形状分析算法量化了二维到三维细胞培养的空间形态和上下文，用于新型表型定量

Summary

本文解释了如何利用线性压缩极坐标（LCPC）变换来量化细胞和类器官中新颖的形态特征，这是一种空间算法，能够捕捉传统指标如面积、体积和表面积无法捕捉的属性。讨论了形状方向和对齐的最佳实践。

Abstract

大量研究表明，细胞或类器官的形态表型与其对抗癌剂的敏感性相关。然而，传统的表型测量方法依赖于面积、体积、周长和信号强度等空间指标，这些指标有效但有限。这些方法无法测量空间上下文中的许多关键特征，比如手性，即左右手特性的属性。体积不能用来记录手性，因为左右鞋体积相同。虽然以手性、引力方向和极性轴等形式存在的空间上下文对人类来说直观，但迄今为止细胞生物学家、病理学家、放射科医生和机器学习从业者使用的传统指标无法涵盖这些基本概念。线性压缩极坐标（LCPC）变换是一种新颖算法，能够捕捉空间上下文，这是其他任何度量都无法做到的。LCPC变换通过叠加一个网格系统，将二维（2D）轮廓转换为离散的正弦波，该网格系统追踪等高线与网格线之间的交点。它将轮廓转为一系列离散坐标对，独立坐标（x-坐标）对应二维空间中的连续位置。每个依赖坐标（y坐标）由等高线与网格线的交点到网格系统的原点或基线之间的距离组成。以离散正弦波的形式，快速傅里叶变换随后对数据应用。通过这种方式，二维和三维细胞培养中的细胞形状得以系统且多维地表示，从而实现了稳健的定量分层，从而揭示治疗耐药性的见解。

Introduction

三维类器官培养在模仿体内生物学方面已被证明优于二维（2D）细胞培养 ^1,2。类器官已成为癌症研究中不可或缺的材料，用于有效治疗筛查以及洞察疾病进展 3,4,5,6。虽然癌症生物学中众所周知，形态学上的差异与细胞和组织独特的生物学行为相关，但该领域依赖于范围有限的传统形状指标。本研究描述了一种新型空间算法，能够以前所未有的精确度客观量化细微的形态特征，超越了传统方法如面积、体积和表面积。

线性压缩极坐标（LCPC）变换旨在客观且定量地描述组织组织病理学中观察到的复杂形态，旨在提升结肠息肉⁷的分级。随后，希望将这一方法扩展到捕捉脑部病理中基于宏观MRI的空间特征，如双相情感障碍和阿尔茨海默病，促使其进行了增强。本研究介绍了两种LCPC变换版本的逐步协议和最佳实践：并行网格系统和径向网格系统，这两种系统均有开源脚本和教程视频。

除了传统的几何方法外，还有多种抽象方法能够有效测量细胞和器官的复杂形状。这些包括测量偏心率、偏度、对比度和峰度，以及用于捕捉圆性、不对称性、边缘不规则性和全局等高线^{结构8、9、10}的采尔尼克矩。分形分析也有助于将复杂轮廓简化为标量值，如分形维度，衡量轮廓的不规则程度，以及空缺度，测量等高线^11,12中不均匀空隙的出现情况。在测量纹理方面，灰阶共现矩阵（GLCM）方法在测量对比度、能量、均匀性、相关性和熵方面非常受欢迎^13,14。虽然这些方法都很有益，但它们都未设计用于捕捉空间背景，如重力方向、左右手的区别，或影响形状变化方向的中央支撑结构位置。此外，许多模型只产生单一标量值或少数标量值来表示空间信息，这也是被引用研究常用它们组合用于评估复杂形状的原因。

LCPC变换设计用于通过一次测量产生多种特征，并允许添加空间标记，将空间上下文编码到形状中，如重力方向。最接近LCPC变换⁷ 的方法发表于¹⁵年后，核心思想相同：将傅里叶变换应用于胞子轮廓，以测量以频谱形式出现的形状。然而，LCPC变换是独立开发的，通过不同的网格系统应用，这些网格系统旨在结合对被测形状之外空间环境的了解。此外，LCPC变换的发明者在该手稿中解释说，得到的频谱包含大量隐藏的空间信息。 补充文件1 包含了生物学中空间上下文的详细讨论，这些空间背景在使用上述方法时常被忽视，以及如何应用LCPC变换捕捉这一背景。对于那些形状数据显示对照组与实验组无差异的读者，无论他们的眼睛是否能看到形状差异，或者形状数据显示差异极小，尽管他们怀疑差异应该更大，他们应该尝试LCPC变换。

LCPC变换在测量空间信息方面提供了前所未有的精确度，因为它能够在多维度中表示形状。与传统方法如面积和体积不同，后者每个形状只得到一个标量值（即25 cm^²），LCPC变换结果可以得到多个指标，每个指标对应形状的不同形态特征（如圆度与角尖锐度、棱角光滑度与锯齿度）。LCPC变换通过叠加一组直线网格来描述二维形状，这些网格与其轮廓相交。每个网格系统都有一个原点（图1）或基线（图2），用于测量线性距离。请参阅 图1B 和 图2B ，获取描述该算法的简化流程图。网格线与形状轮廓之间的每一个交点都被检测出来。然后相对于基线或原点计算每个交点的距离。通过这种方式，LCPC变换将二维形状转换为一系列连续的x-y坐标对。x坐标表示网格线从零到无穷远的位置，y坐标表示交点到基线或原点的距离。在这种离散正弦波的形式下，随后应用快速傅里叶变换（FFT）将数据从“位置域”转换为频域。如果x坐标代表时间，那么“位置域”就等价于FFT标准应用中的“时间域”。

径向网格系统测量每个交点距离径向网格原点的距离（图1A），而平行网格系统总是以形状左侧的虚线为参考来测量交叉点的距离（图2A）。开源脚本通过找到轮廓最左边的像素，然后向左移动10像素来确定这条虚构线的位置。这里，该位置的x坐标成为所有交点计算的参考线。这个10像素规则是任意的，但这也是为什么开源脚本分析的所有平行网格系统等高线四边都必须至少有15个像素的空白。

对于带有折叠或多层的二维形状，网格线可能会多次与轮廓相交。在这种情况下，网格线上所有交叉点的距离被加为一个值。因此，每条网格线只有一个x坐标和一个y坐标。这种求和由LCPC变换名称中的“压缩”一词表示。将非线性二维形状渲染为离散正弦波，算法名称中的“线性化”一词表示。最后，算法名称中“极坐标”一词源自于最初被概念化的网格系统是一个极坐标^为7的180度径向网格。即使意识到极坐标和笛卡尔坐标是可互换的，算法名称仍保持原样。致谢部分描述了促使发明和增强LCPC变革的个人原因。

协议1是获取 图3B所示数据的序列，而协议2是获取 图3C–D所示数据的序列。这些协议中的步骤由GitHub仓库“Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^”中的单个Python脚本实现。协议1是为LCPC变换准备中推导“纯形状”的预处理步骤示例。协议2是预处理步骤的例子，用于测量形状的“按比例”测量，即在它们相对于原始比例尺上测量形状。

分割可以在图像处理软件中手动完成，如Mac的Preview或Microsoft的Paint，或使用基于阈值的方法。如果手动操作，应选择以下四种颜色之一：蓝色、绿色、粉色/品红色或红色。GitHub 仓库名为“Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform”¹⁶ ，其中包含一个名为“color extraction scripts”的文件夹。该文件夹包含四个带有 Python 代码的 Jupyter Notebook 文件，这些文件可以提取上述四种颜色并将其转换为白色背景上的蓝色遮罩。该过程也可以通过在图像处理软件如Fiji/ImageJ中阈值轮廓颜色来实现。对于包含边界相接或边缘重叠的轮廓的图像（例如维恩图），需要使用图像处理软件将它们分离，使它们成为包含多个类器官轮廓的复合遮罩图像中的独立对象。这不适用于仅包含一个类器官或多个不接触的类器官的图像。

Protocol

本研究中使用的原代人类细胞是在伦理批准和知情同意程序下获取并培养的，此前报告^为17个。本文展示的图像均由这些获批的细胞培养生成，并首次发表。组织样本在布莱根妇女医院和加州大学旧金山分校根据机构审查委员会（IRB）批准的方案采集，样本来自提供知情同意用于研究组织的患者，如前所述¹⁷。本研究未进行额外的人体标本采集。

1. 提取LCPC变换中二维类器官轮廓的纯形状

1. 使用任何图像处理软件（如Microsoft的Paint、MacOS的预览或Fiji/ImageJ）对每个类器官的外缘进行切割。
2. 提取类器官的轮廓，作为白色背景上的蓝色线条，形成开放的遮罩。
3. 将每个蓝色轮廓单独放在白色画布上。
   注意：此步骤仅在图像包含多个轮廓时必要。
4. 裁剪每个轮廓，使蓝色物体的四边各留一个像素的边距。
5. 在四边各增加100像素的空白空间，以创建新的边距。
6. 旋转物体，使最长的内部长度为水平。
   注意：这一步将每个物体内最长的内部线转换为物体宽度。为此目的有两种脚本可用。对于封闭形状，可以使用名为“以最长内部旋转闭合物体水平 Length_v2.ipynb”的 Jupyter 笔记本。对于开放形状或包含多个分量的形状，可以使用名为“Rotate Green Line_v3.ipynb”的Jupyter笔记本。Rotate Green Line 工具有一个视频教程，链接在 ReadMe 文件中，该文件与 .ipynb 文件同一个文件夹。
7. 裁剪每张图像，使蓝色物体的四边都留出一个像素的边距。
   注意：这与第1.4步相同。不过这次裁剪的目的是，接下来的调整步骤是调整整个画布的大小，而不仅仅是其中的蓝色物体。因此，通过使蓝色物体与画布本身的宽度和高度几乎相同，将画布调整为400像素宽度，也使物体大小接近400像素。有一本名为“Trim margin to 1-pixel border.ipynb”的Jupyter笔记本。
8. 将每张图片的画布宽度调整为400像素，同时限制宽高比。
   注意：这一步使每个物体的宽度相同。限制宽高比可以防止在调整尺寸时物体出现偏差。有一本名为“将宽度调整为400像素但限制宽高比.ipynb”的Jupyter笔记本。
9. 在四边各增加100像素的空白空间，以创建新的边距。
10. 将每张图像顺时针或逆时针旋转90度，使最长内部长度垂直，且与所有图像的选择一致。
    注意：在上述序列中，纯形状是通过依次实现步骤1.6、1.7、1.8和1.9获得的。在第1.9步添加边距空间是为了避免接下来将执行但不涉及提取纯形状的LCPC变换脚本中的错误。希望“按比例”测量形状的用户无需执行上述步骤中的第1.6、1.7和1.8步，但他们仍应在应用LCPC变换前预处理遮罩图像以达到最佳方向。
11. 对每个等高线执行LCPC变换。使用提供的 Python 脚本，用于径向网格方法¹⁸或并行网格方法¹⁹。

2. 提取LCPC变换中二维类器官轮廓的尺度形状

注意：提取物体尺度形状的逐步方法类似于上述协议1中提取纯形状的方法。两个协议中步骤名称相同，便于匹配。请参考协议1中的每一步笔记。纯形状和比例尺形状的主要区别在于，比例尺形状不需要第1.6、1.7和1.8步，这些步骤是调整尺寸的步骤。

1. 将每个类器官的外缘分段。可以使用计算方法，或者通过基础的图像编辑软件手动完成，比如Microsoft的Paint、MacOS的Preview或Fiji/ImageJ。
2. 提取类器官的轮廓，作为白色画布上的蓝色线条，作为开放面罩。使用Fiji/ImageJ提取掩码，或者使用提供的Python脚本¹⁶。
3. 将每个蓝色轮廓单独放在白色画布上。使用Fiji/ImageJ提取掩码，或者使用提供的Python脚本¹⁶。
4. 裁剪每个轮廓，使蓝色物体的四边各留一个像素的边距。使用Fiji/ImageJ或提供的Python脚本¹⁶。
5. 在四边各增加100像素的空白空间，以创建新的边距。使用Fiji/ImageJ或提供的Python脚本¹⁶。
6. 旋转每个轮廓，使其最长的内部线垂直。使用Fiji/ImageJ或提供的Python脚本¹⁶。
7. 对每个等高线执行LCPC变换。使用提供的 Python 脚本，用于径向网格方法¹⁸ 或并行网格方法¹⁹。

Results

径向网格LCPC转化应用于乳腺癌类器官

三维类器官和肿瘤可以呈现多种形状，其中一些显然与人眼不同，尽管传统指标在统计上差异不大。另一方面，类器官也可能表现出对人眼来说看似异质、因此微不足道的形状，掩盖了代表不同亚型的反复出现的微妙形态。从患者中提取人类原乳腺类器官，并按照先前发表的方案^17、20、21进行三维培养。 图3A 显示了三种形态类别，通过肉眼观察可辨认：囊性表型、多囊性表型和致密多囊性表型。 图3B 显示，这些类器官的外轮廓被人工分割，提取了其纯形状，从而消除了大小对形状的影响。由于轮廓呈圆形，先对纯形状应用径向网格LCPC变换，随后进行PCA。注意图 3B 上叠加的等高线被旋转，使得最长的内部线为垂直线，这意味着它们的方向与原图像不同。 图3B 展示了前两个主成分（PC）的点阵图，K均值聚类识别出三个聚类：0、1和2。轮廓评分（SS）确认了在聚类0与1（SS = 0.68）和聚类1与2之间可能存在两个独立的聚类（SS = 0.69），同时显示聚类0与聚类2之间的分离较弱（SS = 0.27）。尽管簇0和簇2之间的轮廓分数较弱，但用每个数据点的纯形状标记数据点，证明簇2代表了最独特的表型：高度不对称、非圆形轮廓（此处轮廓的厚度无关紧要）。

虽然纯形状消除了尺寸对形状的影响，而测量面积和体积时无法做到这一点，但以尺度测量类器官轮廓也能带来有趣的见解。 图3C 展示了前三个PC的三维点图，该变换源于径向网格LCPC变换，在图像分割后对等高线进行，且未进行任何调整大小。这种方法意味着LCPC变换同时测量类器官的形状和大小。 图3C 显示，多囊和致密多囊类器官的密度低于囊性类器官。为了量化这种展开， 图3D显示了每种表型在其共享PCA空间中的散布。计算每种表型的平均K最近邻距离（KNND），支持从囊状类器官（KNND = 1.061）到多囊类器官（KNND = 1.575）再到致密多囊类器官（KNND = 2.247）点密度递减的视觉评估;这种点密度的降低也可解释为外轮廓形态异质性的增加。最后，为了比较LCPC变换与传统面积度量， 图3E 显示，囊性类器官与致密多囊类器官面积之间存在统计显著性（p = 0.016，Wilcoxon秩和检验），但基于面积并未表明通过K均值聚类法在纯形状LCPC分析后识别的表型中存在三个不同的形态群（图3B））或如大规模LCPC分析所示，形态异质性增加（见图3C–D）。 图3E 显示了从囊状到多囊再到致密多囊类器官的数据点散布递减，这与大规模LCPC分析观察到的情况相反（图3C），凸显LCPC变换捕获的空间信息与捕获的区域不同。

同样的方法也适用于 图3中的单个二维形状，补充 图1 中也适用于二维细胞培养中的细胞轮廓：单细胞（如红细胞）或细胞簇（如宫颈抹片）。这些案例的初步研究均通过视频描述：对表现出不同外轮廓折叠程度的脑类器官的形状分析²²;肺肺泡原 位形状分析，同样的原理也可用于二维细胞培养的分析²³;通过放射状网格LCPC变换²⁴同时定量细胞核和细胞膜轮廓的宫颈涂片对宫颈组织的形状分析;对疟疾感染的红细胞及邻近但本身未被感染的红细胞进行形态分析²⁵;镰状细胞病影响红细胞的形态分析²⁶。

用于测量密度或纹理的并行网格系统，作为空间信息的索引

空间信息涉及的不仅仅是形状的常规概念，如方形、圆度和曲率，还包括纹理和密度等概念。复杂的管状网络，如血管，或分支网络，如细胞骨架丝，并不符合我们基于几何的形状直觉（如圆和多边形）的形状概念。然而，密度和纹理是理解细胞、类器官和肿瘤结构和功能的非常有用的空间信息概念。在处理如何量化荧光成像中的复杂网络时，细胞生物学家测量诸如图像中平均信号强度或图像总面积中包含信号的百分比等特征。这些方法认识到空间信息远不止几何图案所描述的那样。

芯片上组织、肿瘤和器官内血管网络的模式不易用传统几何图案定义，但通过以质地和密度来解释，可以受益。血管重塑在肿瘤发展和治疗耐药性中是癌症的公认特征（综述于^第27页）。分析了²⁸个原发性神经母细胞肿瘤的组织病理切片，表征了总血管和血管段的密度、大小和形状。他们发现，预后因子较差的患者肿瘤血管更大、更丰富，且形状更不规则，而与有利群体的肿瘤相比。有趣的是，有个术语称为“包覆肿瘤簇的血管”（VETC）²⁹，用以描述包围较大肝细胞癌中小肿瘤簇的血管分布，这些血管与更高的转移和复发率相关。创造该术语的同一团队后来发现，VET阳性肝细胞癌与激酶抑制剂Sorafenib³⁰治疗的阳性反应相关。因此，量化血管模式的能力对于预后和理解耐药机制至关重要。

对于量化管状、岛屿和分支的密集网络，LCPC变换的并行网格系统有助于测量可称为纹理密度的部分，而非形状。作为平行网格LCPC变换如何实现这一点的示例， 图4A 展示了心脏血管研究中的心脏微血管模式。³¹：肉眼观察，客观和定量地区分梗塞区域与远离受伤部位区域之间的模式非常困难。通过提取血管掩膜（图4A 步骤1）并应用并行网格LCPC变换，可以观察到定量差异。首先，为了提升数据的清洁度，每张图像都裁剪了一个直径均匀的圆，并且该圆圈位于正方形图像的中心（图4A 步骤2），以确保无论旋转如何，每张图像的高度和宽度都相同。接着，裁剪后的图像被旋转，使血管主轴（ 图4A 步骤1中的红色双箭头）垂直（图4A 步骤3）。然后，在图像周长上加一条蓝线，以确保即使是血管图案稀疏的图像，蓝色像素直径也相同（见图4A ，步骤4）。步骤3和4使用Fiji/ImageJ软件（v2.14.0）完成。最后，应用并行网格的LCPC变换（图4A 步骤5）。通过PCA分析结果并绘制前三个PC，显示受损区域与远端区域分开聚集（见图4B）。倒角距离（CD）的计算量化了图表中展现的视觉模式。损伤后1天，梗塞部位的血管分布比基础部位更远（基础与1Day_infarct：CD = 83.89），而非受伤部位则较远（基底 vs 1Day_remote：CD = 53.95）。在受伤后1天，未受伤的偏远部位比与基础病灶更接近受伤部位（1Day_remote vs 1Day_infarcxt 4：CD = 34.48）。损伤后3天，受伤部位及相关未受伤远处部位的血管模式与基础状况及彼此之间出现显著偏离（基础与3Days_Infarct：CD = 240.63;基础与 3Days_Remote：CD = 67.28;3Days_Remote对3Days_Infarct：CD = 168.35）。非常有趣的是，在受伤后7天，受伤部位和未受伤的远处部位的血管分布分布在一个与基础状态大致正交的三维空间上，但彼此之间的距离比受伤后1天时更接近（第7天的CD = 24.76，而第1天为34.48）。数据表明两点：（1）随着愈合进展，受伤部位和未受伤的远处部位的血管模式呈现出与基础状况不同的模式;（2）在受损部位激活的重建程序也会在其相关未受伤的偏远地点触发类似的形态变化。

作为LCPC变换多功能性的参考，计算了传统的血管面积百分比（图5A）和总周长（图5B）。虽然面积和周长揭示了时间进程中各点之间的变化，但它们无法提供船舶不同空间布局的连贯量化。面积和周长是抽象的概念，可以代表多种不同的血管排列，因此无法说明血管空间布局在治疗条件和时间进程中的变化。当每组 n = 3 时，t 检验和 Wilcoxon 检验都不可靠。Cliff's Delta是非参数的，能很好地展示效应量的变化。通过测量血管面积的主要区别在于基础病况与7天时间点之间;对于血管总周长，差异在于基础状态与1天和基础状态与7天之间。然而，面积和周界并未表明受伤地点与未受损的偏远地点之间存在差异，这非常令人惊讶，因为受损地点是有意受损的。这正是LCPC变换相较于传统指标的多样性体现的地方。对于每个样品，作为LCPC变换一部分的FFT结果会产生一组与一组频率相关的幅度。每个频率区间的大小可以被平均，然后在处理组间进行比较（补充图1）。这使得评估处理组间哪些频率区间差异最大便于评估。 图5C 显示了六个箱子，在不同处理组之间表现出明显的效应大小差异，尤其是在梗塞部位与其相关的非受伤偏远地点之间，且面积和周界显示无差异。这六个箱子中的独立数值提供了多个指标，显示治疗条件间的数量差异。有趣的是，LCPC变换结果Bin 1组间的分布模式与测量总周长的结果相似。然而，其他指数则揭示了面积和周边中隐藏的数量差异。基础条件独有的指标：Bin 49、Bin 56、Bin 21。第一天组别之间的指数是唯一的：Bin 1、Bin 6、Bin 49。第三天组独有的指数：第6箱、第112箱、第49箱。第7天组独有的指数：第6箱、第49箱、第112箱。这些数据凸显了LCPC变换相较于传统面积和周长方法的多功能性和精确性。

图1：LCPC变换径向网格系统的描述。 （A） 步骤1：将感兴趣的形状分段并提取为蓝色遮罩。步骤2：为遮罩确定一个包围框（即包围并接触物体的最小矩形）。从包围盒中心起始的放射状网格线系统被覆盖在遮罩上。选择包围盒中心而非物体重心作为原点的决定是任意的。步骤3：计算网格线与形状之间每个交点相对于原点的距离。拥有多个交叉点的网格线会将所有交叉距离加为该网格线的数值。步骤4：应用FFT将步骤3的数据转换为频率图，即步骤1形状的静态多维表示（步骤5）。步骤6：从步骤5可以通过索引创建一个标量值。关于应计算指标类型的讨论，请参见 图10 。（B）一个流程图，展示了径向网格系统LCPC变换步骤的简化描述。（C） 放射状网格系统最优的形状主题示例。这些形状是在Microsoft PowerPoint中绘制的。这些图片由作者创作，无需任何出版许可或版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：LCPC变换并行网格系统的描述。 （A） 步骤1：将感兴趣的形状人工分割并提取为二进制遮罩。步骤2：在形状上叠加平行网格系统，旋转使其底部水平。步骤3：计算网格线与形状之间每个交叉点相对于基线的距离。拥有多个交叉点的网格线会将所有交叉距离加为该网格线的数值。步骤4：应用FFT将步骤3的数据转换为频率图，即步骤1中形状的静态多维表示。步骤6：从步骤5可以通过索引创建一个标量值。关于应计算指标类型的讨论，请参见 图10 。（B）一份流程图，简化了并行网格系统中LCPC变换步骤的描述。（C） 示例塑造了平行网格系统最优的主题。这些形状是在Microsoft PowerPoint中绘制的。这些图片由作者创作，无需任何出版许可或版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：LCPC转化客观地识别了乳腺癌类器官的形态亚型。 （A）原发人类乳腺类器官如先前报道的^17、20、21及 补充文件1所述。通过肉眼观察和分类三种表型：囊性、多囊型和致密型多囊。尺度条 = 50 微米。（B） 类器官的外轮廓被人工分割（补充图2;标准见 补充文件1），并获得了这些轮廓的纯粹形状。注意图中的轮廓均旋转，使得最长的内部线为垂直;因此，它们与原始方向不符。随后应用径向网格LCPC变换，并通过主成分分析分析结果。K-均值聚类识别出三个聚类（0、1和2），并计算了轮廓评分（SS）以确认其存在。群聚0对1，SS：0.68;群聚0对2，SS：0.27;1组与2组，SS：0.69。（C） 还通过径向网格LCPC变换测量了类器官的外轮廓，即图像中形状之间的相对形状，且未进行任何调整大小。内嵌图被放大，展示了多囊和致密多囊类器官相较于囊性类器官更松散的堆积。对于B和C：绿色=囊性，紫色=多囊性，黄色=致密多囊性。（D） 前三个PC值分别绘制每个表型，计算平均KNND以显示囊性表型最密集，而多囊型和致密多囊型表现密度较低（即更异质性）。虽然分开绘制，但这三种表型共享相同的PCA空间。对于囊性表型，平均KNND是从插入处计算的，因为该表型中仅存在的异常值会影响计算结果。平均KNNDs：囊性1.061;多囊癌1.575;致密多囊细胞，2.247。（E） 类器官面积的箱形图显示，数据点从囊状到多囊性再到致密多囊类器官的散布度递减，这与大规模LCPC分析中观察到的情况相反（见图3C），凸显LCPC变换捕获的空间信息与区域捕获的空间信息不同。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：使用平行网格LCPC变换测量纹理密度。（A）此前在另一项研究中获得了心脏组织微血管的显微照片^31,32。这些图像并非直接从这些研究中复制;相反，它们代表的是由Gkontra提供的同一个原始3D成像数据集生成的新视图，该数据集报告了³¹个。尽管该数据集此前已发布，但此处展示的具体图像是首次公开。未显示每个时间点未受伤的偏远地点的影像。步骤1：生成二维遮罩，确定血管的大致对齐轴（红色双箭头）。步骤2：获得一个以图像中点为中心的圆形区域，以便在下一步图像被不同程度旋转后，使每幅图像高度保持一致（旋转不同程度的方形图像会根据旋转角度改变图像的高度）。步骤3：将每个图像旋转，使得步骤1确定的大致对齐轴为垂直。步骤4：在每张图像周围加以均匀的蓝色边框，以确保每幅图像的直径相同，因为密度较小的图像可能更短（例如：参见步骤3中的“心肌梗死后7天”）。步骤5：应用并行网格LCPC变换。（B）平行网格LCPC变换输出前三个PC的点图（紫色：基础状态，绿色：梗塞部位，黄色：远离梗死部位的未受伤部位）。有关三者间每个时间点的倒角距离计算结果部分。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：LCPC变换测量了区域和周边中隐藏的特征。 为与传统形状指标比较，测量了（A）血管网络的面积百分比和（B）总周长。（C） 为了展示LCPC变换结果可获得的精度，比较了FFT所得的各个频率区间的值（补充图1）。选择了六个频率区作为指标，客观量化处理组间的差异。对于所有面板，由于每组样本量有限（n = 3），非参数Cliff's Delta作为效应量计算，而非Wilcoxon秩和检验的p值。 请点击此处查看该图的更大版本。

图6：系统地定向形状以提取干净数据的重要性。（A）一个相互镜像的相同形状示例，平行网格系统如何确定它们的不同方向，从而产生不同的结果。（B） 如何水平翻转形状2的示例，使其方向与形状1相匹配，从而与形状1进行更公平的比较。在这种配置下，并行网格LCPC变换对形状1和形状2都产生了相同的结果。只有在没有空间上下文表明形状2不应被修改的情况下，才应进行这种方向的改变。（C） 四种看起来像数字“3”的物体变体示例，其中一些朝向错误方向。（D） 示例说明如何调整每个物体，以最大化并行网格LCPC变换后数据的纯净度。（E） 基于与D面板相同的方向规则测量面板C中物品较宽凸起的示例。（F） 测量面板C物品大球体但保持其对齐上下文的示例，如面板D所示。保留D面板对齐规则的动机是剖析空间信息在较宽隆起中相对于较窄凸起在这些规则中的贡献。关于与C–F相关的FFT光谱，请参见补充图3。A–B 中的图片是来自 Microsoft PowerPoint 的图标。C-F的形状是用Microsoft PowerPoint绘制的。这些图片由作者创作，无需任何出版许可或版权许可。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：传统形状指标无法识别明显的上下文。 （A） 勾勾序列形状相同，但大小从左到右逐渐增加。在该系列中，每个勾选标记的面积不同，但形状概念保持不变：即它们保持相同的勾选标记样式。（B）一个正方形绕其中心旋转45度，直到其形状概念变成人类所说的菱形。虽然正方形的形状概念与菱形截然不同，但中间的旋转主观上被解释为“倾斜方形”或“倾斜方形”。LCPC变换可以客观且精确地测量该级数中每个步骤的差异。这些形状是在Microsoft PowerPoint中绘制的。这些图片由作者创作，无需任何出版许可或版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：解释纯形状与比例形状。 “按比例测量”是指根据物体的原始大小相对测量物体的形状。而“纯形状”则是指在相似的尺度下测量不同物体的形状，这消除了尺寸对形状的影响。找到客观的方式来调整被比较对象的大小非常重要。最长的内部线通常是最优选择（步骤1）。两个物体都旋转，使得最长的内部线是水平的（步骤2）。在这种情况下，两个物体也会旋转，使凹入的一面朝下。接下来，每个物体的宽度（现在与每个物体最长的内部线大小相同）被重新调整为400像素宽，同时限制宽高比以防止物体偏斜（步骤3）。最后，在应用LCPC变换前，可以选择将调整尺寸后的对象旋转90度（步骤4）（此例中为逆时针）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9：癌症研究空间标记示例。 （A）一个假设的二维培养中细胞通过向迁移方向扩展层状体迁移的例子。在上皮细胞的迁徙形态学背景下，将每个细胞的轮廓定向，使得与迁移轴对齐的最长内线垂直，是捕捉空间上下文最合理的方法。（b）假设性肿瘤或癌前病变在不改变形状的包膜内生长的例子。病变从茎部生长，茎是中央的支撑结构。随着病变的生长或萎缩，其轮廓会向包膜内壁移动或远离。虚线代表一种合理且客观的方式，用来定义应描摹包覆物的多少（橙色线），以确保添加的信息既不少也不过多。（C）选项1显示对病变轮廓施加的平行网格LCPC变换，但未涉及包覆层位置的上下文。选项2显示的内容相同，但包含了包裹所在的空间环境。例如，红点代表网格线（黑箭头、绿色线）与等高线的交点。选项2会导致每个网格线形成第四个交点，而选项1中不存在，这在定量上为选项2的结果增加了空间上下文，而选项1完全不存在。这些形状是在Microsoft PowerPoint中绘制的。这些图片由作者创作，无需任何出版许可或版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10：假设的FFT结果及可从中推导出的常见指标。 （A）显示两个假设形状的FFT生成的频率图。由于Bin 3和Bin 4的星等呈现相反趋势，这两个bin之间的比例将成为代表这两种形状差异的良好指标。红绿虚线代表其他频率区间，可用于推导良好指标。（B）两个假设形状的直方图，其FFT剖面表现出递减趋势，表示它们的形态差异。（C） 两个假设形状的直方图，其FFT轮廓在频率区间中央区域差异最大。（D） 可能产生与其存在相关的指标的假设形态特征示例。这些形状是在Microsoft PowerPoint中绘制的。这些图片由作者创作，无需任何出版许可或版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：箱状-胡须图，比较了血管网络中LCPC变换结果中不同频率区间的幅度。 图4和图5中显示的血管网络的LCPC变换生成了一组频率频段及其大小，代表每幅图像。使用每个箱中大小的箱状图比较所有处理组，确定哪个箱体最适合作为通过LCPC变换测量的分层纹理密度指标。每个箱须图由 n = 3 张独立图像组成。请点击这里下载此文件。

补充图2：分节乳腺肿瘤类器官示例。 类器官由专家手工分段，他会例行培养并在显微镜下观察。图示展示了分段类器官轮廓的示例。所有显微图像的比例尺为50微米。本研究中使用的原级人类细胞在伦理批准和知情同意程序下采集并培养，报告^了21个。这里展示的图像来自这些获批的细胞培养，并首次发表。未进行额外的人体标本采集。请点击这里下载此文件。

补充图3：图6中形状的FFT光谱。 图 6 中形状的FFT结果在此提供，方便读者理解改变形状方向对其空间信息的影响。图的左列有未变动的y轴，而右列则有截断轴，使得较小的bin值可以直观地显示。（A） 图 6C 中四个形状的平行网格LCPC变换的谱，意味着无需重新定向。 （B） 图 6D中形状的平行网格LCPC变换的光谱，这些形状已按照正文描述重新定向。 （C） 图 6E中形状的平行网格LCPC变换的光谱。 （D） 图 6F 中形状的平行网格LCPC变换的光谱，用于与 图6E中的形状进行比较。 请点击这里下载此文件。

补充文件1：关于LCPC变换最佳实践的详细细节。 本补充文件提供了关于最佳实践的广泛讨论及进一步的方法论笔记。文件大纲如下：第一节——空间背景，面积、体积、周长和粗糙度无法捕捉。第二部分 - 使用LCPC变换及解读结果的最佳实践。第三部分 - 理解自然固有的极性，以最大化LCPC变换。第4节 - 解释由LCPC变换产生的FFT谱。第5节 - 如何在用LCPC变换测量形状前确定形状方向。第六部分 - 什么是“纯粹形状”与“比例尺形状”？第7节 - 统计方法论笔记。第8节 - 类器官细胞培养与切割的方法论笔记。第9节 - FFT参数，适用于编写自己LCPC变换的人。 请点击这里下载此文件。

Discussion

与任何计算工具一样，输出质量取决于输入是否符合工具设计所依据的预期规则。使用提供的Python脚本时，应遵循以下规则作为质量控制检查。首先，确保开放的遮罩是白色背景上的蓝线。蓝色是任意的决定，没有任何意义，但执行LCPC变换的脚本是用来在白色背景上搜索蓝色像素。其次，不要对四边空白少于10像素的图像运行LCPC变换脚本。请看这个视频，了解原因：“边距厚度参数——如何准备形状轮廓”³³。第三，这个脚本假设你的物体轮廓是白色背景上的蓝色像素。线条的粗细应在5到10像素之间。请看这个视频，了解原因：“线条粗细参数——如何准备形状轮廓”³⁴。第四，不要在空白图像上运行LCPC转换脚本。这会导致脚本出现错误。第五，不要对仅有一点碎片组成的图像运行LCPC变换脚本。这会导致误差，因为网格系统可能无法检测到该斑点，从而尝试分析空白图像。第六，不要对含有不想要杂物的图像运行LCPC变换脚本。这些碎片会改变遮罩物体的高度和宽度，从而导致结果不准确。第七，观看这段视频，理解为什么在用LCPC变换分析物体之前，了解其比例尺很重要：“比例参数——如何准备形状轮廓”³⁵。

LCPC变换最令人惊叹的方面之一是它能够捕捉空间上下文。生物学充满了空间背景，这对理解自然至关重要。例如，上皮细胞的顶基极性为^{36、37、38、39}。此外，重力方向在微重力条件下发生变化，对宇航员生理^40,41和癌细胞形态^42,43,44都有显著影响。最后，原位肿瘤前瘤变和肿瘤通过作为中央支撑结构的茎长成腔，为血液供应提供通道。因此，当这些病变退回时，它们既会从腔腔内退回，也向茎部方向退缩^45,46。由于LCPC变换设计初衷，它对空间上下文高度敏感，如果用户不小心，可能会引入额外的异质性。图6描述了如何在应用LCPC变换前系统地定向形状。图7描述了传统几何学如何无法测量人类显而易见的形状概念。图8提供了一个图表，直观地展示了测量纯形状与尺度形状的区别。图9描述了在量化二维培养、组织学和三维成像二维切片形状时，空间上下文常被忽视。请注意，由于篇幅限制，补充文件1包含了第5节中图6和图7的详细讨论，以及第6节中图8和图9的详细讨论。

由于FFT产生多维频谱数据，用户必须熟练地从频谱中反复出现的模式中推导指标。虽然该手稿中提到LCPC变换包含了FFT应用步骤，但实际的LCPC变换发生在FFT步骤之前（图1A–B 步骤4， 图2A–B 步骤3）。然而，应用FFT可以从LCPC变换输出的频域中获得客观、系统性的见解。因此，如果不将FFT作为最后一步，LCPC变换的效果将不那么理想。在LCPC变换中，FFT生成一系列bin及其大小，这些都是步骤1中等高线输入的静态多维表示。静态多维信息表示的一个类比是美国中代表个人电话通信通道的九位电话号码。虽然与标量值形状表示（如85厘米长、56度宽等）相比笨重，但多维数据蕴含更多信息以提取洞见。 图10 展示了在应用LCPC变换时观察到的若干光谱模式及其如何从中推导指标。 补充文件1 第4节对 图10 进行了更详细的讨论。

LCPC变换的频域揭示了肉眼难以察觉的二维形状的客观和定量特征。曲率、锯齿和弯曲度的细微差异都可以被有力量化。然而，一旦通过该方法识别出形态亚型，就能观察到与数量差异相关的视觉特征。这一特性使LCPC变换可解释为机器学习（ML）模型中提取空间信息的方法，并使生成的机器学习模型本身更具可解释性。虽然神经网络是一种强大的机器学习方法，但其结果往往无法被人类解读，这对医疗人工智能（AI）领域来说是一个重大问题。如果医生不理解模型为何做出错误决策，他们往往不愿意采用机器学习模型来做临床决策。此外，如果没有人理解模型为何或如何做出有偏见的决策，那么解决这个问题就变得难以解决。

值得补充的是，关于测量纹理密度（见图4 和图5）时，人眼很容易被视觉错觉或无序图案所迷惑。复杂模式的杂乱排列常被解读为随机、不可测量或不值得测量。LCPC变换可以测量看似随机模式中的可重复、客观、定量差异。然而，除非用户被训练不被自然界中伪装成随机的混乱无序模式误导，否则不会尝试测量这种无序以揭示可预测的模式。可预测的模式清楚地表明该系统并非完全随机。LCPC变换的发明目的是测量肉眼上微妙不同或难以想象的形状。由于自然界中许多形态表现出细微差异，这些差异更像是无意义的混沌异质性，而非可预测的无序亚型——每种亚型都对应于不同的生物功能——因此开发了以下“四步”概念框架，配合LCPC变换使用。首先，要反对认为复杂系统是随机的观点。其次，将混沌异质性称为“无序”，然后找到一种可以作为理性参照条件的秩序。假设该障碍偏离了参考文献。第三，找到一种客观测量参考模式的方法，比如LCPC变换。第四，将同样的客观方法应用于测量系统中被视为无序的状态。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	使用sklearn.neighbors包中的NearestNeighbors函数
BLUE_Color Extraction.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	使用scipy.spatial包中的cKDTree函数
Cliff's Delta	组织空间几何实验室	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	通过Python语言创建了Cliff's Delta的实现
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Flip images VERTically.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
GREEN_Color Extraction.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
MacOS Preview Version 11.0	苹果公司	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Microsoft Paint	微软	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	被提及为手动分割的潜在有用工具，但在本研究中未使用
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	微软	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	使用sklearn.decomposition包中的PCA函数
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Rotate Green Line_v3.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Rotate images 90CCW.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Rotate images 90CW.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Thicken Blue Lines.ipynb	组织空间几何