在脊髓损伤（SCI）患者中，CASC11 的上调与损伤严重程度相关。体外实验显示，CASC11 的下调可减轻细胞凋亡和炎症反应，提示其可能与 miR-130b-5p/SPP1 轴相关。这些结果表明，CASC11 在 SCI 发病机制中具有作为生物标志物候选分子的潜在作用 。
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研究文章
* These authors contributed equally
在脊髓损伤（SCI）患者中，CASC11 的上调与损伤严重程度相关。体外实验显示，CASC11 的下调可减轻细胞凋亡和炎症反应，提示其可能与 miR-130b-5p/SPP1 轴相关。这些结果表明，CASC11 在 SCI 发病机制中具有作为生物标志物候选分子的潜在作用 。
脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤。本研究是一项单中心、观察性且基于体外（in vitro）的研究，利用临床血清样本和脂多糖刺激的细胞模型，探讨了CASC11在SCI中的诊断潜力及其可能的调控机制 。采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测CASC11、miR-130b-5p和SPP1的表达水平。通过CCK-8细胞计数试剂盒、流式细胞术、蛋白质印迹（western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、双荧光素酶报告基因实验以及RNA免疫沉淀（RIP）实验评估细胞功能及靶向关系。CASC11在SCI中高表达，并与炎症相关，具有作为潜在诊断生物标志物的价值。在脂多糖（LPS）处理的PC-12细胞中，沉默CASC11可缓解细胞活性抑制、凋亡和炎症反应，而miR-130b-5p抑制剂可逆转该效应。这些结果提示，CASC11与SCI严重程度相关，体外（in vitro）数据表明其可能通过CASC11/miR-130b-5p/SPP1轴参与炎症和凋亡反应。本研究的局限性在于其单中心设计且缺乏体内（in vivo）验证。
脊髓损伤（SCI）是指由外力或疾病导致脊髓受损而引起的一种暂时性或永久性的系统性功能障碍，可导致运动、感觉、反射以及自主神经功能的损害1,2。患者常面临终身的身体功能障碍和并发症，给个人及家庭带来巨大痛苦和负担。SCI 的病因 broadly 分为创伤性和非创伤性两大类3。创伤性损伤主要由交通事故、高处坠落和运动相关事件等外部力量引起的脊柱骨折所致，在临床管理中日益成为重大挑战4。与此同时，原发损伤后启动的继发性损伤级联反应，尤其是炎症反应失调和神经元凋亡，被认为是导致神经功能持续恶化的重要因素。近期研究强调了神经炎症、再生及功能恢复在 SCI 病理生理过程与修复机制中的关键作用5。作为核心的继发性反应，神经炎症在组织损伤与修复过程中发挥双重作用。鉴于受损脊髓的再生能力有限，需要采用联合治疗策略，包括抗炎治疗、细胞移植、康复训练和分子干预等协同手段6。尽管目前已建立多种诊断和治疗方法，但临床实践仍主要依赖影像学检查7。然而，这些技术受限于对高端设备的高要求、严格的患者适应证以及高昂的费用8。因此，迫切需要一种便捷、准确且无创的实验室生物标志物。此类标志物的发现将有助于在不干扰常规治疗方案的前提下实现 SCI 的早期诊断，从而推动更及时、有效的治疗干预措施的开发。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类重要的功能性RNA分子，尽管其不具备编码蛋白质的潜力，但在多种生物学功能中发挥关键作用，包括炎症和细胞凋亡的调控9长链非编码RNA（lncRNAs）可作为微小RNA（miRNAs）的分子海绵，从而有效阻止这些miRNA与其靶向的mRNA结合并使其沉默10例如，lncRNA MAGI2-AS3 介导 miR-223-3p 以加速骨折愈合11. 靶向lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 网络呈现了一种有前景的治疗策略，可促进脊髓损伤后的恢复12. CASC11, 位于染色体8q24.21、长度为872 bp的转录本，被公认为在多种人类癌症中表达失调的分子13. CASC11 在绝经后骨质疏松症患者中呈阳性表达，并能够区分患者与健康对照者14此外， CASC11 在骨折患者中表现出相似的上调模式和治疗潜力15根据这些报告， CASC11 可能调节炎症反应和细胞活性。尽管已有这些认识，其表达模式及生物学功能仍不明确。 CASC11 在SCI中仍完全未知。鉴于过度炎症和细胞凋亡是继发性SCI的主要驱动因素，我们假设 CASC11 可能是脊髓损伤中的候选生物标志物和调控因子。本研究探讨了其临床关联性及作为生物标志物的潜力 CASC11 通过分析患者队列在SCI中 体外 细胞模型图1）。此外，我们探讨了一种可能的分子机制 CASC11包括其在调节脊髓损伤后炎症反应中的潜在作用。
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受试者入组
选取2023年1月至2025年5月期间在医院接受治疗的急性脊柱创伤患者（n = 300），根据美国脊髓损伤协会损伤分级标准（AIS分级），将其分为完全性脊髓损伤（CSCI）组（A级，n = 98）、不完全性脊髓损伤（ISCI）组（B、C和D级，n = 95）以及正常神经功能（NNF）组（E级，n = 107）。对于NNF组患者，通过磁共振成像（MRI）确认存在脊髓损伤（SCI）的影像学证据，如水肿、挫伤或受压，但未表现出感觉或运动功能障碍。另选取同期招募的90名健康参与者作为对照组。纳入标准为：（1）经影像学（MRI或CT）确诊为脊髓损伤，并符合既定的临床管理指南16；（2）创伤发生时间在入院前24小时内；（3）具有完整临床资料的成年参与者。排除标准为：（1）既往有与骨折或脊髓损伤相关的手术史；（2）严重冠状动脉疾病或显著的心肺疾病；（3）急性重度颅脑损伤；（4）恶性肿瘤、心脑血管疾病或免疫系统疾病。本研究已获得深圳市第四人民医院伦理委员会批准，并获取了受试者的知情同意。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。
标本采集
入院时，使用血清分离管在受伤后24小时内采集受试者的静脉血样本（5 mL）。血液在室温下静置凝固30分钟，随后在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟。小心收集上清液血清，分装至无RNase的微量离心管中，保存于-80 °C，待进一步分析。
细胞培养与脂多糖诱导
大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC-12）和小鼠小胶质细胞（BV-2）在添加了10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基中，于37 °C条件下培养。in vitro 炎症损伤模型的建立方法为：将PC-12细胞和BV-2细胞分别暴露于0、1、5和10 µg/mL浓度的脂多糖（LPS）中处理12 h17。每个浓度均进行了三次独立的生物学重复实验。
实时定量聚合酶链式反应
采用苯酚-氯仿抽提法从样品中提取总RNA，随后用异丙醇沉淀。通过分光光度法检测RNA纯度，A260/280 nm比值在1.8–2.1范围内的样品用于后续分析。根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，并以所得cDNA为模板，在PCR仪上使用SYBR Green预混液进行RT-qPCR反应。GAPDH作为CASC11和SPP1 mRNA的内参基因，小核RNA（U6）作为miR-130b-5p的内参基因。对于血清样品，在RNA提取前向血清中添加合成的cel-miR-39，以校正RNA回收效率的差异。引物序列如下：CASC11上游引物5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAC-3'，下游引物5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'；miR-130b-5p上游引物5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3'，下游引物5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'；SPP1 mRNA上游引物5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3'，下游引物5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'。基因表达水平采用2-ΔΔCt法计算。每个RT-qPCR反应设置三个技术重复，共进行三次独立的生物学重复实验。
转染
使用转染试剂将 CASC11 沉默序列（si-CASC11）、miR-130b-5p 模拟物/抑制剂、SPP1 过表达质粒（ov-SPP1）及其相应的阴性对照（NC）合成后转染至 PC-12 和 BV-2 细胞中。转染后 48 小时，在三个生物学重复样本中评估转染效率。
增殖与凋亡检测
进行细胞活力检测时，将细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种至96孔板中，培养24小时以使细胞贴壁。孵育结束后，向每孔加入10 µL CCK-8试剂，随后在37 °C下孵育2小时。然后使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。对于细胞凋亡检测，用胰蛋白酶消化收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并将细胞重悬于结合缓冲液中，终浓度为1 × 106个细胞/孔。接着，取100 µL细胞悬液加入5 mL流式管中，再加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL碘化丙啶（PI）染色液。样品轻轻混匀后，避光室温孵育15分钟。随后每管加入400 µL结合缓冲液，通过流式细胞术定量检测凋亡细胞。所有实验条件均在三次独立的生物学重复实验中进行，每次设三个技术重复。
双荧光素酶活性检测
通过生物信息学网站（lncRNASNP2 和 TargetScan）预测了 CASC11 与 miR-130b-5p 的下游靶点。合成包含野生型（wt）或突变型（mut）互补序列的片段，并将其克隆至双荧光素酶报告载体中，构建 wt 和 mut 报告质粒。将 PC-12 细胞接种后，使用脂质体转染试剂共同转染 miR-130b-5p 模拟物/抑制剂与构建好的 wt/mut 质粒。转染 48 小时后，检测荧光素酶活性以评估两者之间的相互作用。每个实验组包含三个技术重复和三个生物学重复。
RNA 免疫沉淀（RIP）实验
使用RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP实验。细胞用裂解缓冲液裂解后，与抗Ago2抗体或正常IgG抗体孵育。利用磁珠富集RNA-蛋白质复合物。洗涤后去除结合的蛋白质，分离免疫沉淀的RNA。通过RT-qPCR定量CASC11和miR-130b-5p的富集水平。每组包含三个技术重复和三个生物学重复。
蛋白质印迹
使用细胞裂解缓冲液从PC-12和BV-2细胞中制备蛋白裂解液，并通过BCA法测定总蛋白含量。每个样品取30 µg蛋白上样至12% SDS-PAGE凝胶，电泳分离后转移至PVDF膜。膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭2小时，随后与Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和GAPDH的一抗在4 °C孵育过夜，抗体稀释比例为1:1,000。洗膜后，室温下与HRP标记的二抗孵育1小时。使用图像分析软件分析蛋白条带信号，通过条带密度评估凋亡相关蛋白的表达水平。Western blot实验包含三次生物学重复，每组设有三次技术重复。
酶联免疫吸附测定
采用ELISA试剂盒，根据制造商说明书定量检测患者血清以及PC-12和BV-2细胞上清液中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。将样本加入预先包被的微孔板中，加入检测抗体后继续孵育。随后加入酶标结合物并进行孵育。洗涤后加入底物显色，反应终止后使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，并根据提供的标准曲线将吸光度值转换为炎症因子浓度。每项ELISA实验均在三次独立的生物学重复中进行，每次设三个技术重复。
统计分析
连续变量以均值 ± 标准差（SD）表示，分类变量以数量和百分比（n, %）表示。两组之间的比较采用 Student's t-检验。对于涉及两组以上组间的比较，采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析评估 CASC11 对临床组别的区分能力。两个变量之间的关联性通过 Pearson 相关性分析进行检验。对于基于细胞的实验，每组包含三个独立的生物学重复，每次测量均进行三个技术重复。统计学显著性定义为 P < 0.05。
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受试者的基本数据
对照组、NNF组、ISCI组和CSCI组患者的基线特征见表1。统计分析显示，各组在性别、年龄、体重指数（BMI）、损伤病因及损伤时间等变量上差异无统计学意义（P > 0.05）。四组在住院时间、ASIA分级以及促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）浓度方面差异具有统计学意义（P < 0.001）。
升高的CASC11在脊髓损伤中的诊断潜力
CASC11 在血清中的水平在所有脊髓损伤（SCI）患者组中均显著高于对照组。在被诊断为慢性脊髓损伤（CSCI）的个体中，这种升高最为明显（图2A）。ROC曲线分析显示，CASC11 能够有效区...
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脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的中枢神经系统疾病，常导致感觉、运动控制和自主神经功能的显著缺损，从而严重影响患者的生活质量和长期预后18。患者在脊柱创伤后可能出现功能障碍和感觉丧失，影像学检查（如MRI）可用于评估SCI的发生情况19。SCI的发生会引发一系列有害的继发性损伤级联反应，其特征为强烈的神经炎症、水肿以及炎性细胞的浸润。这一级联反应与创伤性疼痛带来的应激共同作用，逐渐破坏神经功能20,21。损伤后的早期阶段存在较高的临床恶化风险，凸显了及时医疗干预在阻止疾病进展中的关键作用。
脊髓损伤和神经损伤的临床研究领域正在经历快速变革，为疾病潜在机制提供了新的视角。最近一项引人注目的研究发现，在脊髓损伤（SCI）中，大量长链非编码RNA（lncRNA）出现异常表达22。例如，lncRNA Airsci 在 SCI 中表达下...
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作者声明无利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Yeasen，中国 | P0010 | |
| CCK-8 溶液 | Sigma-Aldrich，美国 | 96992 | |
| 双荧光素酶报告载体 | Promega，美国 | E133A | pmirGLO 载体 |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 | ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国 | 30-2002 | |
| IL-1β ELISA 检测试剂盒 | R&D Systems，美国 | DY401 | |
| IL-6 ELISA 检测试剂盒 | R&D Systems，美国 | HS600B | |
| TNF-α ELISA 检测试剂盒 | R&D Systems，美国 | DTA00C | |
| 胎牛血清 | Gibco，格兰岛，纽约州，美国 | 10099141 | |
| 流式细胞仪 | BD FACSCalibur，美国 | FACS101 | |
| 图像分析软件 | NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国 | 版本 1.44p | ImageJ 软件 |
| 异丙醇 | 北京化工厂，中国 | 32064 | |
| 脂质体转染试剂 | Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国 | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich，美国 | L2880 | |
| 裂解缓冲液 | Beyotime，中国 | P0013D | RIPA 裂解缓冲液 |
| 酶标仪 | Reagen，中国 | RNE90002 | |
| PC-12 和 BV-2 细胞 | ATCC，马纳萨斯，美国 | ||
| 酚-氯仿试剂 | Thermo，美国 | 15596026 | Trizol 试剂 |
| 逆转录试剂盒 | Takara，日本 | RR047A | PrimeScript RT 试剂盒 |
| RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore，美国 | 17-700 | Magna RIP 试剂盒 |
| 无 RNase 微量离心管 | Axygen，康宁，纽约州，美国 | MCT-150-C-S | |
| 血清分离管 | Terumo，东京，日本 | VP-AS109K60 | |
| 统计分析软件 | 圣迭戈，美国 | 版本 9.0 | GraphPad Prism |
| SYBR Green 预混液 | Takara，日本 | RR420A | SYBR Premix Ex Taq |