从抗脑性瘫痪药物中鉴定靶向乙酰胆碱酯酶的活性成分 Coptis chinensis 使用亲和超滤与实验验证

摘要

本研究旨在通过亲和超滤结合实验验证的方法，鉴定黄连（Coptis chinensis）的关键活性成分，并阐明其在脑性瘫痪（CP）干预中的作用机制。

摘要

本研究的目的是鉴定出该体系中的关键活性成分 Coptis chinensis 并利用亲和超滤技术阐明其在干预脑性瘫痪（CP）中的作用机制。以乙酰胆碱酯酶（AChE）为靶点，从提取物中筛选出药根碱 C. chinensis 结合能力最强的组分，其结合率达到21.9%，且具有显著性 体外 抑制活性（IC₅₀ = 3.24 µg/mL）。分子对接与分子动力学模拟表明，药根碱可稳定结合于AChE的活性口袋。随后，在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型上开展了验证实验。结果显示，药根碱干预（10 mg/kg）显著改善了模型动物的空间学习与记忆缺陷，增加损伤半球的脑血流量，减轻脑组织病理损伤，并抑制脑内AChE的异常激活。综上所述，本研究结合亲和超滤技术，证实了从 中华草药提取物，可抑制乙酰胆碱酯酶（AChE），并发挥神经保护作用及改善脑血流的作用。它是发挥这些功效的关键物质基础。 C. chinensis 以改善类似脑性瘫痪的神经功能缺陷，从而为相关药物的研发提供候选分子和科学依据。

引言

脑性瘫痪（CP）是由于胎儿或婴儿发育中的大脑受到非进行性损伤而引起的永久性综合征，主要表现为运动功能障碍和姿势异常。尽管目前已有多种临床治疗手段可用于脑性瘫痪，但仍缺乏能够从根本上修复神经功能缺陷且副作用较小的理想药物。与通常作用于单一靶点且潜在毒性相对较高的化学合成药物不同，传统中药（TCMs）具有多组分、多靶点、整体调节的优势，并在长期临床实践中展现出良好的安全性，为复杂脑部疾病的治疗提供了新的思路和丰富的候选药物资源^1,2,3,4,5,6。因此，从传统中药中发掘高效、低毒的化学成分具有重要的科学意义和临床价值⁷。

在脑性瘫痪复杂的病理机制中，胆碱能神经系统功能障碍起着关键作用^8,9。乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种水解神经递质乙酰胆碱（ACh）的关键酶。该酶活性过高会导致ACh耗竭，损害胆碱能信号传导，从而加剧运动控制和认知功能障碍。因此，AChE已成为开发神经保护剂的重要且公认的药物靶点。通过抑制AChE活性以提高突触间隙中ACh水平，被公认为改善脑性瘫痪相关神经功能缺损的有效策略之一。在缺氧-缺血性脑损伤背景下，胆碱能神经传递的中断可能进一步加重神经元功能障碍，进而导致与脑性瘫痪相关的运动和认知障碍。因此，本研究选择AChE不仅作为经典的神经功能靶点，同时也作为筛选具有潜在抗脑性瘫痪作用生物活性化合物的机制相关切入点。

现代研究表明，药用植物具有广泛的药理活性。作为清热燥湿的经典中药，Coptis chinensis 是一个复杂的体系，富含多种异喹啉类生物碱。除了广为人知的小檗碱外，还含有结构相似但药理活性多样的系列成分，如药根碱、表小檗碱、巴马汀和非洲防己碱¹⁰。这些生物碱共同构成了 C. chinensis 药理作用的物质基础。既往研究已证实，C. chinensis 及其生物碱具有抗炎、抗氧化以及潜在的神经保护作用。然而，由于其成分体系十分复杂，传统研究方法难以快速、准确地鉴定出直接作用于乙酰胆碱酯酶（AChE）的关键活性成分，这极大地限制了对  C. chinensis 治疗脑损伤作用机制的深入阐明¹¹。

与传统的活性导向分离方法相比，后者通常需要反复进行组分分离、生物活性测试和纯化，可能导致低丰度但高亲和力化合物的丢失或忽略，而亲和超滤技术则能够直接从复杂混合物中快速筛选出与靶标结合的配体。该技术实现了高效且快速的筛选 "捕鱼" 能够直接从中药多组分粗提物中筛选出与特定靶点（如AChE）结合的活性配体。该方法特别适用于含有多种生物碱成分的体系，例如 C. chinensis，从而能够从复杂的混合物中准确定位与靶标直接相互作用的有效成分¹²结合分子对接和分子动力学模拟等计算方法，可在原子水平上直观预测组分与靶标蛋白之间的结合模式、相互作用类型及复合物稳定性，从而为实验筛选结果提供有力的理论依据和机制解释¹³.

基于上述背景，本研究提出以下科学假设：在存在的多种生物碱中 C. chinensis，存在能够特异性抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性成分，这些成分是其潜在抗脑性瘫痪作用的物质基础。为验证这一假设，我们结合现代筛选技术与药理学验证方法：首先以AChE为靶点，采用亲和超滤技术从多生物碱提取物中快速筛选潜在抑制剂 C. chinensis；此外，采用分子对接和分子动力学模拟以阐明原子水平上的结合机制；最后， 体内 通过动物实验验证筛选出的成分对慢性铅中毒大鼠行为学、脑组织病理学及乙酰胆碱酯酶活性的改善作用。

方案

所有动物福利和实验程序均经遵义市第一人民医院实验动物福利伦理委员会批准（伦理编号：2025-2-362）。在造模和治疗期间，每日记录动物的体况和存活情况。

样品制备 C. chinensis 提取
本研究中，采用加速溶剂萃取仪对正丁醇组分进行加速萃取 C. chinensis 药材。共取1 g干燥粉末 C. chinensis 准确称重后分别置于40 mL萃取池中。在萃取池上下依次放置金属垫片和玻璃纤维滤膜以过滤样品，并用石英砂包裹样品。萃取过程中，温度和压力分别设定为90 °C和100 bar。收集加速萃取液，使用旋转蒸发仪将萃取溶剂蒸干，得到不同极性组分的干燥提取物。选择甲醇:水（50:50, v/v）作为复溶溶剂。提取物经0.45 µm微孔滤膜过滤后，于4 °C保存。在样品检测前，考察了空白复溶溶剂对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制活性。结果表明，其抑制作用可忽略不计，说明本实验所选用的复溶溶剂不会影响实验结果。

乙酰胆碱酯酶抑制活性测定
实验在96孔板中进行。首先加入PBS，随后依次加入乙酰胆碱酯酶（AChE，0.1 U/mL）和C. chinensis样品。37 °C孵育10分钟后，加入5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液（2.5 mmol/mL）和乙酰硫代胆碱碘化物（ATChI）底物溶液（10 mmol/mL）。混合物再于37 °C继续孵育10分钟，然后加入60 µL 1%十二烷基硫酸钠（SDS）终止反应。在405 nm处测定吸光度。每种C. chinensis样品设置4个组：对照组a：依次加入PBS（120 µL）、AChE溶液（20 µL）、DTNB溶液（40 µL）、ATChI溶液（40 µL）和SDS溶液（60 µL）；空白对照组b：加入PBS（120 µL）、DTNB溶液（40 µL）、ATChI溶液（40 µL）和SDS溶液（80 µL）；样品组c：加入PBS（80 µL）、C. chinensis提取物（20 µL）、AChE溶液（20 µL）、DTNB溶液（40 µL）、ATChI溶液（40 µL）和SDS溶液（60 µL）；样品空白组d：加入PBS（100 µL）、C. chinensis提取物（20 µL）、DTNB溶液（40 µL）、ATChI溶液（40 µL）和SDS溶液（60 µL）。以石杉碱甲作为阳性对照，初始浓度约为2.5 mg/mL；正丁醇萃取物的初始浓度约为1 mg/mL。石杉碱甲和样品均采用60%梯度稀释。抑制率按以下公式计算：抑制率（%）= [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%，其中a、b、c和d分别代表对照组a、空白对照组b、样品组c和样品空白组d的吸光度值。

采用上述公式计算每个测试浓度下的抑制率。随后，通过将抑制率对化合物浓度的对数作图，绘制浓度-抑制曲线。根据拟合的浓度-反应曲线，使用GraphPad Prism软件进行非线性回归拟合，计算IC20、IC50和IC80值，并将其定义为分别产生20%、50%和80%乙酰胆碱酯酶（AChE）活性抑制所需的浓度。

亲和超滤分析
采用亲和超滤法从C. chinensis提取物中筛选乙酰胆碱酯酶（AChE）结合化合物。简言之，使用乙酰胆碱酯酶溶液（0.1 U/mL，PBS缓冲液，pH 7.4）作为活性酶。失活酶对照组通过将相同AChE溶液在沸水浴中加热10分钟制备。每项反应中，将200 µL C. chinensis提取物溶液与200 µL活性或失活AChE溶液混合，并在37 °C孵育30分钟。孵育后，将混合液转移至30 kDa超滤离心管中，在4 °C、12,000 × g条件下离心10分钟。保留的酶-配体复合物在相同离心条件下用200 µL PBS洗涤三次，以去除未结合成分。随后，加入200 µL 90%甲醇以解离并洗脱与AChE结合的配体，孵育10分钟后再次在12,000 × g条件下离心10分钟。收集洗脱液，过滤后采用高效液相色谱法（HPLC）进行分析。与失活酶对照组相比，在活性酶组中富集的化合物被视为潜在的AChE结合成分¹⁴。

主要生物碱代谢物的高效液相色谱分析
采用配备四元泵、自动进样器、柱温箱和紫外-可见光（UV-Vis）检测器的高效液相色谱（HPLC）系统进行色谱分析。分离在C18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 µm）上完成，柱温维持在25 °C。流动相由乙腈（A）和含有0.7%氨水与0.25%三乙胺的30 mmol/L碳酸氢铵溶液（B）组成，流速为1.0 mL/min。梯度洗脱程序如下：0–15 min，B相从90%降至75%；15–25 min，B相从75%降至70%；25–50 min，B相从70%降至55%。进样体积为5 µL，在270 nm波长下进行紫外检测。

用于主要生物碱的定量分析 C. chinensis每个样品（0.02 g）经精确称量后，加入10 mL盐酸-甲醇溶液（1:100，v/v），超声提取30 min。滤过之后，用相同提取溶剂补足失重至原质量，所得溶液经0.45 µm微孔滤膜滤过后用于HPLC分析。在相同色谱条件下分析了8种纯品对照品，包括木兰花碱、紫堇碱、药根碱、小檗胺、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱。采用对照品溶液对上述各分析物建立校准曲线。由于8种生物碱的含量水平和检测器响应值差异较大，各分析物的校准范围根据文献报道及预实验结果分别进行优化，而非对所有化合物采用相同的倍数稀释方案。因此，8种分析物线性范围的高浓度与低浓度之比并不相同。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别根据信噪比约为3和10时确定。

为了分析亲和超滤洗脱液，将超滤后从乙酰胆碱酯酶（AChE）解离的配体通过重复实验收集，并在高效液相色谱（HPLC）分析前进行浓缩，以确保检测时具有足够的信号强度。浓缩后的洗脱液采用与上述相同的HPLC条件进行分析。通过与八种真实对照标准品以及在相同分析条件下获得的C. chinensis提取物的色谱图谱进行靶向比对，确定洗脱液中的色谱峰归属。因此，本分析的目的并非对未知化合物进行从头结构鉴定，而是靶向确定C. chinensis中已知的主要生物碱是否在活性酶洗脱液中相对于失活酶对照组得到富集。

分子对接实验
在本研究中，对接分析聚焦于药根碱，因为通过亲和超滤技术鉴定出其为与乙酰胆碱酯酶（AChE）结合能力最强的成分，且表现出最强的活性 体外 主要生物碱间的抑制活性。蛋白质晶体结构取自蛋白质数据库（PDB），选择共结晶配体的蛋白质晶体作为最终的对接受体，所有靶标蛋白质晶体均来源于人类。使用PyMOL软件打开受体文件，分离并保存受体与配体文件；随后在MGLTools软件中打开受体文件，去除水分子，添加氢原子和电荷，合并非极性氢原子，计算局部原子电荷等，保存为pdbqt格式；配体文件亦使用MGLTools软件打开，添加氢原子和电荷后，保存为pdbqt格式文件；打开网格盒，设置间距为1.000，设定网格点数，依据共结晶配体位置选定网格盒中心坐标，并保存为GPF文件。^15,16.

首先从 SciFinder 数据库中收集化学组分结构，并以 cdx 格式保存；使用 ChemBio3D Ultra 模块展示每个分子的三维结构，采用 MM2 力场进行能量优化，以 mol2 格式保存，并移除电荷参数。使用 AutoDock 时，通过 MGLTools 软件打开 mol2 格式文件，为配体添加氢原子和电荷，识别可旋转的化学键，并保存为 pdbqt 格式文件。采用 AutoDock Vina（版本 1.2.5）模型进行分子对接评估。

分子动力学模拟实验
使用 Gaussian 16 和 GaussView 6 软件对配体结构进行优化。将配体结构的 mol2 文件导入 GaussView 6 后，设置任务类型为优化（Optimization），目标分子状态选择基态（Ground State），计算方法采用密度泛函理论（DFT），自旋多重度设为默认值（Default Spin），泛函选用 B3LYP，溶剂模型采用 IEFPCM，溶剂设为水。完成分子结构优化后，使用 Gaussian 16 将生成的 chk 文件转换为 fch 文件，随后导入 Multiwfn 软件以计算配体的 RESP 电荷。

在计算 RESP 电荷后，将生成的 chg 文件导入 sobtop_1.0 (dev5) 软件，以生成分子动力学模拟所需的配体拓扑文件。使用 GROMACS 2019.6 软件结合 AMBER99 力场进行分子动力学模拟。将蛋白质分子和小分子的结构文件导入软件，建立周期性边界为 1.0 nm 的三斜盒子，并采用 TIP3P 水模型进行填充。采用粒子网格埃瓦尔德（Particle Mesh Ewald, PME）方法计算长程静电相互作用，并使用 gmx geion 命令引入适量的钠离子和氯离子以中和整个体系的电荷。模拟在恒定温度 298 K 和标准大气压 100 kPa 下进行。能量最小化采用最陡下降法（steepest descent method, steep）。使用 gmx grompp 和 gmx mdrun 命令执行 10,000 步的 NVT（等温等容系综）平衡和 NPT（等温等压系综）平衡，温度耦合常数和压力耦合常数分别设置为 0.1 ps 和 0.5 ps，平衡模拟时长为 100 ps。当体系达到平衡后，时间步长设为 2 fs，对复合物进行 10 ns 的分子动力学模拟，每 2 ps 保存一次轨迹数据。选择 10 ns 的生产模拟时长作为探索性模拟长度，旨在提供对接后的黄连碱–AChE 复合物在短时间尺度上的动态评估，而非进行详尽的构象采样。该设置用于评估对接所得复合物是否能在模拟过程中维持相对稳定的结合模式。进一步使用 gmx rms、gmx rmsf、gmx gyrate 和 gmx hbonds 命令计算均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、蛋白质回转半径、氢键以及溶剂可及表面积。采用 QTgrace 进行结果可视化。

动物实验验证
选取18只健康的新生Sprague-Dawley（SD）大鼠幼崽（出生后7天），性别不限。所有实验动物均饲养在特定病原体阴性（SPF）级动物实验设施中。该设施配备严格的屏障系统，可有效防止微生物和寄生虫的侵入。饲养室的环境参数由中央控制系统自动监测和调节：温度为22 ± 2 °C，相对湿度为55% ± 10%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗循环。采用经典Rice-Vannucci方法改良的新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型，以模拟脑性瘫痪（CP）的病理及行为特征。

简而言之，出生后第7天的大鼠幼崽使用2–3%异氟烷进行诱导麻醉，1–2%异氟烷维持麻醉。在达到充分麻醉后，行颈部正中切口，仔细分离左侧颈总动脉并予以永久性结扎。随后缝合切口，将幼崽置于加热垫上恢复1小时。接着，模型组和药根碱组的幼崽被置于含有8% O₂和92% N₂混合气体的缺氧舱中，在37 °C条件下暴露2小时，以诱导缺血缺氧性脑损伤。假手术组动物仅接受相同的麻醉和手术暴露操作，但不进行颈动脉结扎和缺氧处理。缺氧处理后，将幼崽放回母鼠身边，并在实验期间每日监测其一般状况、存活情况及摄食行为。

实验大鼠随机分为3组：假手术组：仅分离左侧颈总动脉，不进行结扎或缺氧处理，术后给予等体积溶剂；模型组：进行缺氧缺血性脑损伤造模手术，术后给予等体积溶剂；小檗碱组：造模后通过灌胃给予小檗碱（10 mg/kg）。小檗碱剂量（10 mg/kg）的选择基于 体内 基于先前报道的剂量 体内/黄连素的药代动力学研究¹⁷药物在连续14天的干预期间每天固定时间给药一次。

动物指标的检测
Morris水迷宫（MWM）实验设备由一个大型圆形水池（直径约150 cm）组成，池壁设有明显的视觉线索。池水呈不透明乳白色，并将水温控制在23 ± 1 °C。在目标象限中放置一个透明平台，平台位于水面下1–2 cm处。每天进行4次训练：将动物面朝池壁从池壁上的四个不同入水点依次放入水中，记录动物从入水到找到并爬上隐藏平台所需的时间，即"逃避潜伏期"。每次训练时长限制为60 s。若动物在60 s内找到平台，则允许其在平台上停留15 s以巩固记忆；若未找到，则将动物轻轻引导至平台并停留15 s。经过7天训练后，移除隐藏平台。将动物从原平台对侧的入水点放入水中，使其自由游泳60 s，由视频系统记录动物的游泳轨迹。通过MWM实验，记录平均逃避潜伏期、在目标象限停留时间以及穿越原平台位置的次数等指标。

进行激光散斑对比成像（LSCI）检测时：大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，暴露颅骨并保持湿润。使用激光散斑血流成像系统，在颅骨上方直接连续采集原始散斑图像30秒。通过专业软件将时空变化的散斑对比度转换为脑血流灌注单位（PU）分布图。进行定量分析时，根据病灶相关皮层灌注区域及可见的解剖标志，在每张图像中同侧半球暴露区域手动勾画皮层感兴趣区（ROI），并将该ROI内的平均灌注值用于组间比较。

采集脑组织，根据质量-体积比加入预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），在冰上进行机械匀浆，随后在4 °C条件下以8000 × g 离心10–15分钟，收集上清液用于检测。为保持组织形态，脑组织迅速放入4%多聚甲醛中固定，固定时间超过24小时。通过脱水、透明和石蜡包埋等步骤进行苏木精-伊红（HE）染色，并在光学显微镜下观察脑损伤程度。

为测定乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，按照试剂盒说明书收集损伤侧（同侧）半球的大脑皮层组织并进行匀浆。将组织样本在提取缓冲液中匀浆后，于4 °C条件下以8000 × g 离心10分钟，收集上清液用于分析。采用商用乙酰胆碱酯酶活性检测试剂盒（微量板/比色法）测定AChE活性。该检测基于AChE对乙酰胆碱的水解作用，随后与DTNB反应生成显色产物，于412 nm处测定吸光度以计算酶活性。由于该试剂盒为基于酶活性的比色法检测，而非传统的抗原定量酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，因此制造商未提供标准检测范围和分析灵敏度。本研究中，皮层组织测得的AChE活性值大约在25–80 nmol/min/mg蛋白范围内。

统计学分析
所有实验数据均以均值 ± 标准差（SD）表示，并使用 GraphPad Prism 软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验。对于莫里斯水迷宫实验，最终训练结果和探针试验参数采用单因素方差分析（ANOVA）后接 Tukey 多重比较检验进行分析。当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学意义¹⁸。感兴趣区域（ROI）的脑血流灌注与同侧大脑皮层乙酰胆碱酯酶（AChE）活性之间的相关性采用 Pearson 相关性分析进行评估。当 P < 0.05 时，认为相关性具有统计学意义。

结果

化学成分分析 C. chinensis 提取
生物碱是主要的积累成分，也是主要的活性成分 C. chinensis 药材。本研究采用色谱技术分析其中主要化学成分 C. chinensis (图1A）。如图所示 表1，所有八种分析物在其各自的校准范围内均表现出良好的线性关系。由于这些生物碱的含量和检测器响应差异较大，每种分析物的校准范围均被单独优化。图1B）。如图所示 表1，各化学成分的线性关系、线性范围及其他参数均良好，可同时用于化学成分的测定 C. chinensis.

代谢物

讨论

目前，已有多种方法和技术被开发用于脑部疾病的预防和治疗^20,21,22. 在本研究中，采用了一种综合策略 体外 筛选、计算模拟和 体内 验证被用于系统阐明该物质的基础及多靶点作用机制 C. chinensis 在改善由HIBD诱导的脑性瘫痪样症状方面。核心发现是，黄连碱（coptisine），一种黄连中的特征性生物碱， C. chinensis，而非含量最高的小檗碱，是强烈抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）并从而发挥神经保护和功能改善作用的关键活性成分。该发现不仅为传统药效提供了现代药理学注解 C. chinensis 在 "清热泻火" 通过作用于中枢神经系统的胆碱能靶点，不仅为开发基于天然产物的脑瘫治疗策略提供了有力的候选分子和科学依据。

首先，本研究中采用的亲和超滤与液相色谱联用技术为从复杂的生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	乙酰胆碱酯酶抑制活性检测
乙酰胆碱酯酶 (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	乙酰胆碱酯酶抑制活性检测
碘化乙酰硫代胆碱 (ATChI)	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	1037408	乙酰胆碱酯酶抑制活性检测
乙腈	赛默飞世尔科技公司	1162577	液相色谱流动相
AutoDock Vina	AutoDock	Version 1.2.5
小檗碱标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	110713-201814	化学成分分析
药根碱标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180712	化学成分分析
黄连碱标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180309	化学成分分析
E-916 加速溶剂萃取仪	Büchi Labortechnik AG, Switzerland	E916-008	正丁醇部位提取
表小檗碱标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180309	化学成分分析
甲酸	赛默飞世尔科技公司	1270563	液相色谱流动相
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
去甲异波尔定标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180615	化学成分分析
巴马汀标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180607	化学成分分析
木兰花碱标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180205	化学成分分析
甲醇	赛默飞世尔科技公司	1162578	液相色谱流动相
微孔滤膜	默克密理博公司	2139547	提取物过滤
巴马汀标准品	成都克洛玛生物科技有限公司	CHB180226	化学成分分析
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
碳酸钠	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	15138805	乙酰胆碱酯酶抑制活性检测
十二烷基硫酸钠 (SDS)	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	11019349	乙酰胆碱酯酶抑制活性检测