一种微流控系统，用于模拟生理脉冲剪切应力与振荡性高血糖下的内皮功能障碍

Summary

本文介绍了一种方法，用于制造和操作一种微流控系统，使内皮细胞暴露于同步振荡性高血糖和脉动剪切应力之下。该方法为研究糖尿病内皮功能障碍提供了具有生理学意义的 体外模型。该方案能够定量测量氧化应激和内皮细胞反应。

Abstract

糖尿病血管并发症中的内皮功能障碍涉及代谢紊乱之间的复杂相互作用，特别是振荡性葡萄糖（OG）和脉搏剪切应激（PSS）。尽管这些因素已被单独研究，传统模型仍限于静态高血糖或简化层流，缺乏模拟糖尿病血管中整合时空耦合的能力。通过利用可编程微流控平台，该方案为研究同步振荡性高血糖与生理性PSS对内皮细胞的综合影响提供了宝贵平台。本方案旨在模拟内皮功能障碍在生理相关的耦合代谢和机械条件下的表现。结合聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片和压力驱动控制系统，能够精确、独立地调制流动波形和葡萄糖浓度曲线。系统的血流动力学保真度通过微颗粒成像速度测量（Micro-PIV）验证，同时通过监测细胞内活性氧（ROS）水平和细胞存活率，定量表征细胞响应。代表性结果表明，生理性PSS有效减轻OG引起的氧化损伤。这一效应表现为细胞内ROS水平降低和细胞存活率提升，在联合刺激条件下表现为显著。根据研究问题的不同，可以调整剪切应力模式、葡萄糖振荡频率和通道几何形状等参数。该方法作为机械生物学通路机制研究和糖尿病血管疾病治疗干预药物筛查的多功能工具。

Introduction

内皮功能障碍是糖尿病血管并发症发展的关键早期事件，由代谢紊乱和异常血流动^{动力学力量}共同驱动 ^1,2。OG水平，而不仅仅是持续高血糖，越来越被认为是内皮细胞中氧化应激和炎症信号传导的强有力诱导因子，导致血管损伤和稳态受损 ^3,4,5。同时，血流动力学剪切应激是内皮表型的主要决定因素，生理运动条件下的PSS促进一氧化氮生成、抗氧化防御和^{血管保护6,7,8}。因此，理解振荡性高血糖与血流动动力学刺激的综合效应对于阐明内皮功能障碍的机制至关重要。

传统的体外模型通常依赖静态高血糖条件或简化的层流，无法复制体内代谢与机械线索之间复杂且动态的相互作用 ^9,10,11....

Protocol

伦理声明：

注意：本协议中使用的所有试剂、设备和软件均列于 材料表中。

1. 微流控芯片制造

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微流控芯片结构（宽 x L x 高 = 2 mm x 30 毫米 x 0.1 毫米， 见图1A），并通过商业公司制作SU-8母模。
2. 将PDMS固化剂和预聚合物按重量比10：1混合在干净的搅拌杯中，用力手动搅拌5分钟。
3. 将容器放入真空室，温度低于-0.08兆帕，至少15分钟，以去除混合过程中被困的气泡。
   注意：为加快气泡清除并防止溢流，应暂时将气缸排气至大气压以破裂大气泡，然后立即重新施加真空。重复此排气循环2–3次，直到整体混合物完全透明且无宏观气泡。
4. 将PDMS倒在放在玻璃培养皿中的晶圆上。
5. PDMS在干燥器中再加15分钟脱气，以去除铸造过程中可能形成的气泡。
   注意：如果SU-8主模具结构附近或内部仍有顽固微泡，应轻轻吹气或用手动橡胶风机将其吹破。完全去除气泡对于防止微通道结构缺陷至关重要。
6. 将含有霉菌和聚合物的培养皿放入加热至80°C的高温烤箱中烘烤2小时。

Results

微流控通道内流场的微PIV验证
图1D 概述了用于研究内皮对耦合代谢和机械刺激反应的微流控平台。该系统集成了直通道PDMS微流控芯片与压力驱动流量控制模块，实现了OG状态与生理PSS的应用。采用可编程阀门切换策略，在NG和HG介质间周期性交替，同时通过计算机控制的压力调节同步脉冲流波形。

为验证微流控系统的血流动力学保真度，使用Micro-PIV定量分析了微通道内的流动特性。在该ROI内测量的实际流量表现出稳定且可重复的振荡，紧密追踪编程输入波形（见图2B）。定量回归分析显示拟合优度很高（R² = 0.94），平均流量为184.75±0.79微升·分^-1 ，振荡幅度为40.30±1.13微升·分-¹。由于系统性液压阻力，平均流量略低于理论输入（200 μL·^min-1）.......

Discussion

本文所述的微流控系统为研究OG和PSS对内皮细胞功能的综合影响提供了稳健且生理学相关的平台。该方法的主要优势在于能够精确控制并解耦机械与生化刺激，在特定的微环境中。与传统静态培养缺乏血流动动力学力量或常掩盖细胞水平信号的动物模型^不同，该方案能够独立调节流动模式和葡萄糖浓度分布^20,21。通过复制代谢紊乱与血流动动力学力学力之间的动态相互作用，该系统为剖析糖尿病血管并发症背后的机械生物学机制提供了独特机会。

该协议的成功实施依赖于若干关键步骤。首先，在微流控芯片制造过程中，必须完全去除PDMS预聚合物和微流控通道中的气泡，因为被困气泡会改变通道几何.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	NEST生物技术有限公司	211052	细胞解离
1毫升注射器	上海正邦医科有限公司	1毫升	注入液体
60毫米培养皿	NEST生物技术有限公司	705001	细胞培养
90°斜角不锈钢连接器	洛阳美耶贸易有限公司	1.3毫米	适配器密封装置
AutoCAD软件	Autodesk	RRID：SCR_014981	计算机辅助设计软件
硼化玻璃瓶	湖南艾德特科学仪器有限公司	双重通透100毫升	水库
Calcein-AM/PI 套件	碧昂泰姆	BYT-C2015	染色
细胞培养箱	ESCO	埃斯科赛尔玛特	细胞培养
CellROX 深红	Invitrogen	C10422	染色
D-葡萄糖	西格玛·奥尔德里奇	47249	葡萄糖
D-甘露醇	麦克林	M813423	平衡渗透压
动态工作室	丹泰克动力学	V8.6	PIV分析软件
胎儿牛血清（FBS）	吉布科	14190-094	媒介
纤维内克素	西格玛·奥尔德里奇	F-2006	细胞粘附
荧光微粒	热力科学	G0100	微型PIV
玻璃罩套	Citotest科学有限公司	#1	微流控芯片
高血糖DMEM	太阳生物	12100	媒介
高速摄像机	丹泰克动力学	FlowSense EO	微型PIV
图片J	美国国立卫生研究院	RRID：SCR_003070	图像处理软件
倒置荧光显微镜	奥林匹斯	IX73	细胞存活率
倒置荧光显微镜	奥林匹斯	IX83	观测与采集
低血糖DMEM	太阳生物	31600	媒介
起源	起源实验室	RRID：SCR_014212	数据分析与绘图软件
PDMS	陶氏公司。	184	微流控芯片
青霉素/链霉素（P/S）	NEST生物技术有限公司	211092	媒介
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	NEST生物技术有限公司	211031	细胞培养
等离子清洁剂	嘉润万风科技有限公司	PC-6D	微流控芯片
可编程压力控制系统	精灵	OB1 MK4	流量控制
硅胶管	南京润泽流体控制设备有限公司	96410	1毫米×3毫米
SU-8主模具	博鳌生物集团有限公司	无	微流控芯片
阀门控制器	精灵	多路混音器线 V3	流量控制