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方法文章

一种用于模拟生理脉动剪切应力与振荡性高血糖共同作用下内皮功能障碍的微流控系统

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DOI：

10.3791/71037

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2026年5月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Cardio-Cerebrovascular Medicine, Central Hospital of Dalian University of Technology, 2School of Mechanical Engineering, Dalian University of Technology, 3School of Biomedical Engineering, Faculty of Medicine, Dalian University of Technology, 4Key Laboratory of Integrated Circuit and Biomedical Electronic System, Dalian University of Technology

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种用于构建和运行微流控系统的方案，该系统可使内皮细胞同时暴露于振荡性高血糖和脉动性剪切应力。该方法具有生理相关性 体外 研究糖尿病内皮功能障碍的模型。该方案可实现对氧化应激和内皮细胞反应的定量测量。

摘要

糖尿病血管并发症中的内皮功能障碍涉及代谢紊乱与特定因素之间的复杂相互作用，尤其是波动性高血糖（oscillatory glucose, OG）与脉动性剪切应力（pulsatile shear stress, PSS）。尽管这些因素已被分别研究，传统模型仍局限于静态高糖环境或简化的层流条件，无法模拟糖尿病血管中实际存在的时空耦合效应。通过使用可编程微流控平台，本方案提供了一个有价值的实验体系，用于研究同步波动性高血糖与生理PSS对内皮细胞的联合影响。该方案旨在模拟在生理相关条件下代谢与机械刺激耦合所导致的内皮功能障碍。利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片结合压力驱动控制系统，可实现对流动波形和葡萄糖浓度变化的精确且独立的调控。系统的血流动力学保真度通过显微粒子图像测速技术（Micro-Particle Image Velocimetry, Micro-PIV）进行验证，而细胞反应则通过定量检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平和细胞活力进行表征。代表性结果表明，生理PSS可有效减轻OG诱导的氧化损伤。这一效应表现为在联合刺激条件下，细胞内ROS水平降低，细胞活力提高。根据具体研究问题，可调节剪切应力模式、葡萄糖波动频率以及微通道几何结构等参数。该方法为研究糖尿病血管疾病中力生物学通路的机制及药物干预的筛选提供了灵活有效的工具。

引言

内皮功能障碍是糖尿病血管并发症发展过程中的一个关键早期事件，由代谢紊乱和异常的血流动力学因素共同驱动1,2。越来越多的研究认识到，餐后高血糖（OG）水平而不仅仅是持续性高血糖，是内皮细胞中氧化应激和炎症信号通路的强效诱导因素，可导致血管损伤和稳态失调3,4,5。同时，血流动力学剪切应力是决定内皮细胞表型的重要因素，在生理运动条件下，脉动性剪切应力（PSS）可促进一氧化氮生成、抗氧化防御及血管保护作用6,7,8。因此，理解振荡性高血糖与血流动力学刺激的综合作用，对于阐明内皮功能障碍的机制至关重要。

传统的体外模型通常依赖静态的高葡萄糖环境或简化的层流条件，无法模拟体内代谢与机械信号之间复杂的动态相互作用9,10,11。尽管动物模型能够反映糖尿病的系统性特征，但缺乏在受控微环境条件下解析细胞水平信号通路所需的分辨率12。微流控技术提供了一种有效的替代方案，可在生理相关的几何结构中实现对生化和生物力学刺激的精确时空控制13，并已在多种创新的生物医学应用中推动了重要进展14,15。例如，Chen 等人16设计了一种具有时空变化的壁面剪切应力和 ATP 信号的微流控装置，用于研究内皮细胞内 Ca2+ 动态变化。Yu 等人11开发了一种血流动力学微流控芯片系统，用于检测不同生理 PSS 与高葡萄糖浓度组合下细胞的响应。尽管这些系统已被用于研究内皮细胞对剪切应力或单一代谢干扰的反应，但能够成功在同一系统中整合葡萄糖波动与 PSS 的研究仍较少。因此，目前仍缺乏一种在受控微流控环境中同步整合这两种因素的标准化、可重复的实验方案。

该方法通过建立一种可重复的微流控系统，能够递送偶联的葡萄糖（OG）和棕榈酸钠（PSS），从而弥补这一空白。该方法的主要目标是以生理相关的方式模拟内皮功能障碍背后的氧化应激、细胞活力受损以及机械生物学反应。与静态培养或传统灌注腔室相比，该方法通过实现对代谢和机械刺激的同时且可控调节，改进了现有模型，更接近糖尿病血管微环境。此外，该系统兼容活细胞成像、实时监测和分子分析，适用于内皮功能与损伤的多种应用，包括机制研究、疾病建模以及药物筛选。

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方案

伦理声明：

注意：本实验方案中使用的所有试剂、设备和软件均列于材料表中。

1. 微流控芯片制备

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微流控芯片的结构（宽 × 长 × 高 = 2 mm × 30 mm × 0.1 mm，图1A），并通过商业公司制备SU-8母模。
  2. 在洁净的混合杯中按10:1的质量比混合PDMS固化剂与预聚物，并手动充分搅拌5分钟。
  3. 将容器置于-0.08 MPa的真空腔中至少15分钟，以去除混合过程中截留的气泡。
    注意：为加快去泡并防止溢出，可暂时将腔体通气至大气压以破裂大气泡，然后立即重新抽真空。重复此通气循环2–3次，直至混合物整体完全透明且无宏观气泡。
  4. 将PDMS浇注在置于玻璃培养皿中的硅片上。
  5. 将浇注在硅片上的PDMS置于干燥器中进一步脱气15分钟，以去除浇注过程中可能形成的气泡。
    注意：若仍有顽固的微小气泡滞留在SU-8母模结构附近或内部，可使用手动橡胶吹气球轻轻将其吹向边缘或刺破。彻底去除气泡对于防止微通道结构缺陷至关重要。
  6. 将含有模具和聚合物的培养皿放入设定为80 °C的烘箱中加热2小时。
    警告：操作高温材料时请使用耐热手套。
  7. 使用手术刀小心地从母模上剥离固化的聚合物片。
  8. 使用打孔工具（例如，直径1.2 mm）在聚合物片上指定的通道端口位置打出入液口和出液口。
  9. 用胶带清洁盖玻片和聚合物片的图案面。
    暂停点：固化并打孔后的PDMS片可在室温下储存于洁净容器（例如，密封的培养皿）中数周，待后续进行等离子处理和键合。
  10. 在室温空气条件下，以65 W功率对聚合物片和盖玻片进行60秒的等离子体清洗处理。
  11. 立即对齐聚合物通道面与经处理的盖玻片表面。
  12. 轻轻按压，形成永久封闭的微流控通道。

2. 内皮细胞的制备与接种

  1. 将键合好的微流控芯片置于装有去离子水的硼硅酸盐玻璃瓶中，于121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。
    注意：高压灭菌过程中需将芯片完全浸没于水中，以平衡压力，防止PDMS微通道发生形变。此步骤同时有助于去除困在通道内的气泡，并为后续引入液体做好通道预润湿准备。
    暂停点：灭菌后的微流控芯片可在密封玻璃瓶中于室温下安全保存数周，直至进行细胞接种时使用。
  2. 将灭菌后的芯片放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）与低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）1:1混合液的60 mm培养皿中。
  3. 使用1 mL注射器将100 µg·mL-1纤连蛋白注入通道中，并在37 °C下孵育4小时。
    注意：确保微流控芯片完全位于液面以下。将适配器软管连接至注射器针头，先用液体充满软管，再将其插入液面以下，连接入口后缓慢注入，以确保无气泡进入通道。
  4. 向低糖DMEM（5.5 mM葡萄糖）中加入24.5 mM D-甘露醇以提高渗透压；向高糖DMEM（25 mM葡萄糖）中加入5 mM D-葡萄糖，使终浓度达到30 mM葡萄糖。分别配制含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的正常葡萄糖（NG）培养基和高葡萄糖（HG）培养基。
  5. 将1× PBS、胰蛋白酶、NG和HG培养基在37 °C水浴中预热。在细胞融合度达90%时，从培养皿中收集人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，并在37 °C孵育30秒。计数收获的细胞，并分别用NG培养基和HG培养基将细胞浓度调整至1 × 106 cells/mL。
  6. 使用1 mL注射器将100 µL细胞悬液注入微流控芯片的入口端，对照组使用NG培养基，实验组使用HG培养基。将芯片置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养48小时。
    注意：在进行后续操作前，应让细胞贴壁至少4小时。在静态培养阶段，每2小时手动交替更换两种培养基，以模拟振荡性高血糖环境。过夜时将细胞维持在5.5 mM葡萄糖条件下，以模拟体内实际情况（图1B）。

3. 动态刺激装置设置

  1. 分别用正常葡萄糖（NG）和高葡萄糖（HG）培养基填充两个100 mL储液器，并将其连接至程序化压力控制系统相应的通道。
  2. 使用硅胶管将储液器、两位三通电磁阀和微流控芯片连接起来。
  3. 使用直径为1.3 mm的90°弯角不锈钢接头将PDMS芯片的进样口和出样口与管路连接。
    注意：预先将100 mL储液器、硅胶管和不锈钢接头在高温高压灭菌器中进行灭菌处理。
  4. 计算达到目标生理性剪切应力（PSS，τ）所需的流速（Q）。使用公式 τ = (6µQ)/(wh2)，其中µ为黏度，w为通道宽度，h为通道高度。
  5. 设定目标生理性剪切应力（PSS，τ = 10 ± 2 dyn·cm-2，1 Hz），该值对应计算出的流速为200 ± 40 µL·min-1。
  6. 编程设定程序化气泵以生成正弦波函数来维持PSS；同时编程设定阀门控制器每5分钟切换一次通道，以便在动态刺激期间产生方波形式的葡萄糖振荡。
  7. 启动程序化泵系统，共同施加高糖刺激（OG）和生理性剪切应力（PSS），持续总时长为30分钟。

4. 用于流场验证的显微粒子图像测速技术（Micro-PIV）

  1. 制备含有0.05%体积浓度荧光微粒（1 μm）的NG和HG培养基。确保微粒均匀分散，无聚集现象。
  2. 将一个洁净且无细胞的微流控芯片（与细胞实验中使用的芯片相同）放置在倒置荧光显微镜的载物台上。
  3. 连接系统中的所有组件（图1C）。
    1. 将压力源连接至压力控制器。
    2. 将压力控制器连接至阀控制器，后者与计算机相连，用于对压力波形进行自动控制。
    3. 通过独立的管路将压力控制器的输出端分别连接至HG和NG储液器。
    4. 将两个储液器均连接至3/2气动阀，该阀根据预设的振荡性葡萄糖程序在HG和NG培养基之间切换。
    5. 通过管路将3/2气动阀的输出端连接至微流控芯片的入口。
    6. 将微流控芯片的出口连接至废液储液器。
    7. 将微流控芯片置于显微镜载物台上，以便在整个实验过程中进行活细胞成像。
      注意：在启动流体前，确保所有管路连接牢固且无泄漏。
  4. 待流动稳定后，触发高速相机（以15 Hz双帧模式运行），以捕获流动微粒的连续图像对。设置每对图像中两帧之间的精确时间延迟（Δt）为80 μs。
  5. 采集通道内感兴趣区域（ROI）的图像。选择直道段中心区域作为ROI（图2A），使其到入口和出口的距离相等，以避免端部效应并确保流场测量具有代表性。
  6. 使用PIV分析软件处理所获取的图像对。采用自适应多遍互相关算法，初始 interrogation 区域设为64 × 64像素，并逐步优化至最终的16 × 16像素，网格步长为8 × 8像素，以确定微粒在两帧之间的位移矢量（Δx）。
  7. 利用公式 v = Δx / Δt 计算每个 interrogation 区域的速度矢量（v）。

5. 数据采集

注意：使用Calcein-AM/碘化丙啶（PI）试剂盒和活细胞氧化应激荧光探针定量细胞活力和功能，以验证葡萄糖波动引起的损伤，并评估共刺激的影响。

  1. 细胞活力
    1. 根据制造商说明书，在实验终点制备Calcein-AM/PI工作液。
      注意： PI 是一种已知的诱变剂和疑似致癌物，可插入DNA中。需极其小心操作，佩戴手套并在指定的安全工作区域进行处理。
    2. 用 PBS 冲洗通道一次，然后将 Calcein-AM/PI 工作液引入通道。将装置置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 在避光条件下孵育30分钟。
    3. 立即使用配备10×物镜的倒置荧光显微镜捕获染色细胞的荧光图像。Calcein-AM使用FITC（绿色）滤光片，PI使用TRITC或Rhodamine（红色）滤光片。
  2. 检测细胞内活性氧
    1. 制备活细胞氧化应激荧光探针（参见 材料表) 按照生产商指定的浓度（5 μM）用 PBS 配制工作液。
      警告： 荧光探针及其常用储备溶剂（如DMSO）可能具有毒性，并可促进有害物质经皮肤吸收。请佩戴手套，并在指定的安全工作区域中操作。
    2. 用 PBS 冲洗通道三次，将活细胞氧化应激荧光探针溶液引入通道。将芯片置于 37 °C、5% CO2 条件下避光孵育 30 分钟。
    3. 用 PBS 冲洗通道三次，以去除未结合的探针。立即使用远红滤光片组（激发波长 640 nm，发射波长 665 nm）通过 20× 物镜采集荧光图像，并保持所有组别的曝光参数完全相同。
      注意： 荧光强度增加表明活性氧水平升高。

6. 数据分析

暂停点：在所有原始荧光图像和高速相机图像采集完成并安全保存至硬盘后，后续的图像处理、定量分析和统计比较可随时暂停，并在之后的任意时间继续进行。

  1. 量化细胞活力
    1. 在 ImageJ 中打开获取的 Calcein-AM（绿色）和 PI（红色）图像（参见材料表）。手动调整每个通道的阈值，以区分荧光信号与背景。使用细胞计数功能对荧光细胞进行计数，根据观察到的细胞大小调整最小细胞尺寸，并在多个视野中分别计数活细胞（NLive）和死细胞（NDead）的数量。
      注意：NLive 指 Calcein-AM 阳性（绿色）细胞的数量，NDead 指 PI 阳性（红色）细胞的数量。
    2. 使用电子表格软件计算每种实验条件下活细胞的百分比（NLive / (NLive + NDead) × 100%）。使用统计分析软件计算多个视野间的平均值和标准差，用于组间比较。
  2. 量化细胞内活性氧（ROS）
    1. 在 ImageJ 中打开所需图像。通过显微镜元数据（或已知参考网格）校准像素尺寸来设定比例尺：分析 | 设定比例尺。
    2. 使用背景减除功能去除整幅图像中的非特异性均匀背景信号：处理 | 减去背景。
    3. 手动调节阈值滑块，以分割并定义细胞内 ROS 信号：图像 | 调整 | 阈值。设定阈值后，使用 分析 | 设测量项 选择“面积”和“平均灰度值”。根据观察到的细胞大小设定最小细胞尺寸，并测量细胞单层 ROI 内分割信号的平均强度：分析 | 分析颗粒。
    4. 以每张芯片至少随机选取三个视野所获得的测量值（如平均强度）的均值，报告各实验条件下的 ROS 水平。
  3. 进行统计学比较
    1. 将定量结果（活力百分比和 ROS 平均强度）输入数据分析与绘图软件（参见材料表）。
    2. 采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验，将实验组与对照组进行比较，显著性水平设为 p = 0.05。使用软件完成分析，并生成以标准差（SD）表示误差条的图表。

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结果

微流控通道内流场的微粒子图像测速（Micro-PIV）验证
图1D 展示了用于研究内皮细胞对代谢与机械刺激耦合作用响应的微流控平台整体结构。该系统将直通道PDMS微流控芯片与压力驱动的流量控制模块集成，可同时施加高糖（OG）条件和生理水平的脉动剪切应力（PSS）。通过可编程的阀门切换策略，实现正常葡萄糖（NG）与高葡萄糖（HG）培养基的周期性交替，同时通过计算机控制的压力调节同步生成脉动流波形。

为验证微流控系统的血流动力学保真度，采用显微粒子图像测速技术（Micro-PIV）对微通道内的流动特性进行了定量分析。图2B显示，该感兴趣区域（ROI）内实测的流量表现出稳定且可重复的振荡，与预设的输入波形高度一致。定量回归分析表明拟合度良好（R2 = 0.94），测得平均流量为184.75 ± 0.79 µL·min-1，振荡幅度为40.30 ± 1.13 µL·min-1<...

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讨论

本文所述的微流控系统为研究餐后高血糖（OG）和持续性高血糖（PSS）对内皮细胞功能的综合作用，提供了一个稳定且具有生理相关性的研究平台。该方法的主要优势在于能够在一个定义明确的微环境中，精确控制并分离机械刺激与生化刺激。与缺乏血流动力学力的常规静态培养体系，或常常掩盖细胞水平信号传导的动物模型4,17,18,19相比，本实验方案能够独立调节流动模式和葡萄糖浓度变化过程20,21。通过模拟代谢紊乱与血流动力学力之间的动态相互作用，该系统为解析糖尿病血管并发症背后的力学生物学机制提供了独特的机会。

成功实施本方案依赖于若干关键步骤。首先，在微流控芯片制备过程中，必须彻底清除PDMS预聚物及微流控通道中的气泡，因为残留...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号 12372304、12172081）和中央高校基本科研业务费专项资金（DUT25YG272）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTANEST Biotechnology Co., Ltd.211052细胞解离
1 mL 注射器Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.1mL注射液体
60 mm 培养皿NEST Biotechnology Co., Ltd.705001细胞培养
90° 角不锈钢连接器Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.1.3 mm适配密封装置
AutoCAD 软件AutodeskRRID:SCR_014981计算机辅助设计软件
硼硅酸玻璃瓶Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.双通道 100mL储液池
Calcein-AM/PI 试剂盒Beyotimebyt-c2015染色
细胞培养箱ESCOEsco CelMate细胞培养
CellROX Deep RedInvitrogenC10422染色
D-葡萄糖Sigma Aldrich47249葡萄糖
D-甘露醇MacklinM813423调节渗透压
DynamicStudioDantec DynamicsV8.6PIV 分析软件
胎牛血清（FBS）Gibco14190-094培养基
纤连蛋白Sigma AldrichF-2006细胞黏附
荧光微粒Thermo ScientificG0100显微 PIV
玻璃盖玻片Citotest Scientific Co.,Ltd.#1微流控芯片
高糖 DMEMSolarbio12100培养基
高速相机Dantec DynamicsFlowSense EO显微 PIV
ImageJNIHRRID:SCR_003070图像处理软件
倒置荧光显微镜OlympusIX73细胞活力检测
倒置荧光显微镜OlympusIX83观察与图像采集
低糖 DMEMSolarbio31600培养基
OriginOriginLabRRID:SCR_014212数据分析与绘图软件
PDMSDow lnc.184微流控芯片
青霉素/链霉素（P/S）NEST Biotechnology Co., Ltd.211092培养基
磷酸盐缓冲液（PBS）NEST Biotechnology Co., Ltd.211031细胞培养
等离子清洗机Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.PC-6D微流控芯片
可编程压力控制系统ElvesysOB1 MK4流体控制
硅胶管Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.964101mm*3mm
SU-8 母模Boao Biology Group Co. Ltd.N/A微流控芯片
阀控制器ElvesysMUX Wire V3流体控制

参考文献

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