小鼠卵母细胞体外成熟、受精及植入前胚胎培养

摘要

本方案描述了以下操作步骤 体外 小鼠卵母细胞的成熟， 体外 受精及随后的胚胎培养至囊胚阶段。

摘要

小鼠卵母细胞 体外 成熟，结合 体外 受精及随后的胚胎培养可在明确条件下产生着床前胚胎。这些操作有助于研究卵母细胞成熟、受精以及早期胚胎发育过程中的生物学功能与分子机制。然而，该方法的成功应用依赖于对卵母细胞和精子的精细操作、适宜的培养条件，以及对各发育阶段进程的准确评估。本文描述从小鼠卵巢中分离未成熟卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的方法， 体外 卵母细胞成熟， 体外 受精，以及 体外 将胚胎培养至囊胚阶段。这些操作包括培养基和培养皿的准备与平衡、卵巢解剖后COs的分离与筛选、精子的采集与获能、在标准化条件下进行受精，以及随后对胚胎进行培养以评估其发育情况。发育进程通过形态学标准进行评价，包括雄性和雌性原核的形成、卵裂至二细胞阶段以及囊胚的形成。本方案可整合到卵母细胞成熟及母源因子功能的研究中，为哺乳动物生殖生物学的基础研究提供有力工具。

引言

了解卵母细胞的质量和发育潜能对于成功受精及后续胚胎发育至关重要^1,2。卵母细胞成熟不仅需要在核成熟过程中精确完成染色体分离，还涉及细胞质成熟，包括细胞器的重新分布以及母源mRNA和蛋白质的积累³。早期胚胎发育依赖于母源提供的mRNA和蛋白质，卵母细胞中的这些母源物质储备可维持着床前的发育过程。然而，许多调控哺乳动物胚胎发生的母源因子的身份及其功能仍尚未完全明确⁴。因此，需要进一步开展系统性研究，以阐明卵母细胞成熟、受精以及胚胎发育的潜在机制。

小鼠是研究胚胎着床前发育的常用模型系统。体外成熟（IVM）是指从卵巢中采集未成熟卵母细胞，并在受控的实验室条件下使其成熟⁵。随后，体外受精（IVF）可使成熟卵母细胞与获能精子共孵育，以获得受精卵，用于早期胚胎发育研究。然而，与使用体内成熟卵母细胞的传统IVF相比，IVM来源的卵母细胞通常表现出较低的成熟率和受精率，以及较弱的发育潜能⁶。这些局限性主要归因于在体外培养条件下细胞核与细胞质成熟之间的不同步。此外，小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体的稳定性对IVM过程中的pH和温度变化敏感，纺锤体结构的紊乱可能导致成熟阻滞⁷。因此，IVM来源卵母细胞发育潜能的降低仍然是一个主要障碍，限制了发育机制研究中高效胚胎的制备。

小鼠植入前胚胎也可通过收集获得 体内来源的受精卵并在体外（IVC）进行培养。 体内来自输卵管的衍生合子为研究受精后事件提供了相对同步的实验起始点⁸然而，卵母细胞成熟及母源因子的积累发生在受精之前 体内；因此， 体内-来源的受精卵在评估成熟条件或母源储存物质对后续胚胎发育影响的实验操作上较难进行人为干预⁴因此，优化体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）方案，并采用具有严格质量控制的标准化操作程序（例如，严格管理温度、pH值和操作规范），对于最大限度减少与操作相关的变异并保护卵母细胞和胚胎的发育潜能至关重要。

本文介绍了一种体外成熟–体外受精–胚胎体外培养（IVM–IVF–IVC）方案，详细描述了培养基制备、卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的分离与筛选、体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）操作，以及体外胚胎培养过程（图1）。该方案包含多个实用的阶段性质控检查点，用于常规质量评估，包括第一极体（PB1）排出、雄性和雌性原核（2PN）形成、二细胞期卵裂以及囊胚形成。本方案可在明确的条件下可重复且高效地获得植入前胚胎，适用于发育生物学和生殖生物学领域的机制研究、培养条件优化以及后续实验应用。

方案

所有动物实验均经西北A大学动物护理与使用委员会批准&F 大学，中国（许可证编号：20230503）

1. 动物饲养

1. 获取野生型雌性 C57BL/6 和雄性 DBA/2 小鼠，在温度为 20–22 °C、相对湿度为 55% ± 10%、12 小时光照-黑暗循环的特定无病原体（SPF）条件下饲养。自由提供繁殖饲料和饮水ad libitum。雄性小鼠单只饲养（每笼一只雄性）。

2. 培养基的制备

1. 配制50 IU/mL的PMSG工作液：将5,000 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）溶解于100 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   注意：将溶液分装为每份1 mL的单次使用量，于–20 °C保存。使用前在室温下解冻。
2. 配制IVM培养基：将表1所列成分加入100 mL Medium 199（M199）基础培养基中。调节pH至7.3–7.4，然后通过0.22 µm滤器无菌过滤至无菌培养基瓶中。在瓶上标注“IVM”、配制者姓名缩写、配制日期和有效期，并于4 °C保存，最长可使用1个月。
3. 配制0.1%（w/v）透明质酸酶溶液：将10 mg透明质酸酶溶解于10 mL M2培养基中。
   注意：分装为每份1 mL的单次使用量，于–20 °C保存；使用前加热至37 °C。

3. 培养皿的制备（图2）

注意：根据预期的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）和胚胎数量，调整IVM、IVF和IVC液滴的数量，IVM和IVF每100 µL液滴中放置20–30个COCs，胚胎培养每100 µL液滴中放置20–30个胚胎。

1. 准备适量的35 mm卵母细胞收集培养皿，每个培养皿中加入2 mL添加了0.2 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的M2培养基。每两个雌性动物使用一个培养皿用于卵巢穿刺和COC收集，另准备一个培养皿用于洗涤COC。使用前将培养皿预热至37 °C。
2. 准备体外成熟（IVM）培养皿。
   1. 在60 mm培养皿中，制备五个100 µL的IVM培养基液滴用于洗涤（将该培养皿标记为“IVM洗涤”）。
   2. 在另一个60 mm培养皿中，制备多个100 µL的IVM培养基液滴用于卵母细胞成熟（将该培养皿标记为“IVM”）。
   3. 小心加入足够的矿物油覆盖液滴，并将培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中平衡至少2小时，然后再开始卵母细胞收集。
3. 准备体外受精（IVF）培养皿。
   1. 在60 mm培养皿中，制备一至两个300 µL的预平衡胚胎培养基液滴，用于精子释放和获能（将该培养皿标记为“精子获能”）。
      注：准备第二个获能液滴作为备用，以应对以下情况：第一个液滴中精子活力不足、需要重新采集附睾精子样本并进行获能处理，或在受精前需要调整精子浓度。
   2. 准备两个独立的60 mm培养皿，每个培养皿中包含五个100 µL的预平衡培养基液滴用于洗涤（将培养皿标记为“IVF洗涤”）。
      注：使用一个“IVF洗涤”培养皿在受精前洗涤经IVM成熟的COC，另一个“IVF洗涤”培养皿用于共孵育后洗涤假定合子，以去除卵丘细胞和残留精子。
   3. 在另一个60 mm培养皿中，制备多个100 µL的预平衡胚胎培养基液滴用于受精（将该培养皿标记为“IVF”）。
      注：预平衡的胚胎培养基同时用于精子获能和受精，以在精子处理和受精过程中保持条件一致。
   4. 小心加入足够的矿物油覆盖液滴，并将培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中平衡至少12小时，然后再开始精子获能操作。
4. 准备体外胚胎培养（IVC）培养皿。
   1. 在60 mm培养皿中，制备五个100 µL的预平衡胚胎培养基液滴用于胚胎洗涤（将该培养皿标记为“IVC洗涤”）。
   2. 在另一个60 mm培养皿中，制备多个100 µL的预平衡胚胎培养基液滴用于胚胎培养 （将该培养皿标记为“IVC”）。
   3. 小心加入足够的矿物油覆盖液滴，并将培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中平衡至少12小时，然后再开始胚胎培养。

4. 卵巢采集

1. 向8–10周龄的雌性C57BL/6小鼠腹腔注射10 IU PMSG。
2. PMSG注射后48小时，通过颈椎脱臼处死小鼠，并将其仰卧放置。用70%乙醇喷洒腹部，润湿毛发，防止毛发进入腹腔。
3. 使用精细解剖剪在下腹部做一小切口，用手套轻轻分开皮肤，暴露腹膜。
4. 切开腹膜，轻轻移开肠道。找到子宫角并沿其向卵巢方向追踪。卵巢通常位于肾脏附近，被脂肪垫包裹。
5. 使用精细解剖剪将卵巢与子宫角分离，并剪除多余的结缔组织和脂肪。
6. 立即将卵巢转移至预热的含IBMX的M2培养基中。重复操作以获取对侧卵巢，并将其转移至同一培养皿中。
7. 将培养皿置于体视显微镜下，进行卵泡穿刺并收集COCs。

5. COCs 的收集与培养

1. 在体视显微镜下，用无菌注射器针头轻轻刺破可见的窦状卵泡，将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）释放至M2培养基中。
   注意：收集小鼠GV期卵母细胞时，应优先穿刺卵巢表面明显较大的窦状卵泡，这类卵泡通常外观隆起、半透明，具有清晰的卵泡腔。
2. 使用拉制精细的玻璃巴斯德移液管收集释放出的COCs，并转移至含有预热M2培养基（添加IBMX）的洁净35 mm培养皿中。
3. 根据需要将COCs逐次转移至35 mm培养皿中的洁净区域，以去除脱落的颗粒细胞和组织碎片，每次转移时将碎片留在原处（图3）。
   注意：仅选用具有三层或以上致密卵丘细胞层、胞质均匀颗粒化且无明显空泡的COCs进行后续操作^9,10。去颗粒细胞的GV期卵母细胞及部分被卵丘细胞包裹的GV期卵母细胞不在本方案适用范围内。在我们的实验条件下，平均每只雌性小鼠可获得约26个未成熟COCs。
4. 去除碎片后，将COCs转移至IVM洗涤培养皿中，依次通过五个100 µL的IVM洗涤液液滴进行洗涤。
   注意：转移过程中应尽量减少携带体积，防止液滴间的交叉污染。
5. 将洗涤后的COCs转移至100 µL的IVM培养液液滴中（每滴含20–30个COCs），于37 °C、5% CO₂条件下培养14小时。
   注意：应尽快完成COCs的收集、洗涤并转移至IVM培养液中，以最大限度维持其发育潜能。
6. （可选）体外成熟（IVM）后，将COCs短暂孵育于含1 mg/mL透明质酸酶的溶液中，并用微量移液器反复轻柔吹打，直至完全去除卵丘细胞。
   注意：透明质酸酶处理时间不得超过3分钟，因长时间暴露可能损伤卵母细胞。
7. （可选）在加热载物台上用新鲜M2培养基洗涤去颗粒细胞的卵母细胞，随后在体视显微镜下评估卵母细胞成熟情况。
8. （可选）排出第一极体的卵母细胞被视为成熟，处于第二次减数分裂中期（MII期）。卵母细胞成熟率按排出第一极体的卵母细胞数占培养卵母细胞总数的比例计算。
   注意：步骤5.6–5.8用于在对指定评估组COCs进行PB1评分前去颗粒细胞，以评估IVM后的卵母细胞成熟率。若COCs直接进入体外受精（IVF）流程，则无需执行这些步骤。

6. 精子采集与制备

注意：本节描述新鲜精子的采集与获能。在授精前，应将新释放的精子置于预先平衡的胚胎培养液中，在 37 °C 下孵育 1 小时，以促进获能。

1. 处死一只性成熟的 DBA/2 雄性小鼠（10–16 周龄），取出其附睾尾部，尽可能避免带入脂肪、血液和组织液（图 4）。
2. 将每只雄性小鼠的双侧附睾尾部转移至 300 µL 预平衡的 G-IVF 培养基液滴中，以释放精子并进行获能。
3. 用一对镊子固定附睾尾部，使用无菌注射器针头在附睾尾部做 5 至 7 次切割，并轻轻挤压组织以释放浓缩的精子。
   注意：评估精子活力，仅当大多数精子表现出前向运动（PR），即主动向前运动，而非非前向运动（NP）或不动状态时，方可继续后续操作¹¹。
4. 将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时，以使精子完成获能。

7. 体外 受精

1. 体外成熟培养14小时后，将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）依次通过五个含有100 µL受精洗涤液的液滴进行清洗，然后将清洗后的COCs转移至体外受精授精液滴中（每100 µL液滴含20–30个COCs）。
2. 授精前，将含有COCs的受精培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下预孵育30分钟。
3. 精子获能处理后，使用血细胞计数板测定精子浓度。
4. 根据精子浓度计算所需接种体积，并向每个体外受精液滴中加入获能后的精子，使最终浓度达到4 × 10⁵ –1 × 10⁶ 精子/mL。
   注意：加入精子后，应确认每个授精液滴中均存在活动精子。
5. 将含有COCs和精子的体外受精培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育4–6小时。

8. 胚胎培养

1. 孵育4–6小时后，使用内径略大于卵母细胞的精细拉制玻璃巴斯德吸管，以最小体积吸取假定的受精卵，并将其转移至体外受精（IVF）洗涤液滴中。
2. 通过五个连续的IVF洗涤液滴依次转移假定受精卵进行洗涤，每个液滴中轻柔吹打，以去除多余的精子和碎片（图5）。
3. 将洗涤后的假定受精卵转移至胚胎培养（IVC）洗涤培养皿中，并通过五个预热的胚胎培养液洗涤液滴进行洗涤，尽量减少IVF培养基的残留。
4. 将假定受精卵放入胚胎培养液的培养液滴中，在37 °C、5% CO₂条件下培养（每100 µL液滴中放置20–30个胚胎）。
5. 在受精后6–8小时，于体视显微镜下评估受精情况，通过观察雄性和雌性原核的存在进行判断，并弃去仅保留一个极体且无可见原核的卵母细胞。
6. 在受精后24小时，统计二细胞胚胎数量，并计算二细胞率，公式为：（二细胞胚胎数 / 受精卵母细胞数）。
7. 统计后，移除并弃去未分裂的胚胎，继续培养其余已分裂的胚胎。
   注意：在此阶段，胚胎可进行玻璃化冷冻、移植至受体雌性动物体内，或继续培养至囊胚阶段。
8. 在相同的培养条件下继续培养胚胎至受精后96小时（hpi），依据形态学标准在96 hpi评估囊胚形成情况。
   注意：此期间无需更换培养基。正常囊胚的特征包括可见的囊胚腔、清晰的内细胞团以及完整的滋养外胚层。

结果

采用本方案，小鼠COCs被依次处理通过 体外 成熟 体外 受精，以及后续过程 体外 胚胎培养，在所述条件下可重复地产生植入前胚胎，并发育至囊胚阶段。IVM 14小时后，COCs通常表现出卵丘扩张和完整的卵母细胞形态。通过在IVM后对指定的评估组卵母细胞去丘，并评估第一极体（PB1）排出情况，以量化卵母细胞的减数分裂成熟程度。图6A在三次独立重复实验中，PB1排出率分别为80.4%（41/51）、79.5%（70/88）和83.9%（47/56），对应的平均成熟率为81.3% ± 1.3%（均值 ± 标准误；n = 3次重复）。在本方案中，成熟率低于60%被视为不理想。在这些条件下，未能成熟的卵母细胞通常缺乏PB1排出，并可能出现卵丘扩展不良，以及细胞质变暗或颗粒分布不均的现象。

随后进行体外受精（IVF），并在授精后6–8小时通过评估雄性和雌性原核的形成来判断受精情况（图6B）。受精失败主要表现为大多数卵母细胞...

讨论

该方案为小鼠卵母细胞提供了一种标准化的操作流程 体外 成熟 体外 受精，以及 体外 利用未成熟COCs进行培养，可在明确条件下可重复地生成和评估至囊胚阶段的植入前胚胎 体外 条件。在许多研究中，IVM 的结果对实验室特有的培养基、培养时间及操作差异较为敏感，这些因素可能降低 IVM 后的发育潜能。^12,13采用未成熟COCs的该IVM-IVF-IVC方案获得了较高的第一极体排出率（81.3%）和二细胞率（87.6%），并支持囊胚形成（52.6%）。这些数据共同表明，该方案可支持IVM后高效且可重复的胚胎着床前发育。

既往的小鼠卵母细胞体外成熟（IVM）与体外受精（IVF）操作通常被描述为独立的实验流程，而传统的小鼠IVF通常采用 体内-来源的MII卵母细胞¹⁴尽管已有报道将体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和胚胎着床前培养技术...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 毫米培养皿	Thermo Fisher Scientific	150255
60 毫米培养皿	Thermo Fisher Scientific	150270
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A8806
繁殖饲料（啮齿动物繁殖饲料）	Keao Xieli (北京，中国)	N/A
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
一次性巴斯德吸管	Kimble	DKW63A53WT-1000EA
表皮生长因子	Gibco	PHG0313
精细解剖剪刀	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
细尖镊子	Rhino	SW14
卵泡刺激素	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	（预平衡）胚胎培养基
血细胞计数板	Millicell	MDH-4N1
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）	Selleck	S5836
KnockOut 血清替代物	Gibco	A3181501
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352
黄体生成素	Millipore	869003
M2 培养基	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
微量移液器	Gilson	F167350
矿物油	Sigma-Aldrich	M8410
磷酸盐缓冲液	Gibco	20012027
孕马血清促性腺激素	Ningbo Second hormone factory (宁波，中国)	N/A
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P4562
体视显微镜	Olympus	SZX10
无菌培养瓶	Nalgene	46600-586
无菌注射器针头	BD Biosciences	309623	1 mL，27G1/2
注射器滤器装置	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X