小鼠卵母细胞体外成熟、受精及植入前胚胎培养

摘要

本方案描述了以下操作步骤 体外 小鼠卵母细胞的成熟， 体外 受精及随后的胚胎培养至囊胚阶段。

摘要

小鼠卵母细胞 体外 成熟，结合 体外 受精及随后的胚胎培养可在明确条件下产生着床前胚胎。这些操作有助于研究卵母细胞成熟、受精以及早期胚胎发育过程中的生物学功能与分子机制。然而，该方法的成功应用依赖于对卵母细胞和精子的精细操作、适宜的培养条件，以及对各发育阶段进程的准确评估。本文描述从小鼠卵巢中分离未成熟卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的方法， 体外 卵母细胞成熟， 体外 受精，以及 体外 将胚胎培养至囊胚阶段。这些操作包括培养基和培养皿的准备与平衡、卵巢解剖后COs的分离与筛选、精子的采集与获能、在标准化条件下进行受精，以及随后对胚胎进行培养以评估其发育情况。发育进程通过形态学标准进行评价，包括雄性和雌性原核的形成、卵裂至二细胞阶段以及囊胚的形成。本方案可整合到卵母细胞成熟及母源因子功能的研究中，为哺乳动物生殖生物学的基础研究提供有力工具。

引言

了解卵母细胞的质量和发育潜能对于成功受精及后续胚胎发育至关重要^1,2。卵母细胞成熟不仅需要在核成熟过程中精确完成染色体分离，还涉及细胞质成熟，包括细胞器的重新分布以及母源mRNA和蛋白质的积累³。早期胚胎发育依赖于母源提供的mRNA和蛋白质，卵母细胞中的这些母源物质储备可维持着床前的发育过程。然而，许多调控哺乳动物胚胎发生的母源因子的身份及其功能仍尚未完全明确⁴。因此，需要进一步开展系统性研究，以阐明卵母细胞成熟、受精以及胚胎发育的潜在机制。

小鼠是研究胚胎着床前发育的常用模型系统。体外成熟（IVM）是指从卵巢中采集未成熟卵母细胞，并在受控的实验室条件下使其成熟⁵。随后，体外受精（IVF）可使成熟卵母细胞与获能精子共孵育，以获得受精卵，用于早期胚胎发育研究。然而，与使用体内成熟卵母细胞的传统IVF相比，IVM来源的卵母细胞通常表现出较低的成熟率和受精率，以及较弱的发育潜能⁶。这些局限性主要归因于在体外培养条件下细胞核与细胞质成熟之间的不同步。此外，小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体的稳定性对IVM过程中的p....

方案

所有动物实验均经西北A大学动物护理与使用委员会批准&F 大学，中国（许可证编号：20230503）

1. 动物饲养

1. 获取野生型雌性 C57BL/6 和雄性 DBA/2 小鼠，在温度为 20–22 °C、相对湿度为 55% ± 10%、12 小时光照-黑暗循环的特定无病原体（SPF）条件下饲养。自由提供繁殖饲料和饮水ad libitum。雄性小鼠单只饲养（每笼一只雄性）。

2. 培养基的制备

1. 配制50 IU/mL的PMSG工作液：将5,000 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）溶解于100 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   注意：将溶液分装为每份1 mL的单次使用量，于–20 °C保存。使用前在室温下解冻。
2. 配制IVM培养基：将表1所列成分加入100 mL Medium 199（M199）基础培养基中。调节pH至7.3–7.4，然后通过0.22 µm滤器无菌过滤至无菌培养基瓶中。在瓶上标注“IVM”、配制者姓名缩写、配制日期和有效期，并于4 °C保存，最长可使用1个月。
3. 配制0.1%（w/v）透明质酸酶溶液：将10 mg透明质酸酶溶解于10 mL M2培养基中。
   注意....

结果

采用本方案，小鼠COCs被依次处理通过 体外 成熟 体外 受精，以及后续过程 体外 胚胎培养，在所述条件下可重复地产生植入前胚胎，并发育至囊胚阶段。IVM 14小时后，COCs通常表现出卵丘扩张和完整的卵母细胞形态。通过在IVM后对指定的评估组卵母细胞去丘，并评估第一极体（PB1）排出情况，以量化卵母细胞的减数分裂成熟程度。图6A在三次独立重复实验中，PB1排出率分别为80.4%（41/51）、79.5%（70/88）和83.9%（47/56），对应的平均成熟率为81.3% ± 1.3%（均值 ± 标准误；n = 3次重复）。在本方案中，成熟率低于60%被视为不理想。在这些条件下，未能成熟的卵母细胞通常缺乏PB1排出，并可能出现卵丘扩展不良，以及细胞质变暗或颗粒分布不均的现象。

随后进行体外受精（IVF），并在授精后6–8小时通过评估雄性和雌性原核的形成来判断受精情况（图6B）。受精失败主要表现为大多数卵母细胞.......

讨论

该方案为小鼠卵母细胞提供了一种标准化的操作流程 体外 成熟 体外 受精，以及 体外 利用未成熟COCs进行培养，可在明确条件下可重复地生成和评估至囊胚阶段的植入前胚胎 体外 条件。在许多研究中，IVM 的结果对实验室特有的培养基、培养时间及操作差异较为敏感，这些因素可能降低 IVM 后的发育潜能。^12,13采用未成熟COCs的该IVM-IVF-IVC方案获得了较高的第一极体排出率（81.3%）和二细胞率（87.6%），并支持囊胚形成（52.6%）。这些数据共同表明，该方案可支持IVM后高效且可重复的胚胎着床前发育。

既往的小鼠卵母细胞体外成熟（IVM）与体外受精（IVF）操作通常被描述为独立的实验流程，而传统的小鼠IVF通常采用 体内-来源的MII卵母细胞¹⁴尽管已有报道将体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和胚胎着床前培养技术.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 毫米培养皿	Thermo Fisher Scientific	150255
60 毫米培养皿	Thermo Fisher Scientific	150270
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A8806
繁殖饲料（啮齿动物繁殖饲料）	Keao Xieli (北京，中国)	N/A
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
一次性巴斯德吸管	Kimble	DKW63A53WT-1000EA
表皮生长因子	Gibco	PHG0313
精细解剖剪刀	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
细尖镊子	Rhino	SW14
卵泡刺激素	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	（预平衡）胚胎培养基
血细胞计数板	Millicell	MDH-4N1
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）	Selleck	S5836
KnockOut 血清替代物	Gibco	A3181501
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352
黄体生成素	Millipore	869003
M2 培养基	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
微量移液器	Gilson	F167350
矿物油	Sigma-Aldrich	M8410
磷酸盐缓冲液	Gibco	20012027
孕马血清促性腺激素	Ningbo Second hormone factory (宁波，中国)	N/A
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P4562
体视显微镜	Olympus	SZX10
无菌培养瓶	Nalgene	46600-586
无菌注射器针头	BD Biosciences	309623	1 mL，27G1/2
注射器滤器装置	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X