含 SAM 和 SH3 结构域的蛋白 1（SASH1）被确定为子痫前期（PE）中滋养层细胞凋亡和炎症的关键调控因子。胎盘来源的外泌体（P-EXOS）通过抑制 SASH1 表达，缓解缺氧诱导的损伤。这些发现揭示了子痫前期发病机制中的一个新途径，并提示 SASH1 可能是一个潜在的治疗靶点。
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研究文章
* These authors contributed equally
含 SAM 和 SH3 结构域的蛋白 1（SASH1）被确定为子痫前期（PE）中滋养层细胞凋亡和炎症的关键调控因子。胎盘来源的外泌体（P-EXOS）通过抑制 SASH1 表达，缓解缺氧诱导的损伤。这些发现揭示了子痫前期发病机制中的一个新途径，并提示 SASH1 可能是一个潜在的治疗靶点。
SASH1 是一种信号接头蛋白，参与细胞生长、凋亡和免疫调节，在肿瘤细胞和免疫细胞中的研究日益增多。新近证据表明，SASH1 在炎症反应和细胞稳态过程中发挥重要作用，而这些过程与子痫前期（PE）的发生发展密切相关。本研究旨在明确 SASH1 是否参与 PE 中滋养层细胞的凋亡和炎症反应，以及 P-EXOS 是否通过调控 SASH1 发挥保护作用。本研究分析了三个与 PE 相关的转录组数据集（GSE75010、GSE10588 和 GSE60438），以鉴定共有的差异表达基因（DEGs），随后进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。进一步应用机器学习算法筛选关键候选基因，并利用单细胞 RNA 测序数据解析胎盘组织中的细胞异质性，确定细胞类型特异性的表达模式。SASH1 被鉴定为一致性的候选基因，在 PE 样本的滋养层细胞中显著上调。体外实验中，构建了低氧处理的 HTR-8/SVneo 滋养层细胞模型，并结合 SASH1 沉默、SASH1 过表达以及与 P-EXOS 共培养。功能实验显示，SASH1 沉默显著抑制低氧诱导的滋养层细胞凋亡，并减少促炎性细胞因子（包括 IL-6、IL-1β 和 TNF-α）的分泌；而 SASH1 过表达则促进细胞凋亡和炎症反应。此外，P-EXOS 处理显著降低 SASH1 在 mRNA 和蛋白水平的表达，并减轻低氧诱导的滋养层细胞损伤，而 SASH1 过表达则在很大程度上消除了这些保护作用。综上所述，这些结果表明 SASH1 在 PE 的滋养层细胞凋亡和炎症反应中起关键作用。P-EXOS 可能通过抑制 SASH1 表达来缓解低氧诱导的滋养层细胞损伤，为 PE 的分子机制及潜在治疗靶点提供了新的见解。
子痫前期是一种妊娠期特有的多系统疾病，通常发生在妊娠20周以后，临床特征为高血压、蛋白尿及多器官功能障碍。该病至今仍是全球孕产妇及围产儿发病和死亡的主要原因之一1。尽管临床管理不断取得进展，子痫前期的最终治疗方法仍是胎盘娩出，这凸显了目前对其发病机制的理解尚不充分，迫切需要鉴定新的分子与细胞机制以及潜在的治疗靶点2,3。
滋养层细胞充分浸润并促进正常胎盘发育是子痫前期（PE）发病机制中的关键环节4。在正常妊娠过程中，滋养层细胞侵入子宫蜕膜并重塑螺旋动脉，建立低阻力、高容量的血流循环。滋养层细胞的浸润和迁移功能受损会导致胎盘灌注减少，从而造成持续的缺氧和氧化应激环境。缺氧直接影响细胞凋亡，而促炎介质的异常释放会破坏母胎界面的稳态，进一步加剧胎盘功能障碍5。炎症也是子痫前期的重要驱动因素。研究发现，子痫前期患者胎盘及外周血中IL-17、IL-6和TNF-α水平显著升高6。缺氧与炎症相互促进，形成恶性循环，放大全身性炎症反应，导致内皮损伤，并促成胎盘结构异常。目前，调控滋养层细胞凋亡和炎症反应的分子网络仍 largely 未知。
SASH1 是细胞内支架蛋白 SLy/SASH1 家族的成员，可作为信号接头蛋白发挥作用7。SASH1 主要被表征为一种肿瘤抑制因子，通过与 CRKL 及 PI3K-Akt-mTOR 信号通路等信号分子相互作用，抑制上皮-间质转化（EMT）、细胞迁移和侵袭8,9。除其肿瘤抑制功能外，新兴证据表明 SASH1 还参与炎症信号传导和免疫调控7。然而，SASH1 在胎盘中的表达与功能，特别是在滋养层细胞生物学及子痫前期（PE）背景下的作用，尚未得到研究。
外泌体已成为重要的细胞间介质，在妊娠相关研究中正受到越来越多的关注10。外泌体可转运多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质和非编码RNA，以调节受体细胞的功能。越来越多的证据表明，妊娠期外泌体（P-EXOS）在妊娠期间的免疫调节中发挥关键作用，且其活性和所携带的分子在子痫前期（PE）中发生显著改变，可能加剧炎症状态11。外泌体还被发现参与调控氧化应激12和血管生成13，可能对妊娠相关并发症产生有益影响。然而，其在子痫前期中的分子靶点及作用机制仍尚未完全阐明。
研究假设SASH1在子痫前期（PE）胎盘中表达失调，并作为滋养层细胞凋亡和炎症反应的关键驱动因子，而P-EXOS可能通过调控SASH1的表达对滋养层细胞损伤发挥保护作用。为验证该假设，整合了多个PE转录组数据集，并结合单细胞RNA测序数据与多算法机器学习方法，以鉴定关键候选基因。利用低氧处理的HTR-8/SVneo滋养层细胞模型及基于外泌体的干预实验，探究了SASH1在滋养层细胞功能障碍中的作用以及P-EXOS在子痫前期中的治疗潜力。
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伦理声明
本研究经石家庄市第四医院伦理委员会批准（批准号：20200031）。在样本采集前，已从所有胎盘组织捐献者处获得书面知情同意。所有涉及人类受试者的操作均遵循《赫尔辛基宣言》的规定。本实验方案所用试剂、耗材、仪器和软件的完整清单见材料表。
数据收集
RNA-seq 数据来自 GEO 数据库。数据集包括 GSE75010，其中包含来自 157 例子痫前期（PE）胎盘和 173 例非子痫前期（non-PE）胎盘的基因表达数据（N = 330）。GSE10588 包含来自 26 例正常胎盘和 17 例重度子痫前期胎盘的基因表达数据（N = 43）。GSE60438 包含子痫前期患者和血压正常妊娠者的底蜕膜转录组谱型数据（N = 125）。单细胞转录组数据来自 GEO 数据集 GSE183338，其中包括来自子痫前期及健康妊娠绒毛膜绒毛/母胎界面的单细胞核样本。
差异表达基因分析
与PE相关的差异表达基因（DEGs），首先对GSE75010、GSE10588和GSE60438数据集进行预处理和标准化。然后，基于样本分组信息，使用R软件包“limma”14进行差异分析。筛选标准为基因的p < 0.05 且 |log2FC| > 0.5。使用R软件包ggplot2绘制差异表达基因的火山图。利用R软件包pheatmap绘制前20个差异表达基因的热图。随后，取三个数据集中筛选出的差异表达基因的交集，并利用在线平台STRING构建候选基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，相互作用评分≥0.15。基于节点连接度，使用Cytoscape软件对PPI网络中的前20个枢纽基因（hub genes）进行进一步识别和排序。PPI网络结果通过Cytoscape软件或STRING进行可视化展示。
富集分析
使用 ClusterProfiler 和 DOSE 软件包结合 Metascape 网站进行基因富集分析。数据库来源于 GO 和 KEGG。采用“EnrichGO”功能进行富集分析。当通路的 p < 0.05 时，认为其富集结果具有显著性。使用“ggplot2”和“ggpubr”软件包对富集结果进行可视化展示。
机器学习
为了鉴定与子痫前期（PE）相关且具有稳健性和生物学意义的差异表达基因（DEGs），基于公开可用的转录组数据集GSE60438（平台：GPL6884）进行了多模型机器学习特征选择分析。该数据集包含在剖宫产期间采集的子痫前期孕妇和血压正常孕妇的底蜕膜样本的表达谱数据。对预筛选的差异表达基因进行标准化处理后，将表达矩阵及其相应的临床分组信息作为输入，用于四种不同的机器学习算法，以降低模型偏差并增强特征选择的稳定性。
四种算法同时应用，无特定顺序。使用“glmnet”包进行LASSO分析，以执行回归分析并筛选重要特征基因。在损失函数中添加了L1正则化项，该正则化项可将较不重要特征的系数压缩至零，从而实现特征选择。使用“e1071”包实现支持向量机递归特征消除（SVM-RFE），构建具有递归特征消除功能的支持向量机。首先使用支持向量机（SVM）训练一个分类器，然后根据特征权重迭代地移除信息量最少的特征，最终获得最优特征子集。使用“xgboost”包应用XGBoost方法构建多个决策树。每棵新树拟合前一棵树的残差，并将各树的加权输出累加以得到最终预测结果。使用“randomForest”包执行Boruta算法，生成与真实特征在随机森林训练过程中竞争的影子特征。保留重要性值显著高于随机噪声的特征。
单细胞转录组数据分析
单细胞转录组数据来自 GEO 数据库，原始计数矩阵取自 GSE183338。使用 Seurat 软件包中的“Read10X”函数导入计数矩阵，并将其转换为 dgCMatrix 格式。利用“merge”函数将各个对象合并为一个总体对象，并通过“RenameCells”使细胞标签唯一化。根据以下标准过滤低质量细胞：在少于三个细胞中表达的基因被剔除，表达基因数少于 200 的细胞被排除。对质量控制后的细胞进行标准化并鉴定高变基因。采用“LogNormalize”进行全局缩放标准化（缩放因子 = 10,000），使用“FindVariableFeatures”筛选出高变基因（n = 2,000），并通过“ScaleData”对数据进行缩放。基于高变特征进行主成分分析，并保留前 30 个主成分。使用 Harmony 方法校正样本间的批次效应。通过 UMAP 对细胞进行可视化和降维。基于 Louvain 算法，使用“FindNeighbors”和“FindClusters”构建共享最近邻图。“FindClusters”中的分辨率参数在 0.1 至 1 之间进行优化。利用“clustree”函数可视化聚类树，并选择分辨率为 0.9 来定义细胞簇。使用 Scrublet 算法去除潜在的双细胞（doublets）。通过“FindAllMarkers”函数识别差异表达的标记基因来注释细胞簇。采用非参数 Wilcoxon 秩和检验并进行 Bonferroni 校正。根据表面标志物、相关文献以及细胞分类数据库15确定细胞身份。
细胞培养
滋养层细胞系 HTR-8/SVneo 细胞在添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养。低氧条件通过将细胞置于 1% O₂、5% CO₂ 和 94% N₂ 环境中培养 24 小时建立；常氧对照组则维持在 20% O₂ 和 5% CO₂ 条件下16。所有细胞培养操作均应在 II 级生物安全柜中采用无菌技术进行。培养基、转染试剂和细胞废弃物应按照机构的生物安全指南进行处理。
细胞转染
合成含有 sh-SASH1、sh-NC、OE-SASH1 和 OE-NC 的质粒。将 HTR-8/SVneo 细胞以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔板中。随后，按照转染试剂生产商的说明，使用转染试剂将每孔 2 µg 的 sh-SASH1、sh-NC、OE-SASH1 或 OE-NC 质粒转染至细胞中。简言之，将质粒 DNA 和 P3000 试剂分别用 Opti-MEM 稀释，与另用 Opti-MEM 稀释的 Lipofectamine 3000 混合，室温孵育 15 分钟后，加入至融合度为 70–80% 的细胞中。转染 48 小时后，通过 RT-qPCR 和 Western blot 检测 SASH1 的表达水平。用于 SASH1 沉默的 shRNA 靶序列列于补充表 1中。
实时定量 PCR
采用反转录试剂盒从HTR-8/SVneo细胞中提取总RNA，并在42 °C下反转录30分钟，随后在85 °C下反应5分钟生成cDNA。使用SYBR Green预混液进行实时定量PCR（qPCR），反应条件如下：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟）。采用ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平，以内参基因β-actin作为标准化对照。本实验所用引物序列见补充表2。
Western印迹实验
使用裂解缓冲液从 HTR-8/SVneo 细胞中提取总蛋白。收集细胞裂解物，冰上孵育后，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 30 分钟，以去除不溶性碎片。采用分光光度计测定蛋白浓度。取等量蛋白（50 µg）进行 SDS-PAGE 分离，随后转移至 PVDF 膜上。用 5% 脱脂牛奶封闭膜后，于 4 °C 与一抗孵育过夜。洗涤后，将膜与相应的二抗孵育，使用增强型化学发光检测系统显影蛋白条带。
用于蛋白质检测的一抗包括抗SASH1和β-actin抗体。二抗选用相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体。以β-actin作为内参对照，确保各泳道蛋白上样量一致。使用ImageJ软件对蛋白质条带的强度进行测量和定量分析。
P-EXOS 的分离
从接受择期剖宫产的健康女性的足月胎盘中获取胎盘绒毛组织，并从中分离P-EXOS。将胎盘绒毛组织用无菌PBS充分洗涤，剪切成约1 mm3的碎片，然后在含10%外泌体耗尽型胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养48小时。收集条件培养基后进行差速离心：首先在4 °C下以300 × g离心10分钟，去除细胞和组织碎片；再以2,000 × g离心20分钟，去除细胞碎片；随后以10,000 × g离心30分钟，去除微囊泡，所有步骤均在4 °C下进行。将所得上清液在4 °C下以120,000 × g超速离心70分钟，沉淀外泌体。将沉淀用PBS洗涤一次后，再次在4 °C下以120,000 × g超速离心70分钟。最终沉淀重悬于PBS中。通过Western blot检测外泌体标志物（PLAP、CD63和TSG101，以GM130作为阴性对照）对分离的外泌体进行表征，并通过透射电子显微镜进行形态学观察。
P-EXOS 细胞摄取实验
为验证P-EXOS的细胞内化，根据制造商说明书，使用亲脂性膜染料PKH67对细胞外囊泡进行荧光标记。简言之，将P-EXOS与PKH67（4 µM）在稀释液C中室温孵育5分钟，随后加入等体积的1%牛血清白蛋白（BSA）终止反应。通过超速离心（120,000 × g，70分钟，4 °C）重新分离标记的细胞外囊泡，以去除未结合的染料。将PKH67标记的P-EXOS（50 µg/mL）加入HTR-8/SVneo细胞中，在常氧或低氧（1% O₂）条件下共孵育24小时。随后用PBS洗涤细胞三次，以4%多聚甲醛固定15分钟，并用DAPI（1 µg/mL）对细胞核进行复染。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；激发波长490 nm，发射波长502 nm）观察PKH67标记的细胞外囊泡的内化情况。在功能性共培养实验中，HTR-8/SVneo细胞在低氧条件（1% O₂）下，使用含10%无细胞外囊泡胎牛血清的完全RPMI-1640培养基，以50 µg/mL（蛋白当量）浓度的P-EXOS处理24小时。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
收集细胞培养上清液，根据制造商说明书，分别使用IL-6 ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒和TNF-α ELISA试剂盒检测IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算实际浓度。
末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）
根据制造商说明书，使用TUNEL检测试剂盒检测凋亡细胞。简言之，细胞在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，冰上用含0.1% Triton X-100的PBS处理5分钟以增加通透性，然后在37 °C避光条件下与TUNEL反应混合液孵育60分钟。细胞核用DAPI复染，通过荧光显微镜观察TUNEL阳性细胞，并通过计数每份样品至少五个随机视野中TUNEL阳性细胞所占百分比进行定量分析。
统计学分析
所有数据均使用 R 和 GraphPad Prism 进行分析。连续变量以均值 ± 标准差表示。两组之间的比较采用 Student t 检验，多组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。分类变量的统计学显著性通过卡方检验或 Fisher 精确检验进行评估。除非另有说明，分子间的相关性采用 Spearman 相关性分析计算。外泌体表征实验使用来自三位独立胎盘供体的 P-EXOS 进行。基于细胞的实验进行了三次独立的生物学重复，代表在不同时间点使用不同传代的 HTR-8/SVneo 细胞进行的独立实验，每次重复均使用来自不同胎盘供体的 P-EXOS。当 p < 0.05 时，认为具有统计学显著性。
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健康个体与子痫前期患者转录组分析
为分析正常（Normal）组与子痫前期（PE）患者之间的基因表达差异，采用R软件包limma对合并数据集进行差异表达分析。在GSE75010数据集中共鉴定出89个差异表达基因（DEGs）（p < 0.05 且 |log2FC| > 0.5），其中包括69个上调基因和20个下调基因（图1A）。GSE75049数据集中存在2,097个差异表达基因，其中1,121个上调，976个下调（图1B）。GSE60438数据集中有7,633个差异表达基因，包括3,371个上调基因和4,262个下调基因（图1C）。三个数据集中差异表达基因数量的显著差异可能反映了样本量、组织来源（胎盘绒毛与底蜕膜）以及子痫前期严重程度分类的不同，这也进一步凸显了通过取各数据集交集来识别稳定共有差异表达基因的重要性。
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本研究通过整合转录组分析、单细胞测序和多算法机器学习，鉴定出SASH1是子痫前期（PE）中一个关键的异常调控基因，这一发现尤为重要，因为目前尚无针对PE的靶向治疗手段17。研究证实，SASH1在缺氧滋养层细胞中显著上调，并在单细胞分辨率下显示在PE胎盘的滋养层细胞区室中特异性升高。通过基因功能缺失和功能获得实验，证实SASH1足以且必需驱动滋养层细胞凋亡及促炎性细胞因子的分泌。此外，P-EXOS处理可减轻缺氧诱导的滋养层细胞损伤，而SASH1过表达则消除了这一保护作用，表明P-EXOS介导的细胞保护作用在机制上依赖于SASH1的抑制。
此外，在子痫前期（PE）中观察到多种胎盘细胞类型比例的改变，包括B细胞/浆细胞、内皮细胞、成纤维细胞/基质细胞、巨噬细胞/树突状细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞以及滋养层细胞。这些发现表明，胎盘微环境在子痫前期期间经历了显著的重塑。这种炎症性微环境不仅会加剧滋养层细胞功能障碍，还可能通过免疫系统与细胞外基质之间的相互作用加速疾病进展18。此外，中性粒...
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本研究不存在利益冲突。
本研究由河北省卫生健康委员会医学科学研究重点计划项目（编号：20210075）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 培养基 | Gibco | 11875085 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 16140071 | |
| 外泌体耗竭型胎牛血清（Exosome-depleted FBS） | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂（含 P3000 试剂） | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Opti-MEM 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| SASH1 shRNA 质粒（HuSH） | origene | TL301836 | |
| SASH1 ORF 表达质粒 | origene | RC218866 | |
| 空载体对照 | origene | PS100001 | |
| 逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green 主混合液 | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| SASH1 引物 | Sangon Biotech | 定制合成 | |
| β-actin 引物 | Sangon Biotech | 定制合成 | |
| 细胞裂解液 | Beyotime | P0013B | |
| NanoDrop 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| PVDF 膜 | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| 抗 SASH1 抗体 | ABclonal | A15248 | |
| 抗-β-actin 抗体 | Abcam | ab6276 | |
| HRP 标记山羊抗兔/抗小鼠二抗 | Beyotime | A0208 | |
| ImageJ 软件 | NIH（公共领域） | ImageJ | |
| PKH67 绿色荧光细胞连接试剂盒（含稀释液 C） | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） | Leica | Leica TCS SP8 | |
| 人 IL-6 Quantikine ELISA 试剂盒 | R&D Systems | D6050B | |
| 人 IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY201 | |
| 人 TNF-α Quantikine ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DTA00D | |
| 酶标仪 | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| 原位细胞死亡检测试剂盒（TUNEL 检测试剂盒） | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| 多聚甲醛（4%） | Beyotime | P0099 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX53 | |
| 冷冻离心机（12,000 × g 容量） | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| 超速离心机（120,000 × g 容量） | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| R 软件 | R 基金会 | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad 软件 | v10.0 | |
| Seurat（R 程序包） | Satija 实验室（开源） | v4.0.4 | |
| Harmony（R 程序包，批次校正） | 开源 | v1.2.0 | |
| Scrublet（Python 程序包，双细胞检测） | 开源 | v0.2.3 | |
| clustree（R 程序包） | 开源 | v0.5.1 | |
| glmnet（R 程序包，LASSO） | 开源 | v4.1.8 | |
| e1071（R 程序包，SVM-RFE） | 开源 | v1.7-14 | |
| xgboost（R 程序包） | 开源 | v1.7.7.1 | |
| randomForest（R 程序包，Boruta） | 开源 | v4.7-1.1 | |
| 基因表达综合数据库（GEO） | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| STRING 数据库 | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Cytoscape 软件 | Cytoscape 联盟 | v3.10.4 | |
| ggplot2（R 程序包） | 开源 | v3.5.1 | |
| limma（R 程序包） | 开源 | v3.58.1 | |
| pheatmap（R 程序包） | 开源 | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler（R 程序包） | 开源 | v4.8.3 | |
| DOSE（R 程序包） | 开源 | v3.28.2 | |
| ggpubr（R 程序包） | 开源 | v0.6.0 |
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