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一种用于研究多孔介质中微生物介导金属氧化物沉淀的微流控平台

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DOI：

10.3791/71047

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2026年6月12日

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

本文内容

摘要

本方案介绍了一种用于研究微生物介导的锰氧化物矿物沉淀的微流控系统。生物矿化过程的形成通过测量 原位 通过光学显微镜和图像分析. 该方法可适用于研究其他具有明显颜色的生物矿物在多孔环境中的沉淀过程。

摘要

微生物通常在土壤、沉积物及其他环境相关的多孔介质中沉淀金属氧化物纳米颗粒。然而，在物理结构复杂的环境中，锰（Mn）和铁（Fe）氧化物的形成过程及其反应活性仍缺乏充分表征。尽管实验室系统可将多孔介质作为基质使用，但通常需要进行破坏性取样，难以直接适用于孔隙尺度的分析。因此，针对动态且难以接近的多孔介质，亟需具备解析微生物介导矿物沉淀过程的能力。 原位 并实时进行。为弥补这一空白，开发了一种微流控平台，用于在模型孔隙空间中评估微生物介导的金属氧化物沉淀。该平台利用锰氧化细菌进行验证 Pseudomonas putida GB-1. 在连续流动条件下，通过延时彩色明场显微镜观察生物膜的发育及其相关的二氧化锰沉淀过程。随后结合图像差分算法与终点质量测量，估算二氧化锰沉淀速率。该方法为系统检验微生物介导的金属氧化物沉淀如何响应物理化学条件变化提供了工具。

引言

金属氧化物矿物在生物地球化学循环中起着关键作用1。在近中性pH条件下，锰（Mn）和铁（Fe）氧化物带负电荷，易于吸附阳离子金属2,3,4,5,6,7,8，从而调控根际和潜流带中微量元素的有效性及污染物的迁移性。这些矿物还影响有机质的稳定性与降解过程9,10,11,12，决定植物和土壤微生物对碳的吸收。在工程系统（如水处理滤池、人工湿地）中，常直接利用金属氧化物的沉淀作用去除Mn或Fe，并修复共存污染物13,14,15,16,17。这些金属氧化物可通过其特有的颜色进行识别，颜色范围从赭色、深棕色到黑色不等18,19。

在被称为生物矿化的过程中，微生物通常促进金属氧化物的沉淀20,21,22。许多氧化锰细菌和真菌在有氧条件下合成多铜氧化酶和过氧化物酶，催化电子从Mn(II)向Mn(III)和Mn(IV)转移，从而沉淀出类似钡镁锰矿的Mn(III, IV)氧化物矿物2,23,24。此外，多种氧化铁细菌可在中性或酸性且氧气受限的环境中通过酶促反应将Fe(II)氧化为Fe(III)，生成包括水铁矿和磁铁矿在内的Fe(II, III)（氧氢）氧化物25,26,27,28。这些生物成因矿物在细胞表面附近沉淀，并在胞外聚合物、鞘层及其他细胞结构上积累，形成微生物-矿物复合体2,23,25,27,29,30。

尽管锰（Mn）和铁（Fe）的生物矿化在复杂环境中普遍存在，但在孔隙尺度上的认识仍然不足。孔隙空间具有结构异质性，表现出优先流路径和非均匀的反应物传输，从而决定了地球化学反应的分布31,32,33,34,35。此外，微生物活动可能产生局部地球化学梯度，促进或限制生物矿化过程；而孔隙流体化学性质（如pH、溶解氧、氧化还原电位）的波动可能增强矿物沉淀或促进其溶解34,35。目前对Mn和Fe生物矿化的研究通常依赖于充分混合的批式反应条件30,36,37,38,39,40或柱实验41,42,43,44来量化氧化动力学或表征生物矿物沉淀物。然而，批式实验缺乏多孔体系固有的空间异质性。填充颗粒介质的柱系统虽提供了相关的物理结构，但其应用受限，因为需要在静态时间点进行破坏性取样，这会中断实验进程，无法实现对孔隙尺度过程的无扰动观测。因此，亟需新的实验方法来研究多孔介质中微生物介导的金属氧化物沉淀过程。

微流控系统是研究生物地球化学反应的工具 原位 并可实时监测。微流控反应器能够快速、低成本地制备，具有可重复且可定制的几何结构，可模拟天然或多孔介质的理想化结构45所得装置具有光学透明性，便于对孔隙尺度过程（包括生物膜形成）进行无损观察和定量分析46,47,48,49热点开发50,51，非生物金属沉淀52,53，以及方解石生物矿化34,54,55,56此外，微流控系统允许用户控制并系统性地改变边界条件，包括金属浓度、溶解氧的有无以及流体流速。最后，根据反应器基底材料的不同，可利用X射线、拉曼或红外光谱直接测量微生物-矿物-流体相互作用57基于微流控技术的微生物金属氧化物沉淀研究平台的开发 从而为研究多孔环境中驱动碳、营养物和污染物循环的锰或铁矿物相的形成与反应活性提供了新的研究途径。

本研究以锰的生物矿化为案例，定量研究在动态多孔环境中微生物介导的金属 氧化物沉淀过程。以下实验方案展示了如何制备微流控反应器并接种模式细菌 Pseudomonas putida GB-1，该菌株在生长静止期可将 Mn(II) 氧化为 Mn(III, IV)58,59。利用基于压力的流体控制系统，依次注入富含营养的培养基和最低盐溶液，以分别促进生物膜形成和诱导锰氧化物沉淀。以固定时间间隔采集微流控孔隙空间的高分辨率彩色明场图像，记录 P. putida GB-1 生物膜与积累的锰氧化物之间的颜色对比。每次实验结束后，将反应器内全部锰氧化物进行消解，并采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定其总质量。通过将终点质量测量结果与图像相减算法相结合，可估算锰氧化物沉淀速率随时间的变化。该工作流程可便捷地适用于在多种环境条件下研究其他微生物或金属氧化物沉淀过程。

方案

注意： 本方案基于用户具备一定的背景知识和仪器设备条件。首先，用户应能够进入洁净室，并熟悉用于制备微流控模具的光刻工艺，或购买商用模具。其次，用户应掌握基本的微生物学方法，例如无菌操作技术、储备液的配制以及平板划线。此外，用户还需能够使用高压灭菌器、微量离心机、摇床培养箱和质谱仪。最后，用户应熟练掌握光学显微镜操作及图像分析技术。

1. 微流控反应器的制备与组装

注意：本方案中使用的微流控反应器采用 AutoCAD 设计，其砂粒几何结构参考自 Wang 等人55。每个模具可制备六个重复通道，孔隙空间为 15 mm × 10 mm，孔隙率为 0.41，孔隙体积为 2.3 µL。除等离子体处理外，反应器均在层流柜中制备，以保持低粉尘环境。

  1. 使用软光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中铸造微流控通道。
    1. 在塑料杯中，按10:1的比例称取弹性体基质和固化剂（此处分别为25 g和2.5 g）。
    2. 使用塑料刀将弹性体基质和固化剂充分混合10分钟。
    3. 将装有PDMS的杯子置于真空干燥器中脱气1小时，以去除气泡。
    4. 将PDMS倒入模具中，并再次脱气30分钟，以去除任何残留空气。
    5. 将模具置于加热板上，在95 °C条件下固化3小时。
    6. 固化完成后冷却，使用手术刀将PDMS切下并从模具上剥离。
    7. 在切割垫上用剃刀刀片将六个微流控通道彼此分离，每个通道边缘保留2–3 mm；使用活检打孔器在每个通道上打出进样口和出样口孔。
    8. 用透明胶带覆盖每个微流控通道的两侧，防止灰尘积聚，并将其存放在100 mm培养皿中。
  2. 实验前一天，使用空气等离子体组装最终的微流控反应器。
    1. 从一个微流控通道上去除透明胶带，然后用70%乙醇冲洗PDMS和玻璃盖玻片，并用压缩氮气吹干。
      ​警告：乙醇易燃。操作和储存时应遵循安全数据表说明。
    2. 将微流控通道和盖玻片正面朝上放入等离子清洗仪中。抽真空1分钟，然后施加等离子体1分钟（功率18 W，压力约0.5 torr）。
    3. 从等离子清洗仪中取出微流控通道和盖玻片，将盖玻片贴合到PDMS表面，轻轻按压以确保键合牢固。将组装好的反应器在100 mm培养皿中存放过夜。

2. 微流控流动控制系统

注意： 使用Elveflow的模块化系统，以实现顺序流体注入，并最大程度减少对压力和流速的干扰。系统组件包括空气压缩机、流量控制器、分配阀、流量传感器、流体储液架（适用于15 mL圆锥管）以及Elveflow智能界面（ESI）软件（图1）。也可使用其他流体控制系统，例如注射泵，其可在推注或抽吸模式下运行，为每种进样溶液配备专用的注射器或储液器，并通过低死体积分流阀实现通过单根管路进行顺序流体注入。然而，使用注射泵时需格外注意，以尽量减少可能使生物膜脱落的压力波动。

色谱系统示意图；DNA分离实验装置；包含分析路径和检测器。
图1：流体控制系统与微流控反应器结构。 实验系统由一个流体控制器（1）通过气动管路（2）连接至液体储液架（3），分布阀用于依次注入培养基（GMMn）和盐溶液（SSMn）（4），流量传感器（5）连接至流体控制器，以提供实时反馈和流量调节（6），内径较小的PEEK管路用于提供流体阻力（7），气泡捕集器（8）位于微流控反应器（9）上游。系统示意图未按比例绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 根据制造商的说明设置并校准所有硬件。
    注意：流体储液架、分配阀和流量传感器安装在一个定制的显微镜培养箱内，以维持实验温度为 30 °C。
  2. 将空气压缩机的压力调节器设置为 3 bar，并使用气动聚氨酯管将空气压缩机出口连接到流量控制器的入口。
  3. 在流量控制器出口端安装一个疏水性滤器，以防止液体回流，然后使用歧管和带倒刺接头，通过气动聚醚聚氨酯管将流量控制器连接至流体储液架的两个进样口。
  4. 使用外径为 1/16 英寸的无法兰接头连接流体储液架、分配阀和流量传感器，除非另有说明，具体连接方式如下：
    1. 使用 80 cm 长、内径为 1/32 英寸的聚四氟乙烯（PTFE）管，将流体储液架的两个出样口连接至分配阀的前两个进样口。
    2. 使用 15 cm 长、内径为 500 µm 的 PTFE 管和一个转接接头，将分配阀的出样口连接至流量传感器的进样口。
    3. 使用转接接头，在流量传感器的出样口连接一段 60 cm 长、内径为 63.5 µm 的聚醚醚酮（PEEK）管。
      注意：对于需要不同流速的实验，可根据需要调整 PEEK 管的长度，以提供足够的流体阻力，确保流速稳定。
    4. 使用直通接头将 PEEK 管与一段 10 cm 长、内径为 500 µm 的 PTFE 管连接。
    5. 将 PTFE 管连接至配备有 PTFE 膜滤器（孔径约 10 µm）的微流控气泡捕集器的进样口。
    6. 在气泡捕集器的出样口连接一段 75 cm 长、内径为 200 µm 的 PTFE 管，以产生背压，有效去除气泡。该管将连接至微流控反应器的进样孔。
  5. 每次实验前，将所有连接好的管路和硬件组件用 1% 次氯酸钠溶液冲洗系统体积三倍的量（在 7.0 µL·min-1 流速下，每根管路约需 4 小时），随后用无菌超纯水以相同时间冲洗，对流控系统进行灭菌。
  6. 实验之间，按以下步骤清洁流控系统：
    1. 通过冲洗 100% 异丙醇和无菌超纯水，清洗分配阀和流量传感器，以防止残留物或沉淀物积聚。
      ​警告：异丙醇易燃。操作和储存时应遵循安全数据表中的规定。
    2. 对气泡捕集器进行高压灭菌。
    3. 每次实验后更换气泡捕集器的膜滤器和内径为 200 µm 的 PTFE 管，以防止滤膜堵塞或管路内细菌定植。

3. 实验培养基与溶液

  1. 通过在121 °C下高压灭菌2.5% LB粉末（LB液体培养基，Miller配方）溶于超纯水中20分钟来制备液体Luria Broth（LB）培养基。对于LB琼脂平板，将2.5% LB粉末和1.5%琼脂溶于超纯水中，在121 °C下高压灭菌20分钟，然后倒入100 mm的培养皿中（每皿约20 mL），冷却至凝固。
  2. 使用美国化学会（ACS）级或细菌学级试剂在超纯水中配制并经滤膜除菌的储备液，分别制备以下每种溶液各30 mL。盐溶液和生长培养基的组成参考Gehin等人的方法59。
    1. 制备不含Mn(II)的盐溶液（SS0）：0.4 mM CaCl2·2H2O、0.25 mM MgSO4·7H2O、0.25 mM Na2HPO4·2H2O、0.15 mM KH2PO4、1:2 Fe(III)-EDTA（20 µM FeCl3·6H2O和40 µM EDTA，用1 M NaOH调节至pH 6.5）、10 mM HEPES缓冲液（用1 M NaOH调节至pH 7.0）、5 mM (NH4)2SO4，以及微量元素（40 nM CuSO4·5H2O、273 nM ZnSO4·7H2O、84 nM CoCl2·6H2O、53.7 nM Na2MoO4·2H2O），溶于无菌超纯水中。
    2. 制备含Mn(II)的盐溶液（SSMn）：与SS0相同，加入50 µM MnCl2·4H2O。
    3. 制备不含Mn(II)的生长培养基（GM0）：与SS0相同，加入1.5 g·L-1酵母提取物和1.5 g·L-1酪蛋白氨基酸。
    4. 制备含Mn(II)的生长培养基（GMMn）：与GM0相同，加入50 µM MnCl2·4H2O。
      ​警告：盐溶液和生长培养基含有对健康和环境均有危害的金属。请根据安全数据表进行操作和储存。
  3. 在超纯水中配制含40 mM草酸二水合物和2%硝酸的酸溶液，用于微流控反应器内Mn氧化物的消解。
    ​警告：草酸二水合物和硝酸具有腐蚀性，硝酸为强氧化剂。请根据安全数据表进行操作和储存。
  4. 在超纯水中配制1%硝酸溶液，用于ICP-MS样品稀释。

4. 细菌培养

注意： 细菌培养需在台面上使用本生灯，采用无菌技术操作。除非另有说明，所有材料均为无菌。培养时间针对P. putida GB-1设定，其他微生物可能需要调整培养时间。

  1. 从 -80 °C 保存的菌种中，将 P. putida GB-1 划线接种至 LB 琼脂平板上。在 30 °C 下培养约 20 小时，以促进细菌菌落生长。
  2. 实验前一晚，在 50 mL 锥形管中加入 10 mL LB 培养基，并接种一个平板菌落。将该预培养物置于摇床培养箱中，在 30 °C、180 rpm 条件下振荡培养 16 小时，使其进入稳定期。
  3. 培养 16 小时后，取 1 mL LB 预培养液至 1.5 mL 微量离心管中，在 8,000 × g 条件下离心 1 分钟，使细菌沉淀。
  4. 为去除耗尽的 LB 培养基，将沉淀洗涤三次：每次弃去上清液，用 1 mL SS0 重悬菌体沉淀，并在 8,000 × g 条件下离心 1 分钟。最后一次将菌体沉淀重悬于 1 mL SS0 中。
  5. 使用非无菌比色皿，通过细胞密度计测定洗涤后菌悬液的光密度（OD600）。此步骤中 P. putida GB-1 的预期 OD600 值为 3.6–3.8，因此至少需用 SS0 稀释 5 倍以上。
  6. 在 50 mL 三角烧瓶中，将洗涤后的菌悬液接种至 20 mL GM0 培养基中，初始 OD600 调整为 0.01。在 30 °C、180 rpm 条件下培养 6 小时，使菌液达到对数中期。

5. 生物矿化实验

  1. 实验当天早晨，启动流量控制系统。
    1. 将显微镜培养箱预热至 30 °C。
    2. 将 10 mL 的 GMMn 和 SSMn 分别倒入两个 15-mL 的锥形管中，并将锥形管连接至流体储液架。先用 SSMn 冲洗系统约三倍系统体积（约 4 小时，流速 7.0 µL·min-1），随后用相同时间冲洗 GMMn。
  2. 在接种对数中期培养物 5 小时后，使制备好的微流控反应器达到饱和状态。
    注意：反应器的饱和与接种操作均在台面上使用本生灯以无菌技术进行。除非另有说明，所有材料均为无菌状态。
    1. 将反应器置于真空干燥器中脱气 20 分钟。
    2. 在反应器脱气的同时，用 3-mL 塑料注射器吸取 1–2 mL 的 SS0，然后连接钝头针和 20 cm 长、内径为 0.02 英寸的 Tygon 管。推动注射器活塞，直至管路完全充满液体。
    3. 将反应器从干燥器中取出，使用斜头镊子将管路连接至反应器出口孔，并手动用注射器向反应器内注入液体，直至反应器入口孔处形成液滴。
    4. 将一段 20 cm 长、内径为 0.02 英寸的 Tygon 管连接至反应器入口孔。继续向反应器中注入 SSMn ，直至所有气泡被完全排出（200–300 µL）。
  3. 制备反应器接种液并接种微流控反应器。
    1. 接种 6 小时后，从摇床培养箱中取出对数中期培养物，测定 OD600。此步骤的预期 OD600 为 1.6–1.8，因此建议在 SS0 中进行 4 倍稀释。
    2. 在 2-mL 微离心管中，将对数中期培养物用 2 mL SSMn 稀释至初始 OD600 为 0.005。反复倒置混匀数次。
    3. 将反应器入口管插入微离心管中，确保液体液滴与接种液接触，以防止空气进入管路。将微离心管部分关闭，并用胶带固定管盖以防止污染。
    4. 用 5-mL 玻璃气密注射器吸取 4–5 mL SSMn 润洗注射器内壁，然后排出液体至注射器内剩余 0.5 mL。将该注射器装入注射泵中。
    5. 从塑料注射器上取下针头，并将其连接至玻璃注射器，注意避免在针头接口处截留空气。
    6. 通过注射泵以 8.33 µL·min-1 的流速反向吸入接种液进入反应器，持续 20 分钟（约 70 个孔体积）。
    7. 接种完成后，关闭注射泵，使细菌在无流动条件下沉降并附着 1 小时。
    8. 1 小时后，从注射泵上取下注射器，但仍保持其与出口管路的连接。
  4. 将已接种的微流控反应器连接至流量控制系统。
    1. 将反应器和注射器从台面转移至显微镜培养箱中。
    2. 在显微镜载物台上，将入口管从反应器上取下。
    3. 轻轻推动注射器活塞，在反应器入口孔处形成液滴。
    4. 手动将来自流量控制系统的 PTFE 管末端弯曲成直角（距末端约 1 cm），使其垂直接触 PDMS 表面，以最小化对反应器入口孔的横向作用力和空气侵入。
    5. 将 PTFE 管末端浸入 1% 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）溶液中，以润湿其疏水性外表面。确保 PTFE 管末端带有 GMMn 液滴，然后将管路连接至反应器入口孔。
    6. 断开注射器连接，并将出口管插入一个非无菌的 5-mL 微离心管中，用于收集反应器流出液。
    7. 在流量控制系统软件中设置流速为 1.33 µL·min-1。设定程序：先供给 GMMn 15 小时（约 500 个孔体积）以促进生物膜形成，随后供给 SSMn 28.5 小时（约 1,000 个孔体积）以诱导 Mn 生物矿化。
  5. 将微流控反应器安装至显微镜载物台插件中。
    注意：显微镜载物台插件上配备了一个定制的紫外-C（UVC）辐照系统，用于抑制微流控孔隙空间外的非预期细菌生长和矿物沉淀（图 2）。该设计改编自 Ramos 等人60，可通过自动化程序控制。详见 Fadely 等人61。
    1. 在反应器下方放置样品支架以增强稳定性，然后将支架和反应器牢固地安装在载物台插件中，确保其完全固定不动。
    2. 用胶带将 PTFE 管固定在载物台插件上，防止其从反应器入口孔脱落。
    3. 调节 UVC 臂的位置，使其与入口侧孔隙边缘的距离为 3 mm，出口侧为 2 mm，以最小化紫外光散射并减少对孔隙内生物膜的损伤。
      注意：正确的 UVC 对准则可使反应器入口区域几乎不产生生物量积累（图 3A）。若 UVC 臂距离孔隙入口边缘过远（图 3B）或未进行辐照（图 3C），则会导致孔隙上游发生矿物沉淀。
    4. 设置反应器辐照程序：在 t = 0 h 时，对反应器的入口和出口区域处理 5 分钟，以灭活接种过程中沉积的细菌；随后在 t = 17.5 h 时，仅对出口区域处理 5 分钟，以灭活任何残留的生物膜。

显示组件装配的机械结构示意图，突出结构设计与工程分析。
图 2：用于微流控反应器的定制紫外-C（UVC）辐照系统。（A）安装在显微镜载物台插件上的系统俯视图，显示带有可调节臂（蓝色）的结构，可调节臂上装有紫外-C发光二极管（LED）阵列（黄色矩形），以及安装在样品架上的微流控反应器（小灰色矩形）。（B）系统底视图，显示嵌入在可调节臂中的紫外-C LED（浅褐色方块）。请点击此处查看此图的放大版本。

显示微通道内流体流动模式的微流控实验，系列A-C，显微镜图像。
图3：UVC辐照对微流控反应器入口区域的影响。（A）在t = 0 h时进行5分钟UVC处理的反应器入口区域，显示正确对准，可完全去除不需要的生物膜。（B）UVC阵列对准不当的反应器入口区域，导致进样孔及孔隙空间外部残留生物膜，从而使锰氧化物在上游沉淀。（C）未进行UVC处理的反应器入口区域，导致大量生物膜生长和矿物沉淀。灰色阴影表示孔隙空间。比例尺为2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 光学延时显微镜

注意：使用配备数码相机（每个视野 2304 x 2304 像素）、白光光源、4 倍物镜（1.62 µm·pixel-1）和 NIS Elements 软件的尼康 Ti2 Eclipse 倒置落射荧光显微镜进行彩色明场成像。其他能够进行彩色成像的光学显微镜也同样适用。采用彩色成像可提高对低质量锰氧化物的检测灵敏度。若无法实现延时自动成像，用户可手动采集图像，并将其作为时间序列进行后期处理。

  1. 为获得高质量图像，请执行以下对齐和校正步骤：
    1. 为确保照明均匀，根据制造商说明手动调整科勒照明（Köhler alignment）。
    2. 优化明场照明，防止图像曝光不足或过饱和（Fusion Pad > Color > Auto Brightness 和 Fusion Pad > Color > Auto White）。
      注意：最好在已形成生物膜和二氧化锰的反应器上仅优化一次明场照明，然后在后续所有实验中使用相同的曝光时间和色彩平衡，以确保照明条件一致。此处使用5 ms的照明时间，红色为97.58%，绿色为44.76%，蓝色为100%。
    3. 为防止在获取微流控孔隙空间拼接图像时出现拼贴伪影，请应用阴影校正（Acquire > Shading Correction Panel）。
  2. 设置拼接图像的中心坐标（ND Acquisition > XY）。
  3. 设置拼接图像的扫描区域（此处为5 × 4个视野），并设置1%的重叠区域（ND Acquisition > Large Image）。
  4. 设置使用4倍物镜采集彩色明场图像（ND Acquisition > λ）。
  5. 设置图像采集频率，在15小时内每1小时采集一次（生长期），在28.5小时内每0.5小时采集一次（矿化期）（ND Acquisition > Time），然后运行延时成像程序。
    注意：生长期和矿化期的持续时间针对P. putida GB-1设定，可根据其他微生物的需要进行调整。
  6. 实验完成后，将图像导出为标记图像文件格式（TIFF）（Macro Panel > 导出图像为TIFF格式）。

7. 酸消化及锰元素质量测定

注意： 可使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定微流控反应器中保留的锰质量，但其他仪器（如电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES））也可接受。若无分析仪器，可将酸消解后的样品送至商业实验室进行分析。

  1. 实验结束时，将反应器从显微镜载物台插件中取出，并断开进样和出样管路。
  2. 用一支5 mL玻璃气密注射器（与接种用注射器分开）吸取1.5 mL酸溶液。将钝头针和一段20 cm长、内径为1/32英寸的PTFE管连接到注射器上，手动缓慢排出酸液，直至管末端形成一滴酸液。
  3. 在实验台面上，将注射器装入注射泵，并将管路连接至反应器的进样孔，注意避免引入气泡，否则可能阻碍酸溶液渗透所有孔隙。将一段30 cm长、内径为1/32英寸的PTFE管连接至反应器的出样孔，并将出样管末端插入一个2 mL微量离心管中。
  4. 以100 µL·min-1的流速向反应器中注入酸溶液，持续10分钟。
  5. 酸溶液注入完成后，将钝头针从玻璃注射器上拆下。用一个10 mL塑料注射器吸入空气，并连接至钝头针，然后手动完全排出注射器中的空气，以将反应器和管路中残留的酸液排入2 mL微量离心管中。
    注意：尽管注入空气后可能仍有少量酸溶液滞留在孔隙中，但其体积相对于总注入量可忽略不计。对于使用低孔隙度结构的用户，可考虑通入更多体积的空气，以清除流体膜和 poorly connected 孔隙中的残余酸液。
  6. 根据ICP-MS校准范围，用1%硝酸对消化后的样品进行稀释。此处，在15 mL锥形管中配制100倍稀释液（总体积5 mL）。
  7. 使用ICP-MS测定稀释样品中的Mn浓度。根据稀释倍数和样品总体积对测得的浓度进行校正，以确定保留在反应器中的Mn质量。

8. 图像分析

注意：推荐使用 MATLAB，因其内置了图像分析函数，且这些函数已在文中列出。然而，也可使用其他工具（如 ImageJ 或 Python 的图像分析库）进行类似的分析。关键的图像分析步骤见图4。所有图像分析脚本均作为补充文件提供（补充文件1、补充文件2 和 补充文件3）。

延时显微成像过程、明场显微镜设置、图像掩膜分析示意图。
图 4：图像相减工作流程，用于分离 Mn 氧化物沉淀物。 从延时彩色明场图像中，选取一个参考图像（tref）（1），以去除所有后续时间点图像（tn）（2）中底层静态相生物膜的强度。生成所有 tn 的二值掩膜（3），并分别与 tref（4）和对应的 tn（5）相乘，以捕获生物膜-生物矿物的范围。最后，将掩膜处理后的 tn 从掩膜处理后的 tref 中减去（6）。所得强度校正矩阵量化了每个像素处由于 Mn 氧化物积累导致的强度降低（a.u.）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将微流控孔隙空间几何结构的高分辨率TIFF图像（从AutoCAD导出）载入工作区，用作颗粒掩模 （imread）.
  2. 校正并配准彩色明场图像，以有效应用颗粒掩膜。
    1. 生成第一个时间点图像（t = 0 h）的配准二值图像。
      1. 将彩色明场TIFF图像载入工作区（imread).
      2. 裁剪图像，使其略大于孔隙空间的尺寸（imcrop).
      3. 锐化图像以提高晶界分辨率（imsharpen).
      4. 使用优先突出暗部特征的自适应阈值对图像进行二值化处理（rgb2gray, 自适应阈值 前景极性设为“暗”，并根据需要调整灵敏度， 二值化, 补体).
      5. 填充最终配准二值图像中的颗粒，以形成实心特征（imfill （指定“孔洞”）。请注意，并非所有颗粒都会被填满。
      6. 根据需要腐蚀注册二值图像以去除背景噪声，然后进行膨胀以恢复晶粒边缘丢失的像素imerode, imdilate).
    2. 使用尺度不变特征变换（SIFT）配准算法，计算将配准二值图像与晶粒掩膜对齐所需的空间变换矩阵detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d 变换类型为“仿射”（affine）。
    3. 将该变换矩阵应用于配准二值图像和第一个时间点的图像，然后将其与颗粒掩膜叠加以评估匹配度（imwarp，imshowpair).
    4. 如果在SIFT配准后仍存在配准不良的情况，可根据需要应用局部配准（cpselect, fitgeotform2d 变换类型为“lwm” imwarp).
    5. 根据需要裁剪已配准的图像和晶粒掩膜，以去除基质边缘的配准伪影，然后调整大小至孔隙空间尺寸（15 mm × 10 mm）imcrop, imresize).
    6. 遍历所有彩色明场图像以应用相同的配准imwarp).
  3. 目视识别参考图像（t参考文献，图1中  图4生物膜首次进入稳定期时（以持续运动或生长的停止为判断依据，此处 t = 18.5 h）。
  4. 对每个时间点的图像（tn，第2组面板 图4) (rgb2gray, 自适应阈值 前景极性设为“暗”，并根据需要调整灵敏度， 二值化, 补体）使得生物膜-生物矿物集合体 = 1，而颗粒和空孔隙 = 0。将每个时间点的掩膜乘以反转后的颗粒掩膜（imcomplement) 以去除残留的晶界。
  5. 倍增 tn 与其对应的时间点掩膜（图3中的面板） 图4）以分离出目标生物膜-生物矿化区域（图5中的面板5） 图4)，然后乘以 t参考文献 通过每个时间点的掩膜来分离相同区域（图4中的面板） 图4).
  6. 减去所有掩膜的 tn 来自遮蔽的 t参考文献 用于量化每个时间点与 Mn 氧化物积累相关的像素强度下降程度（imsubtract），然后转换为强度校正的复合矩阵（rgb2gray，第6组 图4).
  7. 为评估矿物在孔隙空间中的空间分布（a.u.），沿列求和（总和 每个强度校正后矩阵的维度 = 1。
  8. 为了估算随时间变化的 Mn 氧化物沉淀速率（µg·h⁻¹）-1):
    1. 对每个强度校正后的矩阵求和总和 使用 dimension = "all" 来量化每个时间点的总校正强度。
    2. 将每个时间点的总校正强度除以最终时间点的总校正强度，使得最终时间点的值为1，之前所有时间点的值均为小于1的小数。通过乘以ICP-MS测得的Mn质量（以µg为单位），将结果重新换算为µg。
    3. 对连续时间点之间的质量增加量（µg）除以时间间隔，求其对时间的导数差异) 除以图像间的时间间隔（0.5 h）。

结果

本方案提供了一个用于时空分辨成像生物膜形成及锰生物矿化过程的实验平台。彩色明场图像显示，在锰氧化物沉淀开始前的 t = 18.5 h 时，P. putida GB-1 生物膜在整个微流控孔隙空间中均匀分布（图 5A）。随后，锰氧化物优先在靠近进水 Mn(II) 源的孔隙入口侧积累（图 5B）。参考图像与后续时间点图像之间的差异揭示了锰氧化物沉淀物对整体图像强度的独立贡献（图 5C），并实现了对反应器尺度上矿物积累梯度的定量分析（图 5D）。在生物膜尺度上，该图像相减方法捕捉到了锰氧化物在生物膜表面逐渐沉淀以及矿物在与孔隙液接触的生物膜边缘处积累的过程（图 6）。

该方案进一步提供了一种通过图像相减与ICP-MS测量来估算Mn氧化物沉淀动力学的工作流程。在最终实验时间点，三个平行的微流控反应器中含有4.29 ± 0.22 µg的Mn。此前已通过基于同步辐射的Mn氧化物质量测量验证了反应器内容物的酸消解方法，结果显示误差小于18%61。因此，对强度校正后的矩阵数据按此最终质量进行了重缩放。所得到的Mn氧化物沉淀速率估算值呈非单调变化，在t = 19.5 h至t = 21 h期间迅速上升，于0.29 ± 0.04 µg·h-1处达到峰值，随后逐渐减缓，直至t = 43.5 h（图7）。需要注意的是，该速率计算未考虑光学显微镜分辨率以下的纳米级Mn氧化物颗粒，也未计入实验持续过程中因迁移而损失的氧化物质量，但预计此类损失极小。因此，该方法利用易于获取的显微技术，对生物矿化动力学的时间趋势进行半定量评估。

土壤孔隙度分析：显微图像、像素强度映射、强度与距离关系图。
图 5：反应器尺度上生物膜与锰氧化物的分布。（A）在静止期初期（t = 18.5 h，tref），微流控孔隙空间内 P. putida GB-1 生物膜的彩色明场图像。（B）在实验终点（t = 43.5 h），P. putida GB-1 生物膜表面及周围形成的锰氧化物沉淀的彩色明场图像。（C）实验终点（t = 43.5 h）经强度校正后的矿物积累矩阵图，其中颗粒显示为灰色，孔隙显示为白色。比例尺为 1 mm。（D）从孔隙空间入口（左侧）到出口（右侧）的总校正强度的一维空间分布（t = 43.5 h）。实线表示在三个重复实验中，沿流动方向（从入口到出口）每 1 mm 滑动平均所得的平均值，阴影区域表示标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

随时间推移的细胞生长；多个时间点的显微镜图像及增强对比分析。
图6：生物膜尺度的锰氧化物积累。（A）代表性P. putida GB-1生物膜的选彩色明场图像。锰氧化物最初表现为生物膜表面颜色由灰色变为棕色（显示于t = 20 h和t = 21 h），随后表现为生物膜边缘深棕色沉淀物的积累（显示于t = 33 h和t = 43 h）。（B）经强度校正的矿物积累矩阵图，其中颗粒呈深灰色，孔隙呈白色，底层生物膜呈浅灰色。比例尺为150 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

沉淀速率随时间变化的曲线图；反应动力学和速率波动的数据分析。
图 7：随时间推移的 Mn 氧化物沉淀速率估算。 速率（µg·h-1）通过将每个时间点的总校正强度重新缩放至使用 ICP-MS 测量的终点 Mn 质量，然后对时间求导数来量化。数据点表示三次重复实验的平均值，阴影区域表示标准偏差。请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件 1：Step1_ImageRegistration.m。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：Step2_ImageSubtraction.m。请点击此处下载该文件。

补充文件 3：Step3_Figures.m。请点击此处下载该文件。

讨论

该实验平台为研究多孔环境中生物地球化学过程的时空动态提供了独特的机会，且可避免因人为假象而影响高保真数据的获取。该方法特别适用于锰和铁的生物矿化研究，因为这些过程会生成具有特征性赭色、棕色和黑色的矿物沉淀物，可通过光学显微镜和图像分析技术轻松进行分割识别。以锰的生物矿化为例进行案例研究，可有效评估矿物沉淀的模式与速率 原位 具有高空间和时间分辨率。

本方案的多个方面使得生物地球化学转化过程的可重复测量得以实现。首先，采用死体积较小的顺序注射阀，可在不干扰微流控孔隙空间内生物膜的情况下，实现多种流体的实验操作。该装置通过防止在切换注入流体时产生压力突增，避免了生物膜的剥落或位移（此类现象在使用注射泵等其他仪器时可能发生），从而保持了初始生物膜的空间分布。此外，该系统还为使用者提供了灵活调节施加于原位微生物的地球化学条件的能力。最后，由于该装置能够保持初始生物膜分布不变，使用者可系统地检验不同生物膜形态或生物量大小对二氧化锰氧化物沉淀分布与沉淀速率的影响。

其次，通过减少微流控孔隙空间中气泡的形成和侵入，实现了持续多天的实验，从而捕捉到与环境相关的锰生物矿化时间尺度。气泡是长时间实验中常见且往往不可避免的问题，尤其在高于室温的条件下62,63，气泡会分割或堵塞单个孔隙、改变流体流动路径，并干扰反应进程。为防止气泡在孔隙中滞留，反应器在接种前已完全饱和。为最大限度减少通过流动控制系统引入的气泡，显微镜培养箱在实验开始前已提前设定至30 °C，并在连接接种后的反应器之前，预先用多倍体积的进样溶液冲洗系统。该步骤可清除管路和接头中滞留的空气，降低实验过程中液体脱气的风险。此外，在流动控制系统中集成了一个气泡捕集装置，并在捕集器出口连接一段内径为200 µm的PTFE管，以增加流动阻力，提高气泡去除效率。最后，为防止进样管路与反应器入口孔之间的界面处滞留或泄漏空气，所有连接操作均在管路两端及打孔处滴加液滴后进行；疏水性的PTFE管表面涂覆1% PEG-DA，且在整个实验过程中始终保持插入管的末端与PDMS表面垂直。

第三，将定制的UVC辐照系统整合到实验平台中，可维持明确的地球化学边界条件，并在微流控孔隙空间内可重复地限制锰的生物矿化。初步实验表明，反应器入口区域的外来生物膜会在孔隙空间上游沉淀锰氧化物，从而限制了下游Mn(II)的可用性。在无流动沉降期结束后，对反应器的入口和出口区域进行短暂且准确定位的辐照 ，可防止最初沉积的细菌形成生物膜。持续的单向流体流动可防止该初始UVC处理后反应器入口区域的再次定植。在t = 17.5 h（即进入稳定期并出现可见的锰氧化物沉淀之前）对反应器出口区域进行辐照，可最大限度减少孔隙空间下游的矿物积累量。这有助于将明场彩色图像数据与通过ICP-MS消解并测定的锰质量进行直接比较。

图像相减与终点质量测量相结合，为评估二氧化锰沉淀动力学提供了一种半定量方法 原位 然而，需要注意的是，由于相机对深色的敏感度有限，在矿物密度非常高时，像素强度不再与 Mn 氧化物质量呈直接正比关系。61通过在特定时间点对样品进行酸消化，并将消化后的质量与按最终实验时间点缩放的原始质量进行比较，可改进对此非线性行为的评估。若需精确量化矿物质量，用户可使用已知强度和质量的矿物样品绘制校准曲线，该方法此前已在 Fadely 等人的研究中得到验证。61或使用基于同步辐射的X射线荧光进行直接测量。

本文介绍的微流控平台可用于在多种环境条件下研究生物矿化过程。尽管代表性实验已针对P. putida GB-1进行了优化，但该装置可系统性地测试多种进液溶液化学条件（如Mn或Fe浓度、碳源、共存金属的存在）、流速、温度或微生物群落的存在。通过降低进液pH值或将PDMS涂覆一层透氧性低的聚合物，可模拟特定的酸性或亚氧化条件（例如有利于铁氧化细菌生长的环境）。通过使用报告基因融合菌株并追踪其产生的光学荧光信号，可深入了解微生物对生物矿化的调控机制59,64。通过改变颗粒粒径分布、颗粒形状或孔隙率，或对PDMS进行功能化修饰以模拟黏土颗粒或天然有机质的表面电荷，可重新设计微流控反应器以模拟多种多孔环境 。通过进一步改造（例如将玻璃反应器基底替换为塑料材料），反应器可支持对金属氧化态、矿物学特征、有机-矿物结合物，以及次生金属的吸附或共沉淀过程进行直接光谱检测。最后，只要其他金属生物矿物（如磷酸盐、碳酸盐、硫化物）的光学特性足够显著以实现图像分割，该实验平台也可扩展用于研究其沉淀过程。因此，本实验方案为在相关多孔环境中全面研究生物矿化及微生物-矿物-流体相互作用提供了可行框架。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目得到了美国国家科学基金会生物介导与生物启发岩土工程研究中心（ERC-1449501）、瑞士国家科学基金会（200021_188546）以及美国国家科学基金会（MCA-2322428、EAR-1847689、DMR-2003849）的支持。部分 本研究在加州大学戴维斯分校纳米与微米研究中心进行 制造（CNM2）。我们感谢 Steven Lucero 以及加州大学戴维斯分校技术工坊（UC Davis Tech Foundry）在显微镜培养箱和UVC辐照系统的设计与制造方面提供的支持。我们还感谢王宇泽博士和 Jason DeJong 博士提供了用于微流控反应器制造的多孔介质结构，以及 Arunima 博士 感谢 Noah Goshi 博士、Gregory Girardi 博士和 Hyehyun Kim 博士在光刻和软光刻技术方面的有益讨论和/或培训指导。最后，感谢 Gaitan Gehin 博士、Tonya Kuhl 博士、Filippo Miele 博士和 Charles Graddy 博士在实验设计和图像分析方面提供的宝贵意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
适配器接头（Elveflow，6-40 转 1/4-28）达尔文微流控LVF-KFI-08用于连接流量传感器与无法兰接头。
琼脂（Fisher BioReagents）Fisher ScientificBP9744用于倾注平板以划线接种冻存菌种。
空气压缩机（Jun-Air）ElveflowKCP-110用于为流量控制器加压。
硫酸铵 ((NH4)2SO4，CAS：7783-20-2Sigma-AldrichA4915用于实验培养基和溶液的配制。
斜口镊子TDI 国际7-SA用于将管路连接至微流控反应器。
AutoCAD 软件Autodesk --用于设计微流控反应器的几何结构。
高压灭菌Steris--用于对材料和液体进行灭菌。 
天平Mettler ToledoME2002T用于称量PDMS弹性体基液与固化剂。
带倒刺接头（1/4-28 旋转式转 3/32 英寸带倒刺）ElveflowKFI-06用于连接聚醚聚氨酯管路与歧管及流体储液架。
活检打孔器（Rapid-Core，直径 1.2 mm）达尔文微流控PT-T983-12-25用于在PDMS微流控通道中打孔以形成入口/出口。 
漂白剂（Chlorox）ULINES-19719用于对流控系统进行灭菌。用超纯水稀释至1%。
钝头针（Jensen Global，21 号）QSourceJG21-10HPX-J004用于连接导管与注射器。经高压灭菌30分钟。
本生灯洪堡H-5970用于保持无菌的实验工作环境。
二水合氯化钙（CaCl₂）2·2H2O，Fisher Chemical，CAS：10035-04-8Fisher ScientificC79用于实验培养基和溶液的制备。
水解酪蛋白氨基酸（Fisher BioReagents，酸水解酪蛋白肽）Fisher ScientificBP1424用于实验培养基。
细胞密度计（WPA Biowave CO8000）Avantor490005-906用于测量 OD600 细菌培养物 
透明胶带（Scotch Magic）ULINES-10223用于防止灰尘附着在PDMS微流控通道上。
六水合氯化钴(II)（CoCl2·6H2O，CAS：7791-13-1Sigma-Aldrich255599用于实验培养基和溶液的配制。
压缩氮气AirgasNIUHP300用于干燥微流控反应器组件。
锥形管（Falcon，15 mL 容积，聚丙烯）Fisher Scientific14-959-49B用于进水溶液和ICP-MS样品。预灭菌。
锥形管（Falcon，50 mL，聚丙烯）Fisher Scientific14-432-22用于LB预培养。已预灭菌。
五水合硫酸铜(II)（CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8Sigma-AldrichC8027用于实验培养基和溶液的制备。
切割垫ULINES-18543用于切割PDMS微流控通道并打孔进样口/出样口。
比色皿（Fisherbrand，1.5 mL 容量，聚苯乙烯）Fisher Scientific 14-955-127用于测量 OD600 细菌培养物 
数码相机（Hamamatsu ORCA-Fusion）尼康77054115用于微流控实验的延时彩色明场成像。
分配阀（MUX）ElveflowMUX-D-12用于依次注入多种流体。
Elveflow Smart Interface (ESI) 软件Elveflow --用于控制流量控制器与流量传感器之间的流速/压力反馈，并执行分配阀切换。
锥形瓶（Fisherbrand，50 mL 容量）Fisher ScientificFB50050用于对数中期培养。经高压灭菌 30 分钟。
乙醇（Fisher Chemical，试剂级酒精，纯度90%，CAS: 64-17-5）Fisher ScientificA962P-4用于反应器制作过程中清洁PDMS和盖玻片。用超纯水稀释至70%。
乙二胺四乙酸（EDTA，CAS：60-00-4）Sigma-AldrichEDS用于实验培养基和溶液的制备。
无法兰接头（1/4-28，适用于1/16英寸外径管）ElveflowKFI-17用于将管路连接至Elveflow硬件组件。套件包含卡套和螺纹螺母。
流量控制器（OB1 MK3+）ElveflowOB1-2000用于为可控流体注射提供流速/压力反馈。
流量传感器（MFS2）ElveflowMFS-D-2用于通过流量控制器的压力反馈，为微流控实验维持稳定的流速。
液体储液槽架 ElveflowKPT-4S用于加压流入液体。可与15 mL Falcon离心管兼容。
玻璃盖玻片（1.42 英寸 × 2.36 英寸，#1 厚度）Ted Pella260460-100等离子体键合的PDMS微通道作为微流控反应器的基底。 
玻璃气密性注射器（5 mL 容量，鲁尔锁扣）Hamilton81520用于反应器接种和酸消化（使用不同的注射器）。接种用注射器经高压灭菌30分钟。
HEPES 缓冲液 (CAS: 7365-45-9)Sigma-AldrichH3375用于实验培养基和溶液的配制。
热板康宁6795-420D用于固化PDMS。
疏水性滤器（Elveflow，0.2-µm)达尔文微流控LVF-KXX-14用于防止液体倒流进入流量控制器。
电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，7900）安捷伦--用于测量微流控反应器消化液中的 Mn 浓度。
倒置落射荧光显微镜（Nikon Ti2 Eclipse）尼康MEA54000, MEE59925, MEL51920, MEP59394, MEC56130用于微流控实验的延时彩色明场成像。基本组件包括机身、透射光立柱、聚光镜转盘、物镜转盘和载物台。
六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O, CAS: 10025-77-1Sigma-Aldrich44944用于实验培养基和溶液的制备。
异丙醇（Fisher Chemical，100% 纯度，CAS: 67-63-0）Fisher ScientificA416P-4用于清洁流控系统。
垂直层流净化工作台（Air Science Purair FLOW Vertical，48英寸）Fisher ScientificNC0875829用于维持软光刻、反应器组装和反应器脱气过程中的低粉尘环境。 
光源引擎（LIDA）Lumencor77060081用于微流控实验的延时彩色明场成像。
Luria肉汤粉末（LB，Invitrogen，Miller配方）Fisher Scientific12-795-027用于从冻存菌种中培养 P. putida GB-1。经高压灭菌 20 分钟。
硫酸镁（MgSO₄）4 7H2O；CAS：10034-99-8Sigma-Aldrich230391用于实验培养基和溶液的配制。
四水合氯化锰(II)（MnCl2·4H2O，CAS：13446-34-9Sigma-Aldrich221279用于实验培养基和溶液的配制。
多通管ElveflowKM9用于将空气压缩机的压力分配至流体储液架。
MATLAB 软件Mathworks--用于图像分析。
微型离心机Eppendorf5418用于洗涤LB预培养物。 
微量离心管（Fisherbrand，1.5 mL 容量）Fisher Scientific02-681-5用于洗涤LB预培养物。经高压灭菌30分钟。
微量离心管（Fisherbrand，2 mL 容量）Fisher Scientific02-681-271用于制备反应器接种物。121°C高压灭菌30分钟。
微量离心管（Labcon，5 mL 容量）Sigma-AldrichLABC-3048-860-000-9用于在时间序列实验期间收集反应器流出物。
微流控气泡捕获装置（25-µL 内部体积，EZMountPreciGenomePG-BT-REC25UL用于在微流控反应器上游去除气泡。经高压灭菌30分钟以实现灭菌。
显微镜培养箱----由加州大学戴维斯分校技术工坊设计和制造。 
显微镜载物台插件（TI2-S-HU 通用支架）尼康MEC59140用于在延时实验中安装UVC辐照系统并固定微流控反应器。
NIS Elements 软件尼康--用于自动进行延时图像采集。
硝酸（Fisher Chemical，70% 纯度，CAS: 7697-37-2）Fisher ScientificA200-212用于微流控反应器中二氧化锰的酸消解及ICP-MS样品稀释。
目标（Plan Apo λD 4x/0.20)尼康MRD70040用于微流控实验的延时彩色明场成像。
草酸二水合物（CAS: 6153-56-6）Sigma-Aldrich247537用于微流控反应器中二氧化锰的酸消解。 
PEEK 管（63.5-µm ID，1/16 英寸外径IDEX1560XL用于在流体控制系统中提供流体阻力。连接至流量传感器出口。
培养皿（Fisherbrand，100 mm 直径）Fisher ScientificFB0875712用于倾注琼脂平板以及储存PDMS微流控通道/组装的微流控反应器。
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-32G, PDC-VPE, PDC-VCG用于将PDMS微流控通道键合到玻璃盖玻片上。基本装置包括清洗器、真空泵和真空计。
塑料杯ULINES-22541用于混合PDMS弹性体基液与固化剂。
塑料刀ULINES-7304B用于混合PDMS弹性体基础剂与固化剂。
塑料注射器（10 mL 容量，鲁尔锁扣）U.S. Plastic Corporation87368用于从反应器和管路中回收酸溶液。预灭菌。
塑料注射器（3 mL 容量，鲁尔锁）U.S. Plastic Corporation87366用于饱和微流控反应器。已预灭菌。
平板培养箱（VWR）Avantor97025-630用于在琼脂平板上以稳定温度培养细菌菌落。
气动聚氨酯管（内径4 mm，外径6 mm）Legris-气动系统1025U0601用于连接空气压缩机与流量控制器。
气动聚醚聚氨酯管（内径2.5 mm，外径4 mm）Legris-气动装置1025U04R08用于连接流量控制器与歧管及流体储液架。 
聚二甲基硅氧烷（PDMS，Dow Corning，Sylgard 184）埃尔斯沃思胶粘剂4019862用于通过软光刻技术制备微流控反应器。试剂盒包含弹性体基质和固化剂。
聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA，分子量 700，CAS：26570-48-9）Sigma-Aldrich455008用于将PTFE管连接至反应器入口时润湿管路。用超纯水稀释至1%，经滤膜除菌。
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4，CAS：7778-77-0Sigma-AldrichP0662用于实验培养基和溶液的配制。
用于气泡捕集的PTFE膜过滤器PreciGenomePG-BT-FLT-Q5与微流控气泡捕获装置兼容。
PTFE 管道（200-µm ID，1/16 英寸外径达尔文微流控BL-PTFE-1602-20用于连接气泡捕集器出口与微流控反应器。 
聚四氟乙烯管（500-µm ID，1/16 英寸外径达尔文微流控BL-PTFE-1605-20用于连接分配阀与流量传感器，以及 PEEK 管路与气泡捕集器入口。
PTFE 管路（Elveflow，内径 1/32 英寸，外径 1/16 英寸）达尔文微流控LVF-KTU-15用于连接液体储液架与分配阀。
剃刀刀片ULINEH-595B用于切割PDMS微流控通道。
样品框（钢制，外框：35 x 60 mm，内框：25 x 50 mm，厚度：1 mm）----由加州大学戴维斯分校技术工坊设计和制造。 
手术刀（Integra Miltex）Fisher Scientific12-460-456用于从微流控模具中切割固化的PDMS。
摇床培养箱（Excella）新不伦瑞克E24用于在恒定温度和转速下培养细菌培养物。
氢氧化钠（NaOH，1 M，CAS: 1310-73-2）Sigma-Aldrich109137用于调节 Fe-EDTA 和 HEPES 储存液的 pH 值。
二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O, CAS: 10102-40-6Sigma-Aldrich331058用于实验培养基和溶液的配制。
磷酸氢二钠二水合物（Na2HPO4·2H2O₂，Fisher Chemical，CAS：10028-24-7Fisher ScientificS472用于实验培养基和溶液的配制。
注射器滤器（Fisherbrand，PES，0.22-µm)Fisher Scientific09-720-511用于过滤除菌储存液。已预灭菌。
注射泵（New Era）注射泵NE-4002X用于反应器接种。
胶带Fisher Scientific15-953用于固定管盖和管路。
Tygon 管（Masterflex Microbore，ND-100-80，内径 0.02 英寸，外径 0.06 英寸）AvantorMFLX06419-01用于反应器接种及实验期间的出液管路。经高压灭菌30分钟。
超纯水（Milli-Q）Millipore Sigma--用于制备实验培养基/溶液及清洗流控系统。经高压灭菌 30 分钟。
紫外线-C（UVC）辐照系统----由加州大学戴维斯分校技术工坊设计和制造。 
接头（Elveflow，1/4-28 至 1/4-28）达尔文微流控LVF-KFI-10用于连接PEEK和PTFE管。 
真空干燥器（Bel Art）Fisher Scientific08-594-16C用于PDMS和反应器脱气。 
用于干燥器的真空泵（Welch DryFast）Fisher Scientific1257156用于维持干燥器内的真空压力。
酵母提取物（Fisher BioReagents）Fisher Scientific BP1422用于实验培养基。
七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）4·7H2O, CAS: 7446-20-0Sigma-Aldrich221376用于实验培养基和溶液的制备。

参考文献

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
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