平显著反弹 ZO-1 和闭合蛋白（occludin）表达增加，而claudin-2表达减少。这表明 NEAT1 可能负向调控紧密连接蛋白的表达，破坏肠上皮的物理屏障，增加其通透性。最终可能导致“肠漏”现象。此外，腹泻型肠易激综合征（IBS-D）中广泛存在的低度炎症是加剧屏障损伤的重要因素。³⁹大量研究已证实，lncRNA 可作为炎症信号通路中的关键调控节点⁴⁰我们的研究与此一致。基因敲低 NEAT1 显著减少由LPS诱导的促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的释放。这与 NEAT1 作为一种在其他炎症模型中具有促炎作用的lncRNA，表明在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）中可能存在炎症-屏障损伤-炎症的恶性循环，其中 NEAT1 起着重要作用。

microRNAs（miRNAs）是参与疾病调控的另一类重要因素。miR-29b-3p 在多种脂多糖（LPS）诱导的细胞炎症反应中呈低表达。^41,42. 与大多数研究一致，我们发现 IBS-D 患者血清中 miR-29b-3p 水平显著下调，并与 NEAT1 上调。我们进一步表明 NEAT1 在该模型中，直接与细胞质中的miR-29b-3p结合并发挥海绵作用。功能挽救实验进一步表明 NEAT1 影响Caco-2细胞的存活率和凋亡，以及相关水平 ZO-1, occludin, 和 claudin-2 mRNA，至少部分通过miR-29b-3p介导，最终影响肠道屏障的完整性。值得注意的是，我们的数据表明，在肠易激综合征（IBS）相关的肠道屏障功能障碍背景下，miR-29b-3p水平与 ZO-1 以及闭合蛋白的水平。这种正向调控可能是间接的；例如，miR-29b-3p 可能通过靶向紧密连接蛋白的转录抑制因子来抑制其转录，从而解除抑制作用，促进这些蛋白的表达 ZO-1 以及闭合蛋白（occludin）。这一假设也得到了先前研究的支持，这些研究报道 miR-29b-3p 通过靶向屏障功能的负性调控因子，在炎症条件下发挥保护作用⁴².

然而，miR-29b-3p 通过哪些靶基因调控 ZO-1 和 occludin mRNA 表达仍有待进一步研究，以完善ceRNA网络，这也是本研究的局限性之一。此外，本研究还存在其他局限性：第一，本研究为单中心研究，样本量相对较小（仅纳入116例IBS-D患者），NEAT1 的临床诊断价值仍需通过大规模、多中心的前瞻性队列研究进一步验证。第二，本研究主要基于临床相关性分析和体外细胞模型，未来需要借助动物模型来验证该信号轴在体内的作用。第三，miR-29b-3p 在 IBS-D 发病机制中所涉及的具体下游靶基因网络尚未完全阐明。未来的研究应聚焦于以下方向：（1）验证 NEAT1 和 miR-29b-3p 在 IBS-C 和 IBS-M 患者中的诊断价值；（2）在动物模型中测试靶向 NEAT1 的干预措施的治疗效果；（3）阐明 miR-29b-3p 调控紧密连接蛋白的精确分子机制。这些工作将有助于推动本研究发现的临床转化。

综上所述，NEAT1 在腹泻型肠易激综合征（IBS-D）患者中高表达，并在该人群中具有良好的诊断价值。低水平的 NEAT1 可通过提高脂多糖处理的 Caco-2 细胞中 miR-29b-3p 的表达，促进细胞活力，减少细胞凋亡，缓解肠屏障损伤，并抑制炎症反应。NEAT1/miR-29b-3p 轴为理解 IBS-D 复杂的病理生理机制提供了新的视角。NEAT1 可能作为 IBS-D 潜在的诊断生物标志物，而 NEAT1/miR-29b-3p 轴可能成为该疾病潜在的治疗靶点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Corning	CLS3524	用于细胞接种
96孔板	Corning	CLS3599	用于CCK-8实验中的细胞接种
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒	Invitrogen	V13242	用于检测细胞凋亡率
抗AGO2单克隆抗体	Proteintech	67934-1-Ig	用于免疫沉淀Ago2结合的RNA复合物
抗Claudin-2抗体	Invitrogen	32-5600	一抗，稀释比例1:1000
抗GAPDH抗体	Cell Signaling Technology	5174	一抗，稀释比例1:5000；作为上样对照
抗人IgG抗体	Proteintech	10284-1-AP	用作RIP实验的阴性对照
抗Occludin抗体	Abcam	ab31721	一抗，稀释比例1:500
抗ZO-1抗体	Proteintech	21773-1-AP	一抗，稀释比例1:1000
Caco-2细胞	SUNNCELL	SNL-068	用于构建肠上皮屏障模型
CCK-8试剂盒	Solarbio	CA1210	细胞增殖检测试剂盒
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432	用于RNA提取过程中的相分离
DMEM培养基	Gibco	11965092	用于细胞培养
双荧光素酶报告基因检测试剂盒	ThermoFisher	16186	用于检测荧光素酶活性
ELISA试剂盒（用于IL-1β）	R&D Systems	DY201	用于检测细胞培养上清中的目标蛋白
ELISA试剂盒（用于IL-6）	R&D Systems	D6050B	用于检测细胞培养上清中的目标蛋白
ELISA试剂盒（用于IL-8）	R&D Systems	NBP3-28022	用于检测细胞培养上清中的目标蛋白
ELISA试剂盒（用于TNF-α）	R&D Systems	DTA00D	用于检测细胞培养上清中的目标蛋白
增强型化学发光（ECL）底物	Thermo Fisher	32106	用于显影蛋白条带
乙醇（75%）	Sigma-Aldrich	459844	用于洗涤RNA沉淀
FBS（胎牛血清）	Gibco	10099141	用于细胞培养
流式细胞仪	Beckman Coulter	B53002	用于检测细胞凋亡率
HRP标记的二抗	Cell Signaling Technology	7074	催化ECL底物产生化学发光信号
异丙醇	Sigma-Aldrich	1133502500	用于RNA沉淀
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	转染试剂
脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich	L2880	用于诱导构建细胞模型
酶标仪	BioTek	Epoch 2	用于检测96孔板中样品的吸光度
Nanodrop微量分光光度计	Thermo Scientific	ND-2000C	用于测定RNA浓度和纯度
脱脂奶粉	Coolaber	CN7861	用于封闭膜（配制成5%溶液）
PARIS试剂盒	Thermo Fisher	AM1921	用于细胞核质分离
青霉素–链霉素	Gibco	15140122	用于防止细胞培养过程中的污染
Pierce BCA蛋白定量试剂盒	Thermo Fisher	23225	用于测定蛋白浓度
pmirGLO双荧光素酶载体	Promega	E1330	双荧光素酶报告基因载体
PrimeScript RT反转录试剂盒	Takara	RR047A	用于将RNA反转录为cDNA
PVDF膜	Millipore	IPVH00010	用于SDS-PAGE后的蛋白转膜
实时荧光定量PCR仪	Applied Biosystems	4365464	用于检测目标基因
RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）	Thermo Fisher	89901	用于细胞总蛋白提取
RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒	Sigma-Aldrich	17-701	使用Protein A/G磁珠进行RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验
SDS-PAGE试剂（10%胶）	TargetMol	C0189	用于按分子量分离蛋白质
SYBR Green预混液	Thermo Fisher	4309155	用于PCR检测
跨膜电阻测量仪（伏欧表）	Millipore	MERS00002	跨膜电阻测量仪，用于测定单层细胞完整性
Transwell小室	Corning Costar	CLS3413	用于单层细胞培养及TEER值测定
TRIzol试剂	Invitrogen	15596026CN	用于总RNA提取