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胎盘来源的外泌体通过SASH1缓解缺氧诱导的滋养层细胞凋亡和炎症进展

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DOI：

10.3791/71083

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2026年8月18日

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1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

含 SAM 和 SH3 结构域的蛋白 1（SASH1）被确定为子痫前期（PE）中滋养层细胞凋亡和炎症的关键调控因子。胎盘来源的外泌体（P-EXOS）通过抑制 SASH1 表达，缓解缺氧诱导的损伤。这些发现揭示了子痫前期发病机制中的一个新途径，并提示 SASH1 可能是一个潜在的治疗靶点。

摘要

SASH1 是一种信号接头蛋白，参与细胞生长、凋亡和免疫调节，在肿瘤细胞和免疫细胞中的研究日益增多。新近证据表明，SASH1 在炎症反应和细胞稳态过程中发挥重要作用，而这些过程与子痫前期（PE）的发生发展密切相关。本研究旨在明确 SASH1 是否参与 PE 中滋养层细胞的凋亡和炎症反应，以及 P-EXOS 是否通过调控 SASH1 发挥保护作用。本研究分析了三个与 PE 相关的转录组数据集（GSE75010、GSE10588 和 GSE60438），以鉴定共有的差异表达基因（DEGs），随后进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。进一步应用机器学习算法筛选关键候选基因，并利用单细胞 RNA 测序数据解析胎盘组织中的细胞异质性，确定细胞类型特异性的表达模式。SASH1 被鉴定为一致性的候选基因，在 PE 样本的滋养层细胞中显著上调。体外实验中，构建了低氧处理的 HTR-8/SVneo 滋养层细胞模型，并结合 SASH1 沉默、SASH1 过表达以及与 P-EXOS 共培养。功能实验显示，SASH1 沉默显著抑制低氧诱导的滋养层细胞凋亡，并减少促炎性细胞因子（包括 IL-6、IL-1β 和 TNF-α）的分泌；而 SASH1 过表达则促进细胞凋亡和炎症反应。此外，P-EXOS 处理显著降低 SASH1 在 mRNA 和蛋白水平的表达，并减轻低氧诱导的滋养层细胞损伤，而 SASH1 过表达则在很大程度上消除了这些保护作用。综上所述，这些结果表明 SASH1 在 PE 的滋养层细胞凋亡和炎症反应中起关键作用。P-EXOS 可能通过抑制 SASH1 表达来缓解低氧诱导的滋养层细胞损伤，为 PE 的分子机制及潜在治疗靶点提供了新的见解。

引言

子痫前期是一种妊娠期特有的多系统疾病，通常发生在妊娠20周以后，临床特征为高血压、蛋白尿及多器官功能障碍。该病至今仍是全球孕产妇及围产儿发病和死亡的主要原因之一1。尽管临床管理不断取得进展，子痫前期的最终治疗方法仍是胎盘娩出，这凸显了目前对其发病机制的理解尚不充分，迫切需要鉴定新的分子与细胞机制以及潜在的治疗靶点2,3。

滋养层细胞充分浸润并促进正常胎盘发育是子痫前期（PE）发病机制中的关键环节4。在正常妊娠过程中，滋养层细胞侵入子宫蜕膜并重塑螺旋动脉，建立低阻力、高容量的血流循环。滋养层细胞的浸润和迁移功能受损会导致胎盘灌注减少，从而造成持续的缺氧和氧化应激环境。缺氧直接影响细胞凋亡，而促炎介质的异常释放会破坏母胎界面的稳态，进一步加剧胎盘功能障碍5。炎症也是子痫前期的重要驱动因素。研究发现，子痫前期患者胎盘及外周血中IL-17、IL-6和TNF-α水平显著升高6。缺氧与炎症相互促进，形成恶性循环，放大全身性炎症反应，导致内皮损伤，并促成胎盘结构异常。目前，调控滋养层细胞凋亡和炎症反应的分子网络仍 largely 未知。

SASH1 是细胞内支架蛋白 SLy/SASH1 家族的成员，可作为信号接头蛋白发挥作用7。SASH1 主要被表征为一种肿瘤抑制因子，通过与 CRKL 及 PI3K-Akt-mTOR 信号通路等信号分子相互作用，抑制上皮-间质转化（EMT）、细胞迁移和侵袭8,9。除其肿瘤抑制功能外，新兴证据表明 SASH1 还参与炎症信号传导和免疫调控7。然而，SASH1 在胎盘中的表达与功能，特别是在滋养层细胞生物学及子痫前期（PE）背景下的作用，尚未得到研究。

外泌体已成为重要的细胞间介质，在妊娠相关研究中正受到越来越多的关注10。外泌体可转运多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质和非编码RNA，以调节受体细胞的功能。越来越多的证据表明，妊娠期外泌体（P-EXOS）在妊娠期间的免疫调节中发挥关键作用，且其活性和所携带的分子在子痫前期（PE）中发生显著改变，可能加剧炎症状态11。外泌体还被发现参与调控氧化应激12和血管生成13，可能对妊娠相关并发症产生有益影响。然而，其在子痫前期中的分子靶点及作用机制仍尚未完全阐明。

研究假设SASH1在子痫前期（PE）胎盘中表达失调，并作为滋养层细胞凋亡和炎症反应的关键驱动因子，而P-EXOS可能通过调控SASH1的表达对滋养层细胞损伤发挥保护作用。为验证该假设，整合了多个PE转录组数据集，并结合单细胞RNA测序数据与多算法机器学习方法，以鉴定关键候选基因。利用低氧处理的HTR-8/SVneo滋养层细胞模型及基于外泌体的干预实验，探究了SASH1在滋养层细胞功能障碍中的作用以及P-EXOS在子痫前期中的治疗潜力。

方案

伦理声明

本研究经石家庄市第四医院伦理委员会批准（批准号：20200031）。在样本采集前，已从所有胎盘组织捐献者处获得书面知情同意。所有涉及人类受试者的操作均遵循《赫尔辛基宣言》的规定。本实验方案所用试剂、耗材、仪器和软件的完整清单见材料表。

数据收集

RNA-seq 数据来自 GEO 数据库。数据集包括 GSE75010，其中包含来自 157 例子痫前期（PE）胎盘和 173 例非子痫前期（non-PE）胎盘的基因表达数据（N = 330）。GSE10588 包含来自 26 例正常胎盘和 17 例重度子痫前期胎盘的基因表达数据（N = 43）。GSE60438 包含子痫前期患者和血压正常妊娠者的底蜕膜转录组谱型数据（N = 125）。单细胞转录组数据来自 GEO 数据集 GSE183338，其中包括来自子痫前期及健康妊娠绒毛膜绒毛/母胎界面的单细胞核样本。

差异表达基因分析

与PE相关的差异表达基因（DEGs），首先对GSE75010、GSE10588和GSE60438数据集进行预处理和标准化。然后，基于样本分组信息，使用R软件包“limma”14进行差异分析。筛选标准为基因的p < 0.05 且 |log2FC| > 0.5。使用R软件包ggplot2绘制差异表达基因的火山图。利用R软件包pheatmap绘制前20个差异表达基因的热图。随后，取三个数据集中筛选出的差异表达基因的交集，并利用在线平台STRING构建候选基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，相互作用评分≥0.15。基于节点连接度，使用Cytoscape软件对PPI网络中的前20个枢纽基因（hub genes）进行进一步识别和排序。PPI网络结果通过Cytoscape软件或STRING进行可视化展示。

富集分析

使用 ClusterProfiler 和 DOSE 软件包结合 Metascape 网站进行基因富集分析。数据库来源于 GO 和 KEGG。采用“EnrichGO”功能进行富集分析。当通路的 p < 0.05 时，认为其富集结果具有显著性。使用“ggplot2”和“ggpubr”软件包对富集结果进行可视化展示。

机器学习

为了鉴定与子痫前期（PE）相关且具有稳健性和生物学意义的差异表达基因（DEGs），基于公开可用的转录组数据集GSE60438（平台：GPL6884）进行了多模型机器学习特征选择分析。该数据集包含在剖宫产期间采集的子痫前期孕妇和血压正常孕妇的底蜕膜样本的表达谱数据。对预筛选的差异表达基因进行标准化处理后，将表达矩阵及其相应的临床分组信息作为输入，用于四种不同的机器学习算法，以降低模型偏差并增强特征选择的稳定性。

四种算法同时应用，无特定顺序。使用“glmnet”包进行LASSO分析，以执行回归分析并筛选重要特征基因。在损失函数中添加了L1正则化项，该正则化项可将较不重要特征的系数压缩至零，从而实现特征选择。使用“e1071”包实现支持向量机递归特征消除（SVM-RFE），构建具有递归特征消除功能的支持向量机。首先使用支持向量机（SVM）训练一个分类器，然后根据特征权重迭代地移除信息量最少的特征，最终获得最优特征子集。使用“xgboost”包应用XGBoost方法构建多个决策树。每棵新树拟合前一棵树的残差，并将各树的加权输出累加以得到最终预测结果。使用“randomForest”包执行Boruta算法，生成与真实特征在随机森林训练过程中竞争的影子特征。保留重要性值显著高于随机噪声的特征。

单细胞转录组数据分析

单细胞转录组数据来自 GEO 数据库，原始计数矩阵取自 GSE183338。使用 Seurat 软件包中的“Read10X”函数导入计数矩阵，并将其转换为 dgCMatrix 格式。利用“merge”函数将各个对象合并为一个总体对象，并通过“RenameCells”使细胞标签唯一化。根据以下标准过滤低质量细胞：在少于三个细胞中表达的基因被剔除，表达基因数少于 200 的细胞被排除。对质量控制后的细胞进行标准化并鉴定高变基因。采用“LogNormalize”进行全局缩放标准化（缩放因子 = 10,000），使用“FindVariableFeatures”筛选出高变基因（n = 2,000），并通过“ScaleData”对数据进行缩放。基于高变特征进行主成分分析，并保留前 30 个主成分。使用 Harmony 方法校正样本间的批次效应。通过 UMAP 对细胞进行可视化和降维。基于 Louvain 算法，使用“FindNeighbors”和“FindClusters”构建共享最近邻图。“FindClusters”中的分辨率参数在 0.1 至 1 之间进行优化。利用“clustree”函数可视化聚类树，并选择分辨率为 0.9 来定义细胞簇。使用 Scrublet 算法去除潜在的双细胞（doublets）。通过“FindAllMarkers”函数识别差异表达的标记基因来注释细胞簇。采用非参数 Wilcoxon 秩和检验并进行 Bonferroni 校正。根据表面标志物、相关文献以及细胞分类数据库15确定细胞身份。

细胞培养

滋养层细胞系 HTR-8/SVneo 细胞在添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养。低氧条件通过将细胞置于 1% O₂、5% CO₂ 和 94% N₂ 环境中培养 24 小时建立；常氧对照组则维持在 20% O₂ 和 5% CO₂ 条件下16。所有细胞培养操作均应在 II 级生物安全柜中采用无菌技术进行。培养基、转染试剂和细胞废弃物应按照机构的生物安全指南进行处理。

细胞转染

合成含有 sh-SASH1、sh-NC、OE-SASH1 和 OE-NC 的质粒。将 HTR-8/SVneo 细胞以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔板中。随后，按照转染试剂生产商的说明，使用转染试剂将每孔 2 µg 的 sh-SASH1、sh-NC、OE-SASH1 或 OE-NC 质粒转染至细胞中。简言之，将质粒 DNA 和 P3000 试剂分别用 Opti-MEM 稀释，与另用 Opti-MEM 稀释的 Lipofectamine 3000 混合，室温孵育 15 分钟后，加入至融合度为 70–80% 的细胞中。转染 48 小时后，通过 RT-qPCR 和 Western blot 检测 SASH1 的表达水平。用于 SASH1 沉默的 shRNA 靶序列列于补充表 1中。

实时定量 PCR

采用反转录试剂盒从HTR-8/SVneo细胞中提取总RNA，并在42 °C下反转录30分钟，随后在85 °C下反应5分钟生成cDNA。使用SYBR Green预混液进行实时定量PCR（qPCR），反应条件如下：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟）。采用ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平，以内参基因β-actin作为标准化对照。本实验所用引物序列见补充表2。

Western印迹实验

使用裂解缓冲液从 HTR-8/SVneo 细胞中提取总蛋白。收集细胞裂解物，冰上孵育后，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 30 分钟，以去除不溶性碎片。采用分光光度计测定蛋白浓度。取等量蛋白（50 µg）进行 SDS-PAGE 分离，随后转移至 PVDF 膜上。用 5% 脱脂牛奶封闭膜后，于 4 °C 与一抗孵育过夜。洗涤后，将膜与相应的二抗孵育，使用增强型化学发光检测系统显影蛋白条带。

用于蛋白质检测的一抗包括抗SASH1和β-actin抗体。二抗选用相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体。以β-actin作为内参对照，确保各泳道蛋白上样量一致。使用ImageJ软件对蛋白质条带的强度进行测量和定量分析。

P-EXOS 的分离

从接受择期剖宫产的健康女性的足月胎盘中获取胎盘绒毛组织，并从中分离P-EXOS。将胎盘绒毛组织用无菌PBS充分洗涤，剪切成约1 mm3的碎片，然后在含10%外泌体耗尽型胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养48小时。收集条件培养基后进行差速离心：首先在4 °C下以300 × g离心10分钟，去除细胞和组织碎片；再以2,000 × g离心20分钟，去除细胞碎片；随后以10,000 × g离心30分钟，去除微囊泡，所有步骤均在4 °C下进行。将所得上清液在4 °C下以120,000 × g超速离心70分钟，沉淀外泌体。将沉淀用PBS洗涤一次后，再次在4 °C下以120,000 × g超速离心70分钟。最终沉淀重悬于PBS中。通过Western blot检测外泌体标志物（PLAP、CD63和TSG101，以GM130作为阴性对照）对分离的外泌体进行表征，并通过透射电子显微镜进行形态学观察。

P-EXOS 细胞摄取实验

为验证P-EXOS的细胞内化，根据制造商说明书，使用亲脂性膜染料PKH67对细胞外囊泡进行荧光标记。简言之，将P-EXOS与PKH67（4 µM）在稀释液C中室温孵育5分钟，随后加入等体积的1%牛血清白蛋白（BSA）终止反应。通过超速离心（120,000 × g，70分钟，4 °C）重新分离标记的细胞外囊泡，以去除未结合的染料。将PKH67标记的P-EXOS（50 µg/mL）加入HTR-8/SVneo细胞中，在常氧或低氧（1% O₂）条件下共孵育24小时。随后用PBS洗涤细胞三次，以4%多聚甲醛固定15分钟，并用DAPI（1 µg/mL）对细胞核进行复染。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；激发波长490 nm，发射波长502 nm）观察PKH67标记的细胞外囊泡的内化情况。在功能性共培养实验中，HTR-8/SVneo细胞在低氧条件（1% O₂）下，使用含10%无细胞外囊泡胎牛血清的完全RPMI-1640培养基，以50 µg/mL（蛋白当量）浓度的P-EXOS处理24小时。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

收集细胞培养上清液，根据制造商说明书，分别使用IL-6 ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒和TNF-α ELISA试剂盒检测IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算实际浓度。

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）

根据制造商说明书，使用TUNEL检测试剂盒检测凋亡细胞。简言之，细胞在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，冰上用含0.1% Triton X-100的PBS处理5分钟以增加通透性，然后在37 °C避光条件下与TUNEL反应混合液孵育60分钟。细胞核用DAPI复染，通过荧光显微镜观察TUNEL阳性细胞，并通过计数每份样品至少五个随机视野中TUNEL阳性细胞所占百分比进行定量分析。

统计学分析

所有数据均使用 R 和 GraphPad Prism 进行分析。连续变量以均值 ± 标准差表示。两组之间的比较采用 Student t 检验，多组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。分类变量的统计学显著性通过卡方检验或 Fisher 精确检验进行评估。除非另有说明，分子间的相关性采用 Spearman 相关性分析计算。外泌体表征实验使用来自三位独立胎盘供体的 P-EXOS 进行。基于细胞的实验进行了三次独立的生物学重复，代表在不同时间点使用不同传代的 HTR-8/SVneo 细胞进行的独立实验，每次重复均使用来自不同胎盘供体的 P-EXOS。当 p < 0.05 时，认为具有统计学显著性。

结果

健康个体与子痫前期患者转录组分析

为分析正常（Normal）组与子痫前期（PE）患者之间的基因表达差异，采用R软件包limma对合并数据集进行差异表达分析。在GSE75010数据集中共鉴定出89个差异表达基因（DEGs）（p < 0.05 且 |log2FC| > 0.5），其中包括69个上调基因和20个下调基因（图1A）。GSE75049数据集中存在2,097个差异表达基因，其中1,121个上调，976个下调（图1B）。GSE60438数据集中有7,633个差异表达基因，包括3,371个上调基因和4,262个下调基因（图1C）。三个数据集中差异表达基因数量的显著差异可能反映了样本量、组织来源（胎盘绒毛与底蜕膜）以及子痫前期严重程度分类的不同，这也进一步凸显了通过取各数据集交集来识别稳定共有差异表达基因的重要性。

差异表达基因的功能富集分析

为了系统性地鉴定与子痫前期（PE）相关的关键差异表达基因（DEGs），对来自 GSE75010、GSE10588 和 GSE60438 PE 数据集的差异表达基因进行了维恩分析，最终确定了 56 个共有差异表达基因（图 2A）。利用在线平台 STRING（相互作用评分 ≥0.15）构建了这 56 个共有差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并基于其在网络中的连接度，使用 Cytoscape 软件进一步鉴定出前 20 个枢纽基因（图 2B）。基于这些基因，还进行了 GO 富集分析，以探索其在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）中的潜在功能（图 2C）。差异表达基因最可能富集于激素分泌以及跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路的调控。在细胞层面，这些基因主要定位于黏着斑、细胞-基质连接部位，以及多种与囊泡和溶酶体相关的基因。在分子功能方面，富集的条目包括脯氨酰羟化酶活性、激素活性以及脂质相关分子的跨膜转运。这些结果提示，差异表达基因可能在胎盘细胞信号传导、细胞-基质相互作用以及内分泌相关功能维持中发挥重要作用。同时发现，KEGG 通路富集分析显示差异表达基因最可能富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞黏附分子相互作用，以及 TGF-β 和 HIF-1 信号通路（图 2D）。某些病毒相关条目（如 Hepatitis viruses、Ebolavirus）的富集可能反映了与共有的免疫调节基因的非特异性重叠，而非与 PE 存在直接的生物学关联；因此，解释时仍应重点关注炎症、黏附和缺氧相关通路。这些通路与炎症反应、细胞黏附介导的信号传导以及缺氧相关信号通路有关，可能通过改变胎盘微环境中的免疫-炎症状态和细胞间通讯，影响 PE 的进展。

机器学习鉴定出SASH1为子痫前期的关键基因

为鉴定关键预后基因，采用了四种机器学习方法进行特征筛选。通过交叉验证的LASSO回归分析显示，当log(λ.min) = -3.8075时，模型达到最小交叉验证误差。在此λ值下具有非零系数的基因被选为LASSO方法识别的关键特征（图3A–B）。Boruta算法通过与影子特征（shadow features）比较来评估特征重要性。重要性值高于shadowMax的基因被标记为“Confirmed”（已确认），视为关键候选基因；而重要性值低于shadowMin的基因被标记为“Rejected”（被拒绝），认为其无显著贡献；介于这两个阈值之间的基因则被标记为“Tentative”（待定），表示具有潜在但不确定的重要性（图3C）。SVM-RFE分析表明，当保留40–50个特征时，交叉验证准确率达到最高或接近最高水平，提示在此特征数量下模型具有最优预测性能（图3D）。中等水平的交叉验证准确率（约0.6）表明，单一算法在本数据集上均未表现出最优性能，因此采用多算法交集策略以增强特征筛选的稳健性。XGBoost通过Gain值量化各基因的相对重要性，从而识别出对模型预测贡献较高的特征（图3E）。对四种方法结果进行Venn交集分析，发现SASH1是唯一重叠的基因。尽管Boruta算法将SASH1归类为“Tentative”（待定），但它在其余三种算法中均被一致选中，支持将其认定为共识候选基因（图3F）。

单细胞分析

研究了早发型子痫前期（PE）胎盘组织中的细胞异质性及分子过程。根据检测到的基因数量、RNA计数数量以及线粒体基因表达所占百分比对细胞进行质量筛选。剔除低质量细胞（检测到的基因少于200个，或线粒体基因含量超过20%的细胞），以获得高质量的单细胞样本用于后续分析。质量控制指标及高变基因的鉴定结果如补充图1A–B所示。在完成数据标准化并鉴定出高变基因后，使用前2,000个高变基因进行主成分分析（PCA），并通过JackStraw分析和ElbowPlot分析确定具有显著性的主成分（补充图2A–B）。

基于主成分分析，采用均匀流形近似与投影（UMAP）方法进行降维和无监督聚类，将所有细胞划分为22个聚类，凸显了胎盘组织中高度的细胞异质性（图4A）。通过分析各聚类特异性标记基因的表达，并在热图中可视化差异表达基因（DEGs）（图4B），依据经典标记基因对每个聚类进行注释，并将其投影回UMAP嵌入图中（图4C）。根据这些主要的胎盘细胞群体，鉴定出B细胞/浆细胞、内皮细胞、成纤维细胞/基质细胞、巨噬细胞/树突状细胞、自然杀伤细胞、T细胞以及滋养层细胞。对照组与子痫前期（PE）组之间的比较显示，多种细胞类型在PE胎盘中的相对分布发生显著变化，提示胎盘微环境发生了重塑（图4D）。

组织来源和疾病状态用于基于组织来源（蜕膜 vs. 绒毛）和疾病分组（对照 vs. 子痫前期）在相同的UMAP图中追踪细胞图4E）。细胞数量分布在一定程度上按组织来源分离，而不同疾病组的细胞则高度相互交错。这表明子痫前期并未显著改变整个转录组结构，但可能对特定细胞亚群或某些分子特征产生影响。SASH1 的表达被映射到 UMAP 上，以探究其在胎盘细胞群体中的分布情况（图4F–G）。SASH1 呈现强烈的细胞类型特异性表达，在蜕膜和绒毛细胞群体之间存在显著差异。在不同细胞类型中对 PE 组与对照组之间的 SASH1 表达进行统计学比较（Wilcoxon 秩和检验），发现多个胎盘细胞群体中存在显著差异，其中在 PE 样本的滋养层细胞中升高最为显著（图4H这一发现提供了单细胞水平的证据，表明SASH1的失调在滋养层细胞区室中尤为显著，支持后续功能实验采用HTR-8/SVneo滋养层细胞系。

SASH1 沉默抑制缺氧诱导的滋养层细胞凋亡和炎症反应

为验证生物信息学预测结果，本研究在低氧条件（1% O2）下建立了与子痫前期（PE）相关的滋养层细胞模型。通过qPCR和Western blot分析检测SASH1的表达水平（图5A–B）。与常氧状态下的HTR-8/SVneo细胞相比，低氧处理的细胞中SASH1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高，初步在实验层面验证了生物信息学分析结果。为评估SASH1敲低对PE相关病理过程的影响，在低氧处理的HTR-8/SVneo细胞中对SASH1进行了沉默。定量PCR和Western blot分析（图5C–D）显示，与sh-NC组相比，所有sh-SASH1组的SASH1表达均显著降低。其中，sh-SASH1#3的敲低效率最高，因此被选用于后续实验。在三种条件下进行TUNEL染色和ELISA检测：常氧对照组（Normal）、低氧联合阴性对照shRNA组（Hypoxia + sh-NC）以及低氧联合SASH1敲低组（Hypoxia + sh-SASH1）。与Normal组相比，Hypoxia + sh-NC组的细胞凋亡显著增加，促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平也显著升高，证实了低氧可诱导滋养层细胞损伤。而SASH1敲低显著缓解了上述效应，使细胞凋亡（图5E）和细胞因子水平（图5F）恢复至接近Normal组的水平，提示SASH1敲低可在很大程度上逆转低氧诱导的滋养层细胞凋亡和炎症反应。为进一步明确SASH1的因果作用，开展了功能获得性实验。qPCR和Western blot证实HTR-8/SVneo细胞中SASH1成功过表达（图5G–H）。在常氧条件下，与OE-NC组相比，SASH1过表达（OE-SASH1）显著增加了滋养层细胞的凋亡及促炎性细胞因子的分泌，重现了低氧诱导的表型（图5I–J）。综上所述，功能缺失与功能获得实验结果共同表明，SASH1在驱动滋养层细胞凋亡和炎症反应中既必要又充分，证实其在PE相关病理过程中具有因果作用。

P-EXOS 通过调控 SASH1 抑制缺氧诱导的滋养层细胞凋亡和炎症反应

P-EXOS 被认为在子痫前期（PE）中具有潜在的治疗价值。本研究中，生物信息学分析表明 SASH1 与外泌体相关信号通路相关（如 GO 和 KEGG 富集分析所示，图 2C–D），由此我们提出假设：P-EXOS 可能通过调控 SASH1 在 PE 中发挥保护作用。在进行功能研究之前，首先对分离得到的 P-EXOS 进行了表征。Western blot 分析证实了外泌体标志蛋白 PLAP、CD63 和 TSG101 的存在，而高尔基体标志物 GM130 无明显表达，表明所分离囊泡具有较高的纯度。透射电子显微镜进一步显示典型的杯状囊泡结构（图 6A–B）。为验证 P-EXOS 是否可被靶细胞高效内化，我们进行了免疫荧光染色以评估其细胞摄取情况。与对照组相比，经 P-EXOS 处理的 HTR-8/SVneo 细胞在合并图像中显示出明显的共定位信号，表明 P-EXOS 能有效被 HTR-8/SVneo 细胞内化（图 6C）。

随后，在缺氧条件下将HTR-8/SVneo细胞与P-EXOS共培养。定量PCR和Western blot检测结果显示，与对照组相比，P-EXOS处理组中SASH1的mRNA和蛋白水平均显著降低（图6D–E），初步证明P-EXOS与SASH1之间存在调控相互作用。与上述分子变化一致，TUNEL染色显示，经P-EXOS处理后，HTR-8/SVneo细胞中缺氧诱导的细胞凋亡明显减轻（图6F）。同时，ELISA检测表明，促炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌显著减少（图6G）。

为了确定P-EXOS的保护作用在机制上是否依赖于SASH1的抑制，我们在缺氧条件下进行了挽救实验。将过表达SASH1的细胞（OE-SASH1 + P-EXOS）与阴性对照细胞（OE-NC + P-EXOS）进行比较。SASH1的过表达显著消除了P-EXOS的保护作用，表现为细胞凋亡增加（图6H）以及促炎性细胞因子分泌升高（图6I），相较于OE-NC + P-EXOS组更为明显。这些结果表明，P-EXOS的保护作用是通过特异性抑制SASH1介导的，而非通过平行通路，凸显了P-EXOS在子痫前期（PE）治疗中的潜在应用价值。

数据可用性：

支持本研究发现的数据集为公开获取，来源于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），登录号分别为 GSE75010、GSE10588、GSE60438 和 GSE183338。细胞类型注释参考了细胞分类数据库（https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/）。未裁剪的蛋白质印迹图像以及支持本研究发现的所有其他原始实验数据均提供在补充原始数据文件夹中。

火山图和热图展示了不同数据集中的基因表达分析结果。
图 1：在三个独立数据集中识别子痫前期胎盘和蜕膜组织中的差异表达基因（DEGs）。（A）来自整合GSE75010数据集的157例子痫前期胎盘样本与173例非子痫前期胎盘样本之间差异表达基因的火山图。（B）来自GSE10588数据集的重度子痫前期胎盘样本（n = 17）与正常胎盘样本（n = 26）之间的差异表达基因火山图。（C）来自GSE60438数据集的子痫前期蜕膜样本与血压正常对照组蜕膜样本之间的差异表达基因火山图。差异表达基因的筛选标准为 p < 0.05 且 |log2FC| > 0.5。请点击此处查看该图的高清版本。

维恩图、网络图、弦图；基因表达分析、蛋白质相互作用作图。
图 2：与子痫前期相关的共同差异表达基因的功能富集分析及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。（A）来自子痫前期相关数据集 GSE75010、GSE10588 和 GSE60438 的差异表达基因（DEG）的维恩图。（B）基于连接度从56个共同差异表达基因中筛选出的前20个枢纽基因的PPI网络，使用Cytoscape软件进行排序（STRING相互作用评分 ≥0.15）。（C）共同差异表达基因的GO和KEGG富集分析以柱状图形式展示。（D）共同差异表达基因的GO和KEGG富集分析以弦图形式展示。请点击此处查看该图的高清版本。

基因筛选方法；LASSO、XGBoost、SVM、Boruta 结果；比较数据分析图表。
图3：基于机器学习的子痫前期相关候选枢纽基因筛选。（A）LASSO 回归分析显示候选基因的系数分布。（B）通过交叉验证的 LASSO 回归选择最优正则化参数（λ）。（C）Boruta 算法结果。（D）SVM-RFE 分析。（E）XGBoost 算法结果。（F）Venn 图显示由 LASSO、Boruta、SVM-RFE 和 XGBoost 算法共同识别出的候选基因交集。缩写：LASSO = least absolute shrinkage and selection operator；SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination。请点击此处查看该图的高清版本。

展示细胞类型数据分析与分布的UMAP聚类图及基因表达热图。
图4：单细胞转录组分析揭示子痫前期中细胞类型特异性的SASH1表达模式。（A）单细胞数据集的UMAP聚类图。（B）子痫前期单细胞转录组数据集GSE183338的前五种标志物注释分析。（C）细胞亚群的注释。（D）条形图显示对照组与子痫前期样本中细胞比例的分布情况。（E）按组织来源（蜕膜和绒毛）和疾病状态（对照和子痫前期）着色的UMAP图。（F）按组织来源（蜕膜和绒毛）分组的胎盘细胞群体中SASH1表达的UMAP图。（G）按疾病状态（对照和子痫前期）分组的胎盘细胞群体中SASH1表达的UMAP图。（H）小提琴图显示SASH1在不同胎盘细胞类型中的表达分布。ns p > 0.05；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。缩写：UMAP = 均匀流形近似与投影；ns = 无显著性差异。请点击此处查看该图的高清版本。

缺氧条件下SASH1的表达；采用蛋白质印迹法进行蛋白质分析；基因/蛋白质表达图谱。
图5SASH1 调控缺氧诱导的滋养层细胞凋亡和炎症反应 (A) 正常和缺氧条件下 HTR-8/SVneo 细胞中 SASH1 mRNA 表达的 qPCR 分析及 SASH1 蛋白水平的密度计量定量。B) 与 (A) 中所示密度测定数据相对应的代表性 Western 印迹图像。C) 转染sh-NC或sh-SASH1质粒（sh-SASH1#1、sh-SASH1#2和sh-SASH1#3）的缺氧处理HTR-8/SVneo细胞中SASH1 mRNA表达的qPCR分析及SASH1蛋白水平的密度计量学定量 (D) 与 (C) 中所示密度测定数据相对应的代表性 Western 印迹图像。E正常组、缺氧+sh-NC组及缺氧+sh-SASH1(#3)组HTR-8/SVneo细胞的TUNEL染色。比例尺 = 20 µm. (F) 正常组、缺氧 + sh-NC 组和缺氧 + sh-SASH1(#3) 组中炎症性细胞因子（IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的 ELISA 分析。G) 转染 OE-NC 或 OE-SASH1 质粒的 HTR-8/SVneo 细胞中 SASH1 mRNA 表达的 qPCR 分析及 SASH1 蛋白水平的密度计量学定量。H) 与 (G) 中所示密度测定数据对应的代表性 Western 印迹图像。I正常 + OE-NC组和正常 + OE-SASH1组HTR-8/SVneo细胞的TUNEL染色。比例尺 = 20 µm. (J) 正常 + OE-NC 组与正常 + OE-SASH1 组中炎症细胞因子（IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的 ELISA 分析。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。数据来自三次独立的生物学重复实验（n = 3），以均值 ± 标准差表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Western blot、透射电镜图像和荧光显微镜检测P-EXO对蛋白水平和凋亡的影响。
图6P-EXOS 通过抑制 SASH1 缓解缺氧诱导的滋养层细胞损伤 (A) PLAP、CD63和TSG101的Western blot分析以检测P-EXOS标志蛋白，GM130作为阴性对照。B) P-EXOS 形态的透射电子显微镜（TEM）分析。比例尺 = 1.0 µm. (C共聚焦激光扫描显微镜图像显示HTR-8/SVneo细胞（红色）对PKH67标记的P-EXOS（绿色）的摄取。细胞核用DAPI复染（蓝色）。比例尺 = 20 µm. (D) 对照组和P-EXOS组HTR-8/SVneo细胞中SASH1 mRNA表达的qPCR分析及SASH1蛋白水平的密度定量。 (E) 与 (D) 中所示密度测定数据相对应的代表性 Western 印迹图像。F) 对照组和P-EXOS组HTR-8/SVneo细胞的TUNEL染色。比例尺 = 20 µm. (G) 对照组和P-EXOS组中经缺氧处理的HTR-8/SVneo细胞内炎症细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的ELISA分析。H) OE-NC + P-EXOS 和 OE-SASH1 + P-EXOS 组中 HTR-8/SVneo 细胞的 TUNEL 染色。比例尺 = 20 µm. (I) 对OE-NC + P-EXOS组和OE-SASH1 + P-EXOS组中经缺氧处理的HTR-8/SVneo细胞进行炎症细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的ELISA分析。缩写：P-EXOS = 胎盘来源外泌体；TEM = 透射电子显微镜；PLAP = 胎盘碱性磷酸酶；TSG101 = 肿瘤易感基因101。*p < 0.05; **p < 0.01. 数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值 ± 标准差（n = 3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：单细胞RNA测序数据的质量控制。（A）质量控制后基因表达水平的小提琴图。（B）变异特征图，显示质量控制后鉴定出的高变基因。请点击此处下载该文件。

补充图 2：单细胞聚类中具有统计学意义的主成分的确定。（A）使用 JackStraw 点图识别具有统计学意义的主成分。（B）肘部点图显示各主成分解释的方差。请点击此处下载该文件。

补充表 1：用于 SASH1 沉默的 shRNA 靶序列。 用于基因沉默的阴性对照（sh-NC）及三种靶向 SASH1 的构建体（sh-SASH1#1、sh-SASH1#2 和 sh-SASH1#3）的 shRNA 靶序列（5′–3′）。请点击此处下载该文件。

补充表 2：定量 PCR 所用引物序列。 在 qPCR 分析中使用的 SASH1 和 β-actin（内参对照）的正向与反向引物序列（5′–3′）。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究通过整合转录组分析、单细胞测序和多算法机器学习，鉴定出SASH1是子痫前期（PE）中一个关键的异常调控基因，这一发现尤为重要，因为目前尚无针对PE的靶向治疗手段17。研究证实，SASH1在缺氧滋养层细胞中显著上调，并在单细胞分辨率下显示在PE胎盘的滋养层细胞区室中特异性升高。通过基因功能缺失和功能获得实验，证实SASH1足以且必需驱动滋养层细胞凋亡及促炎性细胞因子的分泌。此外，P-EXOS处理可减轻缺氧诱导的滋养层细胞损伤，而SASH1过表达则消除了这一保护作用，表明P-EXOS介导的细胞保护作用在机制上依赖于SASH1的抑制。

此外，在子痫前期（PE）中观察到多种胎盘细胞类型比例的改变，包括B细胞/浆细胞、内皮细胞、成纤维细胞/基质细胞、巨噬细胞/树突状细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞以及滋养层细胞。这些发现表明，胎盘微环境在子痫前期期间经历了显著的重塑。这种炎症性微环境不仅会加剧滋养层细胞功能障碍，还可能通过免疫系统与细胞外基质之间的相互作用加速疾病进展18。此外，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）最近被认为在加重子痫前期胎盘炎症中发挥重要作用19。SASH1 被认为通过参与炎症信号传导、细胞黏附以及缺氧相关过程，在子痫前期的发生发展中起着重要作用。在本研究中，使用 limma 软件包从子痫前期患者和血压正常孕妇的胎盘样本中提取基因表达谱，并应用多种机器学习算法——LASSO 回归、SVM-RFE、XGBoost 和 Boruta 进行特征筛选。在所有算法中，SASH1 均一致地被识别为共识候选基因。在单细胞水平上，SASH1 在不同胎盘细胞群体中呈现细胞类型特异性表达，并在子痫前期样本中维持较高表达水平，其中在滋养层细胞中的差异最为显著，提示其可能在不同的胎盘细胞环境中发挥独特功能作用。

SASH1 是一种信号衔接蛋白，已被报道参与多种生物学过程，包括细胞迁移与侵袭、上皮-间质转化以及应激反应性信号调控8,9。为探究 SASH1 在子痫前期（PE）相关病理过程中的功能作用，本研究利用 HTR-8/SVneo 细胞建立了缺氧诱导的滋养层细胞模型。实验结果表明，缺氧暴露显著上调了 SASH1 的表达水平，而敲低 SASH1 可明显减轻缺氧诱导的细胞凋亡，并减少促炎性细胞因子（包括 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的分泌。相反，在常氧条件下过表达 SASH1 足以重现缺氧诱导的表型，从而确立了 SASH1 在驱动滋养层细胞损伤中的因果作用。这些发现提示，SASH1 可能通过调控炎症反应对滋养层细胞功能状态产生负向调节作用。鉴于滋养层细胞是胎盘炎症介质的主要来源之一20，SASH1 表达异常可能构成子痫前期中炎症放大效应的关键分子基础。值得注意的是，SASH1 在滋养层细胞中所表现出的促凋亡和促炎功能，与其在肿瘤细胞中经典的抑癌作用形成对比——在癌症细胞中，SASH1 通常抑制 EMT 及细胞迁移8,9。这种依赖于细胞环境的功能双重性，可能反映了不同细胞类型中 SASH1 相互作用蛋白及其下游信号网络的特异性差异，有待进一步研究。

外泌体被认为是细胞间通讯的重要介质，并与子痫前期（PE）的发病机制相关21。特别是妊娠期来源的外泌体（P-EXOS）可能在正常妊娠期间的免疫调节中发挥重要作用，例如维持母-胎免疫耐受，这可能对子痫前期具有保护作用22。本研究中，生物信息学分析揭示了SASH1与外泌体相关信号通路之间的关联，促使我们进一步探究P-EXOS在调控滋养层细胞功能中的作用。共培养实验表明，经P-EXOS处理后，缺氧条件下滋养层细胞中的SASH1 mRNA和蛋白水平显著降低，并明显减轻了缺氧诱导的细胞凋亡和炎症反应。更重要的是，SASH1的过表达消除了这些保护作用，证实P-EXOS介导的细胞保护作用在机制上依赖于SASH1的抑制，而非通过平行通路发挥作用。

P-EXOS 抑制 SASH1 表达的分子机制仍有待阐明。已知 P-EXOS 携带多种生物活性 cargo，包括 microRNA、蛋白质和脂质，可调节受体细胞中的基因表达10。一种可能是 P-EXOS 递送特定的 miRNA，直接或间接靶向 SASH1。另一种可能是 P-EXOS 调控上游信号通路（如 NF-κB 或 PI3K-Akt），从而影响 SASH1 的转录调控。鉴于 SASH1 已被证实在癌细胞中参与 PI3K-Akt-mTOR 通路8，因此外泌体介导的该信号轴的调节可能有助于滋养层细胞中 SASH1 的下调。未来需要通过外泌体 cargo 测序和通路特异性抑制剂实验，以解析 P-EXOS 调控 SASH1 表达的精确分子级联过程。

在本研究中，通过整合转录组学分析与单细胞RNA测序技术，探究了子痫前期（PE）胎盘组织中的分子变化。结果表明，SASH1在缺氧诱导的滋养层细胞凋亡及炎症反应中发挥关键作用，而P-EXOS可通过抑制SASH1的表达产生保护效应，为理解PE的分子机制提供了新的视角，并提示了一种潜在的治疗策略。然而，本研究仍存在若干局限性。第一，功能研究结果主要来源于HTR-8/SVneo永生化滋养层细胞系，尚需在原代滋养层细胞中进行验证。第二，未通过免疫组织化学方法在临床PE胎盘组织中验证SASH1蛋白的表达水平，限制了研究结果的转化解读，应在后续研究中予以补充。第三，SVM-RFE分类器的交叉验证准确率中等（约0.6），反映出数据集固有的异质性；未来需要更大规模的独立队列以构建更为稳健的诊断模型。第四，P-EXOS抑制SASH1表达的具体分子机制尚不明确。第五，在SASH1的Western blot检测中观察到非特异性杂交条带，可能源于抗体特异性欠佳；本实验所用抗体为多克隆抗体，其在免疫检测中的特异性通常低于单克隆抗体。尽管如此，这些非特异性条带并不影响SASH1蛋白的检测结果及本研究的结论。未来研究应结合 体内 需要开展实验研究、临床样本分析以及外泌体内容物表征，以进一步阐明P-EXOS-SASH1轴在子痫前期中的功能作用，并评估其转化应用潜力。

披露

本研究不存在利益冲突。

致谢

本研究由河北省卫生健康委员会医学科学研究重点计划项目（编号：20210075）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI-1640 培养基Gibco11875085
胎牛血清（FBS）Gibco16140071
外泌体耗竭型胎牛血清（Exosome-depleted FBS）System BiosciencesEXO-FBS-50A-1
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific, CN15140122
Lipofectamine 3000 转染试剂（含 P3000 试剂）Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
Opti-MEM 低血清培养基Thermo Fisher Scientific, CN31985070
SASH1 shRNA 质粒（HuSH）origeneTL301836
SASH1 ORF 表达质粒origeneRC218866
空载体对照origenePS100001
逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific, CN4368814
PowerUp SYBR Green 主混合液Thermo Fisher Scientific, CNA46110
SASH1 引物Sangon Biotech定制合成
β-actin 引物Sangon Biotech定制合成
细胞裂解液BeyotimeP0013B
NanoDrop 分光光度计Thermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
PVDF 膜Thermo Fisher Scientific, CN88518
抗 SASH1 抗体ABclonalA15248
抗-β-actin 抗体Abcamab6276
HRP 标记山羊抗兔/抗小鼠二抗BeyotimeA0208
ImageJ 软件NIH（公共领域）ImageJ
PKH67 绿色荧光细胞连接试剂盒（含稀释液 C）Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN10711454001
DAPIBeyotimeC1002
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）LeicaLeica TCS SP8
人 IL-6 Quantikine ELISA 试剂盒R&D SystemsD6050B
人 IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISAR&D SystemsDY201
人 TNF-α Quantikine ELISA 试剂盒R&D SystemsDTA00D
酶标仪Thermo ScientificMultiskan FC
原位细胞死亡检测试剂盒（TUNEL 检测试剂盒）Roche11684795910
Triton X-100BeyotimeP0096
多聚甲醛（4%）BeyotimeP0099
荧光显微镜OlympusBX53
冷冻离心机（12,000 × g 容量）EppendorfEppendorf 5430 R
超速离心机（120,000 × g 容量）Beckman CoulterOptima MAX-XP
R 软件R 基金会v4.2.1
GraphPad PrismGraphPad 软件v10.0
Seurat（R 程序包）Satija 实验室（开源）v4.0.4
Harmony（R 程序包，批次校正）开源v1.2.0
Scrublet（Python 程序包，双细胞检测）开源v0.2.3
clustree（R 程序包）开源v0.5.1
glmnet（R 程序包，LASSO）开源v4.1.8
e1071（R 程序包，SVM-RFE）开源v1.7-14
xgboost（R 程序包）开源v1.7.7.1
randomForest（R 程序包，Boruta）开源v4.7-1.1
基因表达综合数据库（GEO）NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
STRING 数据库string-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
Cytoscape 软件Cytoscape 联盟v3.10.4
ggplot2（R 程序包）开源v3.5.1
limma（R 程序包）开源v3.58.1
pheatmap（R 程序包）开源v1.0.12
ClusterProfiler（R 程序包）开源v4.8.3
DOSE（R 程序包）开源v3.28.2
ggpubr（R 程序包）开源v0.6.0

参考文献

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